專(zhuān)利名稱(chēng)：熊竹素在制備抑制血管異常新生藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物藥用成分和抑制血管新生化合物領(lǐng)域，特別是涉及熊竹素在制備抑制血管異常新生藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生是體內(nèi)一個(gè)重要的生理和病理過(guò)程，正常情況下，其促進(jìn)和抑制處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，只發(fā)生在胚胎形成、傷口愈合以及婦女生理周期等幾個(gè)過(guò)程。然而，一旦這種平衡被打破，就會(huì)伴隨很多疾病的出現(xiàn)以及免疫系統(tǒng)的紊亂。尤其是當(dāng)體內(nèi)存在的血管新生促進(jìn)因子超過(guò)了血管新生抑制因子，平衡就會(huì)偏向于新血管的生成，從而可能導(dǎo)致癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性失明、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等嚴(yán)重疾病的發(fā)生。目前已上市的和正在進(jìn)行1-1V期臨床的血管新生抑制劑主要是抗體藥物，抗體雖然具有定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但是必須采用靜脈注射的方式給藥，相比之下作為口服的低分子藥物理所當(dāng)然地應(yīng)受到醫(yī)療一線(xiàn)的歡迎。因?yàn)榈头肿踊衔锏纳a(chǎn)成本低，而且可以減輕患者和政府的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。另外，由于慢性疾病所呈現(xiàn)的多重特征，近年來(lái)，基于基因組學(xué)的方法，通過(guò)瞄準(zhǔn)新靶標(biāo)來(lái)大量尋找和發(fā)現(xiàn)人們所期望化合物的藥物研發(fā)模式遇到了很多困難。因此，嘗試從具有多重藥效作用的天然植物或草藥中去尋找具有血管新生抑制功能的活性低分子化合物成為未來(lái)新藥研究的一個(gè)熱點(diǎn)。甘西鼠尾草przewalskii Maxim)為唇形科鼠尾草屬植物，在我國(guó)甘肅西部、四川西部、云南西北部及西藏等地分布較多，其主要成分及活性與丹參miltiorrhiza Bunge)類(lèi)似,是一種傳統(tǒng)的中藥材，雖然鼠尾草屬植物化學(xué)成分和藥理活性的研究歷史悠久，但主要仍集中在對(duì)丹參及其幾個(gè)主要代用品種的研究，尤其是對(duì)于該屬植物在血管新生方面的調(diào)控作用，除丹參外，目前尚未見(jiàn)關(guān)于其他品種的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明中所述熊竹素為從甘西鼠尾草中分離得到的黃酮類(lèi)化合物，其具有抗氧化、抗菌和抗炎的藥理活性，目前尚未見(jiàn)報(bào)道該化合物可作為血管新生抑制劑具有抑制血管新生的活性。熊竹素化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下:
廣丫0H
Η3。0 丫、
I I 0CH
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種熊竹素的新醫(yī)藥用途，即熊竹素在制備抑制血管異常新生藥物中的應(yīng)用，其作為抑制血管異常新生藥物的主要活性成分制成藥物，作為血管新生抑制劑來(lái)治療因血管異常新生所導(dǎo)致的相關(guān)疾病。本發(fā)明所述應(yīng)用中還可以加入一種或多種藥物上可接受的輔料，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的填充劑、稀釋劑、粘合劑、賦形劑、吸收促進(jìn)劑、填充劑、表面活性劑和穩(wěn)定劑等，必要時(shí)還可加入香味劑、色素和甜味劑等。本發(fā)明所述應(yīng)用除制成膠囊外，還可以制成丸齊IJ、粉劑、片齊IJ、粒劑、口服液和注射液等多種形式。本發(fā)明所述的熊竹素從天然植物甘西鼠尾草中分離獲得，實(shí)驗(yàn)采用溶劑超聲提取、反復(fù)硅膠柱層析、過(guò)濾、重結(jié)晶等方法制備得到熊竹素單體，實(shí)驗(yàn)所用試劑為石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、正相硅膠。實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡(jiǎn)單、效率高。其結(jié)構(gòu)通過(guò)1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)來(lái)確定。本發(fā)明利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)熊竹素在體外對(duì)血管新生的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熊竹素濃度在2.5,5.0、10 mg/L時(shí)能夠有效的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖，從而起到抑制血管新生的作用。本發(fā)明利用雞胚尿囊膜作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行抑制血管新生的活性測(cè)試，通過(guò)雞胚尿囊膜上血管的生長(zhǎng)情況，來(lái)測(cè)試熊竹素對(duì)血管新生的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熊竹素能夠有效的抑制雞胚尿囊膜血管的生長(zhǎng)，其中在給藥濃度為10.0、15.0 mg/L時(shí)，顯示出較強(qiáng)的血管新生抑制活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:熊竹素對(duì)血管的異常新生具有較強(qiáng)的抑制作用，所以其可以作為制備血管新生抑制劑的有效成分，用于治療由血管新生引發(fā)的癌癥及相關(guān)疾病。


圖1是本發(fā)明從甘西鼠尾草中分離得到熊竹素的工藝流程示意 圖2是本發(fā)明中不同 給藥濃度的熊竹素作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)后MTT試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果示意 圖3是本發(fā)明中不同濃度熊竹素對(duì)HUVEC細(xì)胞株增殖影響的抑制率結(jié)果比較示意圖； 圖4是本發(fā)明中熊竹素作用于雞胚尿囊膜，抑制血管新生的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本示意 圖5是本發(fā)明中熊竹素作用于雞胚尿囊膜，對(duì)雞胚尿囊膜血管新生抑制作用的結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng) Image Pro Plus (IPP, version5.1, Media Cybernetics)圖像分析軟件處理后血管面積比較柱狀示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但在本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1:熊竹素的制備(下述實(shí)施例中使用的熊竹素是采用如下方法制備得到的)
實(shí)驗(yàn)采用干燥甘西鼠尾草(全草)7.3 kg，粉碎過(guò)60目篩，用100%丙酮(每次20 L)室溫下超聲提取5次，提取液減壓濃縮得粗浸膏300 g ;將所得到的粗浸膏上正相硅膠柱(8(Γ100目，青島海洋化工)(干法上樣)，依次用純石油醚、石油醚-乙酸乙酯混合液(石油醚:乙酸乙酯為9:1、3:1、1:1、3:7)洗脫，收集各部分洗脫液，減壓濃縮，用11(:進(jìn)行檢測(cè)，將成分大致相同的餾分進(jìn)行合并；對(duì)石油醚:乙酸乙酯=1:1洗脫液洗脫部分(52 g)進(jìn)行分離，分離方法為正相硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯混合液(5:1、2:1、1:1、1:2)進(jìn)行洗脫，在石油醚:乙酸乙酯為1:2的洗脫餾分中析出黃色顆粒狀物質(zhì)，吸除母液，然后對(duì)黃色顆粒狀物質(zhì)進(jìn)行重結(jié)晶，即得到熊竹素26 mg (見(jiàn)圖1)，該化合物經(jīng)核磁共振檢測(cè)得到的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與陳艷華在《廣東紫珠地上部分的化學(xué)成分》一文中所述熊竹素(kumatakenin)的 1H-NMR 和 13C-NMR 數(shù)據(jù)基本一致，1H-NMR 和 13C-NMR 數(shù)據(jù)如下:
1H-NMR (400 MHz, C5D5N) δ: 12.70 (1Η, s, 5—OH)，8.03 (2H, d, / = 8.5 Hz,H-2' ，6丨)，7.00 (2H, d, / = 8.5 Hz, H—3' ，5' )，6.45 (1H, d, / = 2.0 Hz,H-8), 6.36 (1H, d, / = 2.0 Hz, H—6)，3.94 (3H, s, 7- OMe), 3.88 (3H, s, 3-0Me)；13C-NMR (100 MHz, C5D5N) δ: 182.9 (C_4)，164.6 (C_7)，162.8 (C_9)，159.1(C-2), 153.5 (C-5), 153.3 (C—4' )，132.9 (C_3)，128.7 (C~2r ，6' )，121.9(C-Γ )，116.7 (C-3/ ，5' )， 106.1 (C-1O), 103.5 (C_6)，91.3 (C_8)，60.3(3-0Me)，56.1 (7-0Me)。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)，確定該化合物即為熊竹素。實(shí)施例2:熊竹素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的影響實(shí)驗(yàn)(MTT)
將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，將其按照每孔3000個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔板中，在上述條件下再培養(yǎng)24小時(shí)后，將熊竹素制成0.1、
0.5,1.0,2.5,5.0,10.0 mg/L的不同濃度藥液，并加至96孔板中，在37°C，5% CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，加入MTT (3-(4, 5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽)每孔20μ L繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μ L DMSO,震蕩I h，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)吸光度OD值(見(jiàn)圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，當(dāng)熊竹素濃度為2.5 mg/L時(shí)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖活性明顯下降，抑制率 明顯上升(抑制率=1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值)。實(shí)施例3:熊竹素對(duì)雞胚尿囊膜血管新生抑制作用實(shí)驗(yàn)
取新鮮種雞蛋在溫度為37.8°C, CO2濃度為5%，濕度適宜的條件下孵育7天，在氣室端開(kāi)窗(IX I cm)，用直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙片作為給藥載體，放置于尿囊膜上，按照5.0、10.0,15.0 mg/L的不同濃度給藥組給藥，設(shè)置空白組(生理鹽水組)和陽(yáng)性對(duì)照藥組(地塞米松組)，用無(wú)菌透明膠帶封窗，在上述條件下繼續(xù)孵育，48 h后，向給藥部位滴加固定液(甲醇:丙酮=1:1)對(duì)血管做固定處理15 min后，取下尿囊膜組織，對(duì)尿囊膜組織表面血管用數(shù)碼相機(jī)微距拍照，用 Image Pro Plus (IPP, version5.1, Media Cybernetics)圖像分析軟件對(duì)圖片中血管面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示熊竹素10.0,15.0 mg/L可以顯著抑制血管新生(見(jiàn)圖4-5)。從圖4原始標(biāo)本的照片中可以明顯看出，當(dāng)熊竹素的給藥濃度為10.0,15.0 mg/L時(shí)，血管生長(zhǎng)明顯受到抑制；
圖5為不同濃度的熊竹素作用于雞胚尿囊膜后，雞胚尿囊膜給藥區(qū)域血管面積的柱狀圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)給藥濃度為10.0、15.0 mg/L，血管面積較生理鹽水組明顯降低，顯示出對(duì)血管新生的抑制作用。
權(quán)利要求
1.熊竹 素在制備抑制血管異常新生藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黃酮類(lèi)化合物熊竹素在制備抑制血管異常新生藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明將熊竹素作為一種血管新生抑制劑，因此可將熊竹素用于治療由體內(nèi)血管異常新生而引起的癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性失明、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述熊竹素對(duì)血管的異常生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。因此本發(fā)明所述熊竹素可用于制備抑制血管新生的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/352GK103239438SQ20131018720
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月20日
發(fā)明者李寶才, 朱路平, 莊文婷, 李鵬, 向誠(chéng), 何靜, 秦誼, 張敉, 戴偉鋒 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)