專利名稱：白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體是指使用白介素2，白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞(NK)和CD8淋巴細(xì)胞。
背景技術(shù)：
以前的研究表明白介素2和白介素15參與了 NK細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和CD8細(xì)胞的先天免疫力和后天獲得應(yīng)性免疫力的激活過程。然而，以往用白介素15或白介素2在體外和體內(nèi)擴(kuò)增這些細(xì)胞的效果十分有限。白介素15和白介素2通過與⑶8和NK淋巴細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，激活⑶8和NK細(xì)胞。白介素2，白介素15和白介素15受體在激活的樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞中有很強(qiáng)的表達(dá)。白介素2，白介素15可以分別和白介素15受體結(jié)合形成異二聚體復(fù)合物激活⑶8和NK細(xì)胞。白介素2和白介素15的生物學(xué)作用與和白介素15受體形成異二聚體有直接的關(guān)系。白介素2，白介素15和白介素15受體形成的異二聚體復(fù)合物的生物活性大大高于白介素2和白介素15。由于白介素15生物效應(yīng)需要通過形成配體與受體復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)，因此目前尚無法充分利用白介素15在體外或體內(nèi)擴(kuò)增NK和CD8細(xì)胞來增強(qiáng)先天免疫力和后天獲得應(yīng)性免疫力。實(shí)際上，直接用白介素15受體處理NK和CD8細(xì)胞，雖然可以形成白介素15和白介素15受體異二聚體，但是此異二聚體對白介素15有拮抗作用。CN101735982A公開了一種采用白介素2和白介素15受體(IgGlFc)-白介素2復(fù)合物對淋巴細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的方法，但是其擴(kuò)增和激活效果還有待提高。而且這一發(fā)明中所采用的白介素15受體片段較長，其在實(shí)際應(yīng)用中容易出現(xiàn)蛋白變性失活、免疫刺激性較高等問題，而且在大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)時(shí)生產(chǎn)效率較 低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種有效擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的方法。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的:在本發(fā)明的第一方面，提供了一種白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物，其中所述白介素15受體片段包含SEQ ID NO:1。在本發(fā)明的復(fù)合物中，所述白介素15受體片段為SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3。在本發(fā)明的復(fù)合物中，所述白介素15受體片段與IgGlFc片段連接，所述IgGlFc片段序列與所述白介素15受體片段形成聯(lián)合蛋白后能夠激活所述白介素15受體片段，優(yōu)選地是丙種免疫球蛋白中的Fe片段，更優(yōu)選地為CD80，CD86，B7-H1，B7-H2，B7-H3和B7-H4的具有活性的片段，最優(yōu)選地為SEQ ID N0:4。在第二方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述方法包括:(I)采用pcDNA3.1質(zhì)粒為表達(dá)質(zhì)粒，以人肺癌細(xì)胞株A549為表達(dá)載體表達(dá)所述白介素15受體片段，并且所述白介素15受體片段在溶液中形成二聚體；和(2)向所述溶液中加入白介素2，形成所述復(fù)合物；其中，優(yōu)選地，以與所述白介素15受體片段的摩爾比為1.5: 1-10: I的比例更優(yōu)選地2: 1-5: 1，最優(yōu)選地3: I的比例加入白介素2;優(yōu)選地，所述白介素15受體片段與所述白介素2共同進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；優(yōu)選地所述白介素15受體片段或所述白介素2通過硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法中的一種或至少兩種的組合來純化。在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，所述溶液為進(jìn)行所述白介素15受體片段的細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)的培養(yǎng)液或緩沖鹽溶液，優(yōu)選地為磷酸鹽緩沖液。在第三方面，本發(fā)明提供了采用如第一方面所述的復(fù)合物擴(kuò)增淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括將如第一方面所述的復(fù)合物與淋巴細(xì)胞接觸，優(yōu)選地將如第一方面所述的復(fù)合物與淋巴細(xì)胞在人體內(nèi)接觸。在本發(fā)明的采用如第一方面所述的復(fù)合物擴(kuò)增淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的方法中，所述白介素15受體-白介素2復(fù)合物的劑量為0.5皮摩/升-1納摩/升，優(yōu)選地0.008納摩/升-0.75納摩/升，更優(yōu)選地0.1納摩/升-0.5納摩/升，最優(yōu)選地0.2納摩/升-0.3納摩/升。在本發(fā)明的采用如第一方面所述的復(fù)合物擴(kuò)增淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的方法中，所述的淋巴細(xì)胞或所述淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞為純化的NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞或NKT細(xì)胞中的一種或至少兩種的混合物，其中純化是指淋巴細(xì)胞代表細(xì)胞總數(shù)的50%以上。在第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的復(fù)合物在用于在受治療者中治療癌癥或傳染性疾病的藥物的制備中的應(yīng)用，其中，優(yōu)選地所述受治療者是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是人類；所述癌癥優(yōu)選地為急性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤和腎細(xì)胞惡性腫瘤中的一種或至少兩種；所述傳染性疾病優(yōu)選為細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲感染，更優(yōu)選地為乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒感染。在本發(fā)明中，所擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞包括NK細(xì)胞，⑶8細(xì)胞和NKT細(xì)胞。這些細(xì)胞有重要的醫(yī)療作用，因?yàn)樗鼈兛梢宰R(shí)別和摧毀腫瘤細(xì)胞和病原體感染的細(xì)胞，其中包括病毒感染，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒。本發(fā)明利用白介素2，白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物，擴(kuò)增淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞，包括NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞和NKT細(xì)胞。本發(fā)明利用的方法可以有效的擴(kuò)增淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞，是理想的增強(qiáng)病人免疫反應(yīng)的方法。本發(fā)明中的白介素2和白介素15受體是該蛋白質(zhì)的全部多肽，其中也包括這些蛋白質(zhì)中具備功能的多肽成分。本發(fā)明中的白介素15受體片段可以是白介素15受體片段(IgGlFc)，其是白介素15受體和免疫球蛋白Fe區(qū)域(IgGlFc)的聯(lián)合多肽，IgGlFc這一區(qū)域包括但不僅僅限于CD80，CD86，B7-H1, B7-H2, B7-H3，和B7-H4具有活性的區(qū)域?；钚詤^(qū)域是形成聯(lián)合蛋白后能夠激活白介素15受體從而激活淋巴細(xì)胞擴(kuò)增的IgGl的所有區(qū)域。

在沒有特別說明的情況下，術(shù)語“白介素15受體片段”包括“白介素15受體片段(IgGlFc)”。本發(fā)明中的淋巴細(xì)胞來自于外周血和骨髓。本發(fā)明中的淋巴細(xì)胞可以是NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞和NKT細(xì)胞；也可以是NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞和NKT細(xì)胞的不同組合；也可以是NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞，NKT細(xì)胞和別的淋巴細(xì)胞的不同組合；也可以是白介素2和白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物注射進(jìn)人體血管后所作用的血液中所有白細(xì)胞的總和。本發(fā)明中的白介素2和白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物來源于人，但不僅僅限于人，如注射或處理的對象可以是非人類哺乳動(dòng)物，如小鼠，大鼠，貓、犬、家畜、猴子等等，也可以是其它物種的白介素2，白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物。本發(fā)明提供了一個(gè)可以用來制成藥物的方案，按照這個(gè)方案制成的藥物可以有下面所描述的多種用途。這個(gè)方案包括白介素2，白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物。利用本方案擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞(包括NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞和NKT細(xì)胞)適用與需要增強(qiáng)病人免疫力的各種情景。例如，擴(kuò)增NK細(xì)胞對治療細(xì)菌，真菌或寄生蟲內(nèi)感染特別有效。例如，擴(kuò)增NK細(xì)胞對治療腫瘤特別有效，如急性髓細(xì)胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，前列腺腫瘤，惡性黑色素瘤和腎細(xì)胞惡性腫瘤，但不僅僅限于上述腫瘤。擴(kuò)增的NK和NKT細(xì)胞對治療病毒感染特別有效，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒但不僅僅限于上述病毒感染。擴(kuò)增的NK和NKT細(xì)胞可以顯著提高抗原的作用效果。除非另有說明，本發(fā)明中所有的技術(shù)和科學(xué)詞匯的含義是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士通常理解的含義。常用術(shù)語的定義在所有分子生物學(xué)書中可以找到，例如，Benjamin Lewin, Genes VIII, Oxford University Press,2004(ISBN0-13-145140-5)；本發(fā)明使用的IgGlFc是從常用的丙種免疫球蛋白(Igl)中挑選出來多肽，然而，本發(fā)明使用的IgGlFc并不局限于常用的丙種免疫球蛋白，其他類別的丙種球蛋白Fe區(qū)域的與白介素15受體形成聯(lián)合多肽的有類似功能的多肽區(qū)域也在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。為了確保長 期，高收益的生產(chǎn)重組白細(xì)胞介素(白介素2，白介素15受體片段)和其他多肽，本發(fā)明采用了蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。例如，細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄了穩(wěn)定表達(dá)白介素2多肽的表達(dá)載體，這個(gè)載體中含有病毒啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，用恰當(dāng)?shù)姆椒せ顔?dòng)子，培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間后即可以得到高水平表達(dá)的多肽。分泌到培養(yǎng)基或上清液中的多肽產(chǎn)品可以通過本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所熟悉的技術(shù)來純化和分離。這些技術(shù)包括但不限于下面所列的方法:硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素。如有必要，蛋白質(zhì)復(fù)性的方案可用來幫助純化表達(dá)的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色譜法(HPLC)可作最后的純化步驟進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。白細(xì)胞介素(白介素2，白介素15受體片段)和其他多肽也可以通過標(biāo)準(zhǔn)的操縱核苷酸編碼序列的方法來生產(chǎn)。例如，用特定的，非特定的定點(diǎn)突變或其他分子生物學(xué)技術(shù)來生產(chǎn)功能等同的，但一級(jí)結(jié)構(gòu)不相同的多肽。簡單的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修改如果不影響蛋白質(zhì)的生化特性，這些通過氨基酸保守替換產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物可以通過將白介素2與白介素15受體片段共同培養(yǎng)來獲得。將多肽溶在水溶液中，如緩沖鹽溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液。按照摩爾數(shù)1.5: I或2: I或3: 1，或更大的比例(例如，5: I甚至10: I)加入白介素2和白介素15受體片段。比例的選定以確保形成最多的復(fù)合物為目標(biāo)，本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士都可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來判斷。本發(fā)明中在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的白介素15受體片段多肽會(huì)有一部分以二聚體的形式分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。因此，可以通過在上清液中加入白介素2的方式自發(fā)形成受體-配體復(fù)合物。本發(fā)明中的白介素2和白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物可用來擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的種群。體外擴(kuò)增的細(xì)胞可移植病人。例如，白介素2和白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物按照順序依次激活特定細(xì)胞擴(kuò)增和存活，包括NK細(xì)胞，CD8和NKT細(xì)胞。白介素2和白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物按照順序激活和擴(kuò)增的細(xì)胞，包括NK細(xì)胞，CD8和NKT細(xì)胞，可以用來進(jìn)行自體移植，也可以進(jìn)行異體移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原與捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和擴(kuò)增的細(xì)胞可以通過靜脈滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些應(yīng)用中，細(xì)胞系(例如，NK細(xì)胞系，CD8細(xì)胞系，NKT細(xì)胞系)也可以通過白介素2，白介素15和白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物按照順序依次激活和擴(kuò)增。擴(kuò)增的細(xì)胞系用于臨床治療目的也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞可從來源于包含有大量淋巴細(xì)胞和前體細(xì)胞的任何組織。例如，外周血(包括臍帶血)，骨髓，脾臟和淋巴結(jié)。淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞通常取自于外周血或骨髓。在其他應(yīng)用中(例如，實(shí)驗(yàn)研究)，脾臟和/或淋巴結(jié)也是合適的來源。例如,淋巴細(xì)胞及其前體細(xì)胞可以通過抽外周血和/或骨髓來獲得。淋巴細(xì)胞/前體細(xì)胞可以進(jìn)一步經(jīng)過純化得到NK細(xì)胞，⑶8細(xì)胞，NKT細(xì)胞。純化NK細(xì)胞，⑶8細(xì)胞，NKT細(xì)胞的步驟和工藝是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴細(xì)胞可以通過密度梯度離心的方式來分離血液或骨 髓中的血紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞。NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞，NKT細(xì)胞可以利用抗體介導(dǎo)的親和制備方法進(jìn)一步純化，例如抗體結(jié)合磁珠法。純化淋巴細(xì)胞并不要求純化的淋巴細(xì)胞絕對純，而是指純化的細(xì)胞比其在來源組織中所占的比例更高。通常情況下，純化的淋巴細(xì)胞至少代表總數(shù)的50%，或者60%，或者更高。純化的NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞，NKT細(xì)胞懸浮在一個(gè)合適的生理緩沖溶液中，然后懸浮生長于但不局限于下列培養(yǎng)液中，Eagle' s培養(yǎng)液加入10%人血清，RPMI1640加入10%人血清，F(xiàn)_10 (Ham' s)Nutrientmixtures加入10%人血清。人血清也可以用10%小牛血清取代,但人血清對NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞，NKT細(xì)胞的擴(kuò)增效果更好。純化的淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞懸浮生長于細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入白介素2培養(yǎng)1-2周后，白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物以激活和擴(kuò)增NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞，NKT細(xì)胞。通常情況下為了降低成本，本發(fā)明采用最小的劑量來擴(kuò)增淋巴細(xì)胞。白介素2和白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物的劑量在50皮摩/升到I納摩/升之間。在某些情況下，白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物的劑量至少在100皮摩/升以上。在某些情況下，有必要進(jìn)行高劑量的處理，激活濃度約為0.2,0.3,0.5,0.75或I納摩/升。另外，白介素2和白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物直接注射入人體，用來在體內(nèi)擴(kuò)增NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞，NKT細(xì)胞時(shí)，所用劑量在0.5皮摩/升到0.5納摩/升之間。在體外擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞可以移植給淋巴細(xì)胞的捐助人本身或者受捐助人，以加強(qiáng)天生或抗原特異性免疫反應(yīng)。通常情況下，擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞通過溶于生理鹽水溶液的方法靜脈滴注。有益效果:本發(fā)明的白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物可更高效地?cái)U(kuò)增并且激活淋巴細(xì)胞。


圖1為白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物的示意圖。圖2為人NK細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖，顯示NK細(xì)胞在白介素2，白介素15，白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物，白介素15受體片段(IgGlFc)-白介素2復(fù)合物和白介素15受體-白介素15復(fù)合物作用下線性增長。圖3為人⑶8+T細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖顯示⑶8+T細(xì)胞在白介素2，白介素15，白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物，白介素15受體片段(IgGlFc)-白介素2復(fù)合物和白介素15受體-白介素15復(fù)合物作用下線性增長。圖4體外擴(kuò)增的NK和⑶8+T細(xì)胞對K562血液腫瘤細(xì)胞殺傷作用圖。人NK和⑶8細(xì)胞在白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物作用下培養(yǎng)14天后，與K562血液腫瘤細(xì)胞按照不同的比例共同培養(yǎng)6小時(shí)。圖5體外擴(kuò)增的NK和⑶8+T細(xì)胞對慢性淋巴細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞(B細(xì)胞)殺傷作用圖。人NK和CD8+T細(xì)胞在白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物作用下培養(yǎng)14天后，與慢性淋巴細(xì)胞白血病 B腫瘤細(xì)胞按照不同的比例共同培養(yǎng)6小時(shí)。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施作具體說明:實(shí)施例1白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物、白介素15受體片段(IgGlFc)-白介素2復(fù)合物和白介素15受體-白介素2復(fù)合物體外擴(kuò)增淋巴細(xì)胞。健康捐獻(xiàn)人的NK和⑶8+T細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640中，輔以10%的人血清。在培養(yǎng)液中加入白介素2三天后，加入白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物、白介素15受體片段(IgGlFc)-白介素2復(fù)合物或白介素15受體-白介素2復(fù)合物培養(yǎng)若干天，其中白介素15受體片段為SEQ ID NO:1的片段，IgGlFc的序列為SEQ ID NO:4,白介素15受體為完整的IL-R2 α亞基，其序列為SEQ ID NO: 5，白介素2和白介素5作為對照組。NK和⑶8+Τ細(xì)胞在白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物、白介素15受體片段(IgGlFc)-白介素2復(fù)合物和白介素15受體-白介素2復(fù)合物的作用下，數(shù)量顯著增加。而對照組細(xì)胞在白介素2，白介素15的單獨(dú)作用下，增加的遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有實(shí)驗(yàn)組明顯。細(xì)胞數(shù)量的增加可以通過插入胸苷的方法來測定。胸苷插入之后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，然后再開始測量細(xì)胞數(shù)量的變化。在I納摩/升濃度的白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物、白介素15受體片段(IgGlFc)-白介素2復(fù)合物和白介素15受體-白介素2復(fù)合物作用下NK和CD8+T細(xì)胞數(shù)量都在7天左右進(jìn)入對數(shù)生長期，14天的時(shí)候到達(dá)平臺(tái)期，分別增長了約13和10倍。NK和⑶8+Τ細(xì)胞最低分別在0.008納摩/升的白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物和白介素15受體片段(IgGlFc)-白介素2復(fù)合物以及0.01納摩/升的白介素15受體-白介素2復(fù)合物作用下可開始增長。通過實(shí)驗(yàn)也可以看出是否與IgGlFc片段連接對復(fù)合物體外擴(kuò)增淋巴細(xì)胞影響不大。白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物不僅可以擴(kuò)增純化的NK和⑶8+T細(xì)胞，還可以擴(kuò)增未經(jīng)過純化的外周血淋巴細(xì)胞和骨髓中的NK和⑶8+T細(xì)胞。在I納摩/升濃度的白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物作用下，外周血淋巴細(xì)胞第7天時(shí)約77%的CD3-淋巴細(xì)胞變成NK細(xì)胞(⑶56+)，第14天時(shí)約95%的⑶3-淋巴細(xì)胞變成NK細(xì)胞(⑶56+)。在I納摩/升濃度的白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物作用下，外周血淋巴細(xì)胞和骨髓中的NK細(xì)胞第14天時(shí)為約73%，⑶8+T細(xì)胞分別為約58%和67% )。實(shí)施例1中實(shí)驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果見圖2和圖3實(shí)施例2白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物激活的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的裂解作用。以前的研究表 明給患腫瘤的小鼠注射IL-15能夠增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤能力，延緩小鼠的壽命。本發(fā)明采用將白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物激活的NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法，來研究用白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物進(jìn)行抗腫瘤的可行性。將健康捐獻(xiàn)者的NK細(xì)胞從淋巴細(xì)胞中分離出來后，依次加入白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物激活14天。SK-N-AS，K562，和⑶19+慢性淋巴細(xì)胞白血病B細(xì)胞被用來作為裂解的靶細(xì)胞。SK-N-AS是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞系，神經(jīng)母細(xì)胞瘤是固體腫瘤。Κ562是B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系是血液腫瘤細(xì)胞系。SK-N-AS細(xì)胞表面有CD56和GD2表面抗原表達(dá)。激活的NK細(xì)胞和SK-N-AS細(xì)胞按照1: 4的比例共同培養(yǎng)6小時(shí)后，固定，加入抗體染色。白介素2激活的NK細(xì)胞作為對照。白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物激活的NK細(xì)胞顯著的比僅用白介素2激活的NK細(xì)胞對SK-N-AS的裂解作用強(qiáng)。裂解反應(yīng)后，SK-N-AS的比例從對照組的超過80%降至實(shí)驗(yàn)組的25%以下。白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物激活的NK細(xì)胞對Κ562的裂解能力比相同條件下激活的CD8+T細(xì)胞高。當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞的比值是4: I時(shí)，NK細(xì)胞的裂解能力是⑶8+Τ細(xì)胞的4.8倍。這表明在體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的殺傷過程中，激活的NK細(xì)胞比⑶8+Τ細(xì)胞可能起更大的作用。白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物激活的NK細(xì)胞對從慢性淋巴細(xì)胞白血病病人外周血提取的B細(xì)胞具有顯著的殺傷作用。復(fù)合物激活的CD8+T細(xì)胞也對病人的B細(xì)胞也有一定的殺傷作用。與對Κ562的殺傷作用趨勢相同，激活的NK細(xì)胞的裂解能力是⑶8+Τ細(xì)胞的2.3倍。實(shí)施例2中實(shí)驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果見圖4和圖5上述的實(shí)驗(yàn)顯示白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物激活的NK細(xì)胞和⑶8+Τ細(xì)胞對固體腫瘤細(xì)胞，血液腫瘤細(xì)胞和來自病人的腫瘤細(xì)胞均具有明顯的殺傷作用，可以用于臨床的腫瘤治療。申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征以及方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用材料和步驟的等效替換以及輔助材料和步驟的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物，其特征在于，其中并且所述白介素15受體片段包含SEQ ID NO:1。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其特征在于，所述白介素15受體片段為SEQID NO:2或 SEQ ID NO:3。
3.如權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合物，其特征在于，其中所述白介素15受體片段與IgGlFc片段連接，所述IgGlFc片段序列與所述白介素15受體片段形成聯(lián)合蛋白后能夠激活所述白介素15受體片段，優(yōu)選地是丙種免疫球蛋白中的Fe片段，更優(yōu)選地為CD80，CD86，B7-H1，B7-H2, B7-H3和B7-H4的具有活性的片段，最優(yōu)選地為SEQ ID NO:4。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述方法包括: (1)采用pcDNA3.1質(zhì)粒為表達(dá)質(zhì)粒，以人肺癌細(xì)胞株A549為表達(dá)載體表達(dá)所述白介素15受體片段，并且所述白介素15受體片段在溶液中形成二聚體；和 (2)向所述溶液中加入白介素2，形成所述復(fù)合物； 其中，優(yōu)選地，以與所述白介素15受體片段的摩爾比為1.5: 1-10: I的比例更優(yōu)選地2: 1-5: 1，最優(yōu)選地3: I的比例加入白介素2; 優(yōu)選地，所述白介素15受體片段與所述白介素2共同進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)； 優(yōu)選地所述白介素15受體片段或所述白介素2通過硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法中的一種或至少兩種的組合來純化。
5.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，其中所述溶液為進(jìn)行所述白介素15受體片段的細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)的培養(yǎng)液或緩沖鹽溶液，優(yōu)選地為磷酸鹽緩沖液。
6.采用如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物擴(kuò)增淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括將如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物與淋巴細(xì)胞接觸，優(yōu)選地將如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物與淋巴細(xì)胞在人體內(nèi)接觸。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述白介素15受體-白介素2復(fù)合物的劑量為0.5皮摩/升-1納摩/升，優(yōu)選地0.008納摩/升-0.75納摩/升，更優(yōu)選地0.1納摩/升-0.5納摩/ 升，最優(yōu)選地0.2納摩/升-0.3納摩/升。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的淋巴細(xì)胞或所述淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞為純化的NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞或NKT細(xì)胞中的一種或至少兩種的混合物，其中純化是指淋巴細(xì)胞代表總數(shù)的50%以上。
9.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物在用于在受治療者中治療癌癥或傳染性疾病的藥物的制備中的應(yīng)用， 其中，優(yōu)選地所述受治療者是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是人類； 所述癌癥優(yōu)選地為急性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤和腎細(xì)胞惡性腫瘤中的一種或至少兩種； 所述傳染性疾病優(yōu)選為細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲感染，更優(yōu)選地為乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒感染。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種本發(fā)明公布了一種白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物，以及使用所述復(fù)合物擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞(NK)和CD8淋巴細(xì)胞的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過白介素15受體片段-白介素2復(fù)合物與現(xiàn)有的類似復(fù)合物相比，擴(kuò)增和激活淋巴細(xì)胞的能力更強(qiáng)，效率更高。本發(fā)明在免疫治療方面具有廣闊的前景。
文檔編號(hào)A61K38/20GK103242452SQ20131019694
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月22日
發(fā)明者徐以兵, 吳忠福, 董升炬 申請人:浙江中贏控股集團(tuán)有限公司