一種藍(lán)耳病亞單位疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藍(lán)耳病亞單位疫苗的制備。所述疫苗含有豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒PRRSVGP5蛋白二聯(lián)體以及純化標(biāo)簽。本疫苗生產(chǎn)制備工藝穩(wěn)定，適合大規(guī)模生產(chǎn)。靶動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的重組亞單位疫苗能夠誘導(dǎo)有效的體液免疫。
【專利說明】一種藍(lán)耳病亞單位疫苗的制備

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種豬藍(lán)耳病亞單位疫苗制備與應(yīng) 用。具體地，利用基因重組技術(shù)，將主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5串聯(lián)，并克隆入載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng) 過發(fā)酵，純化、乳化工藝制備，得到重組藍(lán)耳病亞單位疫苗以及該疫苗在預(yù)防重大動(dòng)物疾病 豬藍(lán)耳病中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（porcinere productive and respiratory syndrome， PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcinere productive and respiratory syndrome virUS，PRRSV)引起的豬病毒性疾病，以妊娠母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病及免疫抑制 和持續(xù)性感染為特征，是近年來引起世界養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要疾病之一（Terpstra et al. 1991)?，F(xiàn)在PRRSV幾乎在所有的養(yǎng)豬國家都流行（Bilodeau et al，1991 ;Wensvoort et al，1991 ;Albina et al，1997)。目前針對(duì)該病的防控，疫苗免疫仍然是一個(gè)主要的途徑 之一（梁皓儀，2008)。
[0003] PRRSV基因組大小為15kb左右，含有8個(gè)開放閱讀框架（ORFs)，其5'末端有帽子 結(jié)構(gòu)，3'末端有一個(gè)Poly (A)尾巴。GP5(E蛋白）具有中和表位，為病毒的主要免疫保護(hù)型 抗原；PRRSV與EAV同為馬動(dòng)脈炎病毒科成員，GP5的生物學(xué)功能非常重要，主要在病毒感 染、細(xì)胞結(jié)合及病毒吸附中起作用，也是淋巴細(xì)胞增生性應(yīng)答的靶點(diǎn)。
[0004] GP5蛋白是PRRSV病毒的主要囊膜糖蛋白，是病毒的重要的中和抗原（Pirzadeh et al.，1998;Gonin et al.，1999)，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫，另外，針對(duì) GP5蛋白的單克隆抗體也被證實(shí)具有病毒中和活性。GP5有6個(gè)抗原決定簇，3個(gè)B細(xì)胞表 位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體（Plagemann，2004)，是PRRSV所有結(jié)構(gòu)蛋白中產(chǎn)生中和抗體 最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白，GP5誘導(dǎo)產(chǎn)生的中淚！抗體效價(jià)與對(duì)病毒的保護(hù)是呈顯著的相關(guān)性；GP5 的另一重要作用是可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Fernidez et al.，2002)。用表達(dá)GP5的基因工程疫苗 免疫豬，可以產(chǎn)生針對(duì) PRRSV 的中和抗體（Pirzadeh and Dea，1997 ;Zhanget al·，1998)， 而且免疫豬攻毒后可以得到有效的保護(hù)，比如緩解病毒血癥和減輕肺部損傷（Pirzadeh et al，1998;Xue et al.，2004;Qiu et al.，2005)。有研究人員對(duì) 6 株"高熱綜合病"RRSV 變 異株的GP5的同源性進(jìn)行對(duì)比，表明同源性較高，均位于同一個(gè)獨(dú)立的分支中?，F(xiàn)行疫苗株 RespPRRS/Repro MLV，PrimePac，IngeIvacATP和CH-Ia分別位于不同的分支中。在高致病 性藍(lán)耳病的GP5中，中和表位的抗體結(jié)合位點(diǎn)的39位氨基酸發(fā)生了比較一致的突變。且在 9,16, 35, 39, 58,94及185為氨基酸發(fā)生了比較一致的突變，與先前的疫苗株和國內(nèi)流行株 有明顯的差異。所有高致病性PRRS分離株的13位和151位的氨基酸都為R，表現(xiàn)為強(qiáng)毒類 型（Ansari IH，2006)。GP5蛋白含有多個(gè)中和表位，用重組GP5蛋白制備的單克隆抗體具 有中和活性，病毒中和作用與抗GP5抗體效價(jià)呈顯著相關(guān)性。針對(duì)GP5的單克隆抗體的中 和活性比針對(duì)其它蛋白如GP4蛋白的單克隆抗體更強(qiáng)。研究表明，GP5蛋白至少包含兩種 類型的中和抗原決定簇，一些為線性決定簇，可以與大腸桿菌表達(dá)的重組GP5蛋白反應(yīng)，還 有一些為構(gòu)象依賴性決定簇（Kreutz LC，1997 ;Pirzadeh B，1998 ;Weiland E，1999 ;Zhang Y，1998)。
[0005] 應(yīng)用缺失突變的方法證明GP5至少含有兩個(gè)重要的抗原相關(guān)區(qū)域，分別位于胞外 域的aa27?41和C-端的aal80?197。然而，對(duì)病毒蛋白和大腸桿菌表達(dá)的重組GP5蛋 白反應(yīng)陽性的豬血清卻不與C-末端缺失50個(gè)氨基酸殘基的GP5蛋白反應(yīng)，說明C-末端 是是一個(gè)重要的抗原決定簇和/或在維持蛋白構(gòu)象中發(fā)揮重要作用。推測GP5蛋白含有 一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，包括蛋白的大約前40個(gè)氨基酸（Rowland RR，1999)。在胞外結(jié)構(gòu)域的中 間已經(jīng)鑒定出一個(gè)主要的中和表位（B epitope,aa37_45)和一個(gè)非中和表位（A epitope, aa27-35)。GP5蛋白在N-末端有一個(gè)高度疏水的區(qū)域，作為該蛋白的前導(dǎo)區(qū)。GP5蛋白中還 包含有許多跨膜疏水區(qū)，這些區(qū)域可以使翻譯的GP5蛋白停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)內(nèi)，從而抑制 GP5蛋白的表達(dá)?，F(xiàn)在已經(jīng)得到證實(shí)在14-31和64-134處有兩個(gè)主要的跨膜區(qū)域（Osrowski M，2002 ;Wissink EH，2003 ;)。
[0006] PRRS滅活疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危險(xiǎn)，便于貯存和 運(yùn)輸、對(duì)母源抗體的干擾作用不敏感等優(yōu)點(diǎn)，因此人們首選滅活疫苗來預(yù)防和控制PRRS。國 內(nèi)分離的PRRSV CH-Ia株制成油佐劑滅活疫苗，該毒株是經(jīng)Marc-145細(xì)胞系傳代、多次克 隆純化，篩選出嗜Marc-145細(xì)胞生長的PRRSV毒株，該毒株的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)化學(xué)試劑滅活 后，配以醫(yī)用油佐劑，制成了繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（郭寶清等，2000)，已成為國內(nèi)首 批商品化的PRRS疫苗，并對(duì)3月齡仔豬間隔20d進(jìn)行了 2次免疫，結(jié)果在首次免疫后Sd就 可檢測到病毒特異性抗體，28d達(dá)到高峰，在首免后56d還可檢測到抗體。
[0007] PRRS弱毒疫苗具有免疫力強(qiáng)、免疫期長等優(yōu)點(diǎn)。在美國，Boehringer Ingleheitm 公司NOBL實(shí)驗(yàn)室于1995年首次推出商品化減毒疫苗Resp PRRSVTM，已獲準(zhǔn)用于3?18周 齡仔豬的預(yù)防接種。但禁用于PRRS陰性豬群、妊娠母豬和育齡公豬。弱毒苗使用后可產(chǎn)生 一定的保護(hù)作用（Sipos et al.，2003)。何信群等（2003)制備了 PRRSV減毒活疫苗并進(jìn)行 了豬體試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫后20~35d左右出現(xiàn)抗體高峰，并可持續(xù)3個(gè)月以上，有較長的 免疫保護(hù)期，免疫后第Hd即可檢測出PRRSV中和抗體。Mavromatis等（1999)證實(shí)活疫苗 可保護(hù)育肥豬抵抗PRRSv引起的呼吸道癥狀。但是弱毒苗的不安全性，尤其毒力返強(qiáng)的可 能性成為人們關(guān)心的一個(gè)主要問題。弱毒疫苗在提供免疫保護(hù)的同時(shí)，還會(huì)持續(xù)散播疫苗 病毒，使得病毒在豬場中循環(huán)存在，有時(shí)甚至引發(fā)PRRS的暴發(fā)。實(shí)驗(yàn)證明，PRRSV感染誘導(dǎo) B細(xì)胞的增生的同時(shí)，也導(dǎo)致這些豬免疫損傷（Ansari I H etal，2006;Wissink EH etal， 2004)。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明根據(jù)不同結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中的作用，選擇主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5作為疫苗 框架結(jié)構(gòu)，兩個(gè)GP5串聯(lián)后經(jīng)過發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的重組藍(lán) 耳病亞單位疫苗。利用本發(fā)明制備的疫苗可以有效預(yù)防豬藍(lán)耳病的感染。
[0010] 本發(fā)明的目的之一在于提供了一種新的能用于預(yù)防藍(lán)耳病的亞單位疫苗多肽及 其疫苗組合物。
[0011] 本發(fā)明的目的之二在于提供了所述亞單位疫苗的構(gòu)建及獲得方法。
[0012] 本發(fā)明的目的之三在于提供了能夠表達(dá)所述藍(lán)耳病亞單位疫苗的基因工程菌株。
[0013] 本發(fā)明的目的之四在于提供了所述藍(lán)耳病亞單位疫苗的制備方法。
[0014] 本發(fā)明的目的之五在于提供了所述亞單位疫苗在預(yù)防藍(lán)耳病中的用途。
[0015] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防藍(lán)耳病的亞單位疫苗多肽及其組合物。 其含有主要的結(jié)構(gòu)蛋白GP5二聯(lián)體。所述的亞單位疫苗蛋白或多肽或藥學(xué)上可接受的鹽以 及表達(dá)抗原表位蛋白所需要的載體。載體也可以包括單獨(dú)編碼各抗原表位的序列，串聯(lián)可 以通過遺傳工程方法進(jìn)行。所述疫苗也包括非免疫活性物質(zhì)，即為各多肽的連接部分，不具 有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐劑活性，主要有純化標(biāo)簽、接頭肽、化學(xué)修飾部分、 N端信號(hào)肽和C端多聚腺苷酸等。所述藥學(xué)上可接受的鹽是指無毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)，適 用于人或動(dòng)物組織的鹽。非活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0016] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種核苷酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面所述的藍(lán)耳 病亞單位疫苗多肽。本發(fā)明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通過人工合成方式合成多 抗原表位串聯(lián)序列和分子佐劑序列，然后經(jīng)過基因工程操作連接后克隆入載體，轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌，篩選、發(fā)酵、純化后獲得藍(lán)耳病亞單位疫苗多肽。在本發(fā)明中可以對(duì)該核酸進(jìn)行常 規(guī)的分子生物學(xué)操作，如：PCR、限制性內(nèi)切酶酶切，連接等，核酸設(shè)計(jì)5'端和3'端均加入酶 切位點(diǎn)。優(yōu)選本發(fā)明中的核苷酸序列如下 ：
[0017] TTGGGGAAATGCTTGACCGCGGGCTGTTGCTCGCAATTGTTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTCTTGT TTTGTTGCGCTCGTCAGCGCCAACAGCAACAGCAGCTCAAATTTACAGCTGATTTACAACTTGACGCTATGTGAGCT GAATGGCACAGATTGGCTAGCTAATAAATTTGACTGGGCAGTGGAGTGTTTTGTCATTTTTCCTGTGTTGACTCACA TTGTCTCTTATGGTGCCCTCACTACTAGCCATTTCCTTGACACAGTCGGTCTGGTCACTGTGTCTACCGCCGGATTT GTTCACGGGCGGTATGTTCTGAGTAGCATCTACGCGGTCTGTGCCCTGGCTGCGTTGATTTGCTTCGTCATTAGGCT TGCGAAGAATTGCATGTCCTGGCGCTACTCATGTACCAGATATACCAACTTTCTTCTGGACAGTAAGGGCAGACTCT ATCGTTGGCGGTCGCCTGTCATCATAGAGAAAAGGGGCAAAGTTGAGGTCGAAGGTCAACTGATCGACCTCAAAAGA GTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTGTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCCTTTGGGGAAATG CTTGACCGCGGGCTGTTGCTCGCAATTGTTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTCTTGTTTTGTTGCGCTCGTCAGCG CCAACAGCAACAGCAGCTCAAATTTACAGCTGATTTACAACTTGACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTA GCTAATAAATTTGACTGGGCAGTGGAGTGTTTTGTCATTTTTCCTGTGTTGACTCACATTGTCTCTTATGGTGCCCT CACTACTAGCCATTTCCTTGACACAGTCGGTCTGGTCACTGTGTCTACCGCCGGATTTGTTCACGGGCGGTATGTTC TGAGTAGCATCTACGCGGTCTGTGCCCTGGCTGCGTTGATTTGCTTCGTCATTAGGCTTGCGAAGAATTGCATGTCC TGGCGCTACTCATGTACCAGATATACCAACTTTCTTCTGGACAGTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCTGT CATCATAGAGAAAAGGGGCAAAGTTGAGGTCGAAGGTCAACTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCG CGGCAACCCCTGTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCCT
[0018] 在第三方面，本發(fā)明提供了一種載體，其除了含有本發(fā)明第二方面所述的編碼藍(lán) 耳病亞單位疫苗核苷酸分子，還含有與該核苷酸序列可操作的連接，在原核細(xì)胞表達(dá)（轉(zhuǎn) 錄和翻譯）所需的表達(dá)控制元件。最基本的表達(dá)控制元件包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng) 子，選擇性標(biāo)記等，這些調(diào)控元件為本領(lǐng)域所熟知。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為 大腸桿菌表達(dá)載體。
[0019] 在第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的載體。宿 主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含有本發(fā)明所述編碼蛋白的基因序列，而后經(jīng)檢測具有良好的的遺傳 和表達(dá)穩(wěn)定性后，可用于發(fā)酵表達(dá)生產(chǎn)所需的藍(lán)耳病亞單位疫苗多肽。
[0020] 在第五方面，本發(fā)明提供了一種藍(lán)耳病亞單位疫苗的制備方法，其包括以下步驟： 工程菌發(fā)酵表達(dá)亞單位疫苗多肽，經(jīng)過粗純化與精細(xì)純化工藝以及后續(xù)乳化工藝，獲得所 需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌體破碎、包涵體洗滌、離心、變性、親和層 析、疏水層析、陰離子交換色譜、反相色譜、復(fù)性、乳化等。本發(fā)明中涉及的制備方法為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知。
[0021] 在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防豬藍(lán)耳病的重組亞單位疫苗，其包括本 發(fā)明第一方面所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。所述亞單位疫苗能夠預(yù)防豬藍(lán)耳病的 爆發(fā)。本發(fā)明所述的藥學(xué)上可接受的載體為免疫增強(qiáng)劑或免疫佐劑，優(yōu)選免疫佐劑為進(jìn)口 白油佐劑。
[0022] 在第七方面，本發(fā)明提供了第六方面所述的重組藍(lán)耳病亞單位疫苗的應(yīng)用。疫苗 可以一定有效劑量肌肉注射，皮內(nèi)或皮下注射或鼻內(nèi)接種注射動(dòng)物，能夠表達(dá)足夠量的IFN 提供抗病毒活性，保護(hù)動(dòng)物免于藍(lán)耳病流行毒株的攻擊。此外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通 過對(duì)疫苗進(jìn)行靶動(dòng)物攻毒對(duì)比試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室安全性試驗(yàn)等，表明本發(fā)明所述的重組藍(lán)耳病 亞單位疫苗是安全的（見實(shí)施例四），能夠保護(hù)動(dòng)物免受藍(lán)耳病病毒感染（見實(shí)施例五）。
[0023] 另外，需要指出的是，在本申請(qǐng)的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其他具有 實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)的方面對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人來說是顯而易見的。此外，本發(fā)明亦使用了公開 文獻(xiàn)，他們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的 本發(fā)明范圍。
[0025] 圖1重組藍(lán)耳病亞單位表達(dá)載體pRSETB-PRRSVGP52構(gòu)建圖；
[0026] 圖2pRSETB-PRRSVGP52載體質(zhì)粒酶切圖，其中泳道1為DNAmarker，從上至下分子 量依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，泳道2為陰性對(duì)照，泳道3為質(zhì)粒沒切圖；
[0027] 圖3SDS-PAGE檢測圖，其中泳道1、4為未誘導(dǎo)陰性對(duì)照，泳道2為純化目的蛋 白（箭頭所指），泳道3為蛋白marker，從上至下依次為97. 2KD、66. 4KD、44. 3KD、29. 0KD、 20. 1KD、14. 3KD，泳道5、6為菌體誘導(dǎo)；
[0028] 圖4Westernblot檢測圖，其中泳道1為預(yù)染marker,從上至下依次為97. 2KD、 66. 4KD、44. 3KD、29. 0KD、20. 1KD、14. 3KD，泳道2為陰性對(duì)照，泳道3為目的蛋白（箭頭所 指）。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例中所述的具體試驗(yàn)方法描述僅是示例性描述，用于詳細(xì)闡述本發(fā)明，但并 不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制，依據(jù)本發(fā)明的許多變化為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
[0030] 實(shí)施例一大腸桿菌表達(dá)載體與表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0031] 將設(shè)計(jì)好的多肽編碼核苷酸送上海英俊生物技術(shù)公司合成，核苷酸片段兩端分別 設(shè)計(jì)了 BamH 1(5'端）和HindIII(3'端）限制性酶切位點(diǎn)，把這片段合成后分別克隆到 PMD18T載體上，序列測定證實(shí)插入基因片段與設(shè)計(jì)序列一致（見序列表）。將重組質(zhì)粒分 別命名為PMD18T-PRRSVGP52。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將兩種質(zhì)粒進(jìn)行酶切處理，大腸桿菌 表達(dá)載體選用Invitrogen公司的pRSETB質(zhì)粒，也使用相同的限制性內(nèi)切酶處理，酶切條 件：1〇μ 1反應(yīng)體系,體系內(nèi)加入2μ 1質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶為5個(gè)活性單位（New England biolabs)，加入IOX緩沖液1μ 1，去離子水補(bǔ)齊，37°C酶切I. 5小時(shí)。酶切結(jié)束后加入1μ I 200mM EDTA終止反應(yīng)。在1%瓊脂糖凝膠電泳中，電泳30分鐘。紫外燈下將2. 9kb pRSETB質(zhì) 粒和1194bpPRRSVGP52片段切下，按照Qiagen公司凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。按 照載體：片段1 : 2-3的比例將多表位核苷酸片段單獨(dú)和表達(dá)載體混合，反應(yīng)體系15 μ 1， 由T4DNA連接酶進(jìn)行連接，16°C連接過夜，獲得重組質(zhì)粒分別命名為pRSETB-PRRSVGP52， (見圖1)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS。
[0032] 轉(zhuǎn)化：將pRSETB-PRRSVGP52置冰上融化，加入2 μ 1鏈接反應(yīng)液，再次混勻，冰水浴 30分鐘，42°C 30秒，然后迅速放回冰浴1. 5分鐘，加入Iml LB培養(yǎng)液，37°C，靜置培養(yǎng)1小 時(shí)，4000g低溫離心10秒鐘棄上清，用200 μ ILB培養(yǎng)基重懸菌體；將菌液均勻涂布于含有 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，倒置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)，直至克 隆形成。
[0033] 鑒定：挑取平板上的單克隆至LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取 質(zhì)粒，分別使用內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，可以切出相應(yīng)藍(lán)耳病疫苗基因大小片 段的克隆，1200bp，可初步確定為陽性克?。ㄒ妶D2);陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定進(jìn)一步驗(yàn) 證其正確性（見序列表）。
[0034] 誘導(dǎo)表達(dá)。即將陽性克隆過夜培養(yǎng)，次日早上按1 : 100轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)3小時(shí)后， 加入0. 5mMIPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，制備樣品；常規(guī)SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況-- 在49KD(見圖3)，見到特異性條帶為正確克隆；取正確克隆，放大培養(yǎng)，SDS-PAGE證實(shí) 表達(dá)正確后，使用常規(guī)Western-blot進(jìn)一步證實(shí)其表達(dá)準(zhǔn)確性（見圖4);經(jīng)過上述構(gòu) 建及鑒定程序后，可將挑選的陽性克隆作為工程菌進(jìn)行原始種子庫的建立，菌種命名 PRSETB-PRRSVGP52/BL21(DE3, Plys)〇
[0035] 實(shí)施例三工程菌的發(fā)酵、純化與乳化
[0036] 發(fā)酵取生產(chǎn)菌種，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基中（含100 μ g/ml氨芐青霉素）， 37°C，180rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)活化菌種。再以1 : 100的接種量接入搖瓶，37°C振蕩培養(yǎng) 至0D600 = 3,可按10%比例接種入發(fā)酵罐。發(fā)酵用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，用蒸餾水配制， 其中不含有任何抗生素。校正溶氧和PH值電極，開啟罐體攪拌，轉(zhuǎn)數(shù)為300rpm，罐體在線滅 菌，待罐內(nèi)培養(yǎng)液溫度降至37. (TC時(shí)，標(biāo)定pH及溶氧（OD)零點(diǎn)。發(fā)酵溫度為37. 0±0. 1°C， 溶氧控制在20 %左右，pH控制在7.0,接種后培養(yǎng)菌體0D600 = 1.0?1.2時(shí)流加補(bǔ)料 500ml，補(bǔ)料后1小時(shí)加入IPTG (終濃度為0. 5mM)誘導(dǎo)表達(dá)，連續(xù)誘導(dǎo)6個(gè)小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束， 取樣做SDS-PAGE檢定表達(dá)情況。
[0037] 純化將收集到的菌體，用包含體洗液1(1% Triton X-100,20mM Tris-cl PH8.0) 混懸后進(jìn)行超聲，2000W超聲裂解1小時(shí)。4°C，12000rpm離心收集包含體，并用包含體洗液 11(1% D0C，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混懸二次超聲洗滌包含體，二次低溫離心收集包 含體。包含體沉淀用8M尿素，0. 3% β -ME，20mM Tris-cl (pH = 8. 00)混勻，室溫?cái)嚢?小 時(shí)，8000rpm低溫離心30min，棄去沉淀。變性蛋白1 : 100稀釋，復(fù)性液用Tris(PH8.0)緩 沖體系，加入0. 3M精氨酸，4°C攪拌復(fù)性24小時(shí)。復(fù)性液用pH = 8. 0的20mM磷酸緩沖液， 0. 5M氯化鈉，20mM咪唑，平衡上親和層析柱，用pH = 8. 0的20mM磷酸緩沖液，0. 5M氯化鈉， 0.5M咪唑洗脫；即得重組藍(lán)耳病亞單位疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及Western blot 印記檢定純化產(chǎn)物是否為目標(biāo)蛋白（圖4)。
[0038] 乳化將純化的半成品用滅菌的PBS稀釋至200yg/ml。取進(jìn)口白礦物油佐劑 DU0PRME (醫(yī)藥級(jí)）經(jīng)121 °C，滅菌15分鐘，備用。按油相：水相=50 : 50的比例配制， 先將油相加入乳化缸內(nèi)，開動(dòng)攪拌機(jī)以80-100r/min的速度緩慢攪拌，緩緩加入水相，加完 后再攪拌2min，然后以5500r/min高速循環(huán)乳化9min，制成油包水單相疫苗。
[0039] 實(shí)施例四重組藍(lán)耳病亞單位疫苗安全性試驗(yàn) [0040] 疫苗對(duì)小白鼠的安全性
[0041] 皮下注射18-22g Balb/C小白鼠，每只注射0. 5ml，每批疫苗注射5只，共三個(gè)批 次，注射15只小白鼠，同時(shí)設(shè)定2只陰性對(duì)照，連續(xù)觀察10天，觀測小白鼠的健康狀況。 [0042] 疫苗對(duì)仔豬的安全性
[0043] 選擇30日齡健康三元雜交仔豬，每頭耳后肌肉注射重組藍(lán)耳病亞單位疫苗，每批 次5頭，共三個(gè)批次，注射15頭仔豬，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照2頭，每頭注射生理鹽水白油乳化 液2ml，臨床觀察10天。
[0044] 結(jié)果
[0045] 疫苗對(duì)小白鼠的安全性試驗(yàn)
[0046] 結(jié)果如表1，20110903免疫組2只受試動(dòng)物第二天體溫略有升高，第三天恢復(fù)正 常，食欲和健康狀況無異常，與對(duì)照組一致，無死亡發(fā)生，可見重組藍(lán)耳病亞單位疫苗對(duì)小 白鼠是安全的，見表1。
[0047] 表1疫苗對(duì)小白鼠的安全性試驗(yàn)結(jié)果
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于豬藍(lán)耳病的重組亞單位疫苗蛋白。
2. -種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述疫苗蛋白序列。
3. -種載體，其含有權(quán)利要求2所述的核酸分子。
4. 一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的載體。
5. 權(quán)利要求1所述的疫苗蛋白，其具體核酸序列組合為：SEQ ID No. 1。
6. 權(quán)利要求1所述的疫苗蛋白，其具體氨基酸序列組合為：SEQ ID No. 2
7. -種用于預(yù)防豬藍(lán)耳病的疫苗，其包括權(quán)利要求6所述的融合蛋白以及藥學(xué)上可接 受的載體。
【文檔編號(hào)】A61K39/12GK104211783SQ201310190308
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】李殿明, 蒲勤, 李毅, 齊春梅, 田春輝, 任百亮, 張導(dǎo)春, 劉甜甜, 顧富香 申請(qǐng)人:青島紅橋明勤生物科技有限公司