一種嵌合抗原受體、編碼基因、表達載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種嵌合抗原受體、編碼基因、表達載體及其應(yīng)用，所述嵌合抗原受體包括依次串聯(lián)的單鏈可變區(qū)片段、用于連接單鏈可變區(qū)片段到細胞膜上的CD8α跨膜區(qū)、CD3ζ胞內(nèi)信號區(qū)，第一共刺激分子配體和第二共刺激分子配體；所述CD3ζ胞內(nèi)信號區(qū)與所述第一共刺激分子配體之間串聯(lián)有2A短肽，所述第一共刺激分子配體與所述第二共刺激分子配體之間串聯(lián)有2A短肽。本發(fā)明所提供的嵌合抗原受體通過采用2A短肽將嵌合抗原受體與兩個共刺激分子配體連接，使其同時表達于免疫細胞的表面；而一旦與抗原特異性的結(jié)合，這兩個共刺激分子配體則迅速遷移到細胞結(jié)合形成的突觸部位，有效增強免疫細胞的活性。
【專利說明】一種嵌合抗原受體、編碼基因、表達載體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種嵌合抗原受體、編碼基因、表達載體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)由單克隆抗體的單鏈可變區(qū)片段(Single Chain Variable Fragment, ScFv)和T細胞的信號區(qū)連接組成。嵌合抗原受體根據(jù)胞內(nèi)的信號區(qū)數(shù)量可分為三代。第一代嵌合抗原受體胞內(nèi)部分只含有一個CD3 ζ胞內(nèi)信號區(qū)，因此，所修飾的免疫細胞不能有效激活而且作用時間較短。第二代嵌合抗原受體在CD3 ζ胞內(nèi)信號區(qū)前增加了一個共刺激分子受體信號區(qū)，如CD28、4-1BB、0X40等，雖然臨床表現(xiàn)比第一代嵌合抗原受體無論殺傷活性還是作用時間都有顯著的改進，但仍不能滿足臨床的需要。在此基礎(chǔ)上，胞內(nèi)部分又增加一個共刺激分子信號區(qū)，即形成第三代嵌合抗原受體。但第三代嵌合抗原受體由于將三個信號分子線性串聯(lián)起來，容易被低親和力的非特異性抗原激活，甚至出現(xiàn)自我激活，從而發(fā)生非抗原特異性的激活而導(dǎo)致細胞毒副作用并引起機體的免疫排斥反應(yīng)。
[0003]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種嵌合抗原受體、編碼基因、表達載體及其應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有嵌合抗原受體所存在的問題。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括依次串聯(lián)的單鏈可變區(qū)片段、來源于CDSa的跨膜區(qū)、CD3(胞內(nèi)信號區(qū)，第一共刺激分子配體(CML-1)和第二共刺激分子配體(CML-2);所述CD3(胞內(nèi)信號區(qū)與所述第一共刺激分子配體之間串聯(lián)有第一 2A短肽，所述第一共刺激分子配體與所述第二共刺激分子配體之間串聯(lián)有第二 2A短肽。
[0006]所述的嵌合抗原受體，其中，所述第一和第二共刺激分子配體分別為TNF類配體、Ig超家族分子或者細胞因子中的一種；
所述TNF類配體包括4_1BBL、0X40L、CD70、LIGHT和CD30L ;所述Ig超家族分子為CD80和 CD86 ;所述細胞因子包括 IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21 或 GM-CSF。
[0007]所述的嵌合抗原受體，其中，第一共刺激分子配體為CD80，第二共刺激分子配體為4-1BBL。
[0008]所述的嵌合抗原受體，其中，所述第一 2A短肽的氨基酸序列為EGRGSLLTCGDVEENPGP ;第二 2A 短肽的氨基酸序列為 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。
[0009]一種編碼基因，其中，所述編碼基因用于表達如上所述的嵌合抗原受體。
[0010]所述的編碼基因，其中，用于編碼第一 2A短肽的核苷酸序列如SEQ N0.7所示；用于編碼第二 2A短肽的核苷酸序列如SEQ N0.8所示.一種如上所述編碼基因的應(yīng)用，其中，將所述編碼基因用于修飾免疫細胞。
[0011 ] 一種表達載體，其中，所述表達載體中裝載有如上所述的編碼基因。
[0012]所述的表達載體，其中，所述表達載體為慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、質(zhì)粒等表達載體。所述質(zhì)粒包括普通質(zhì)粒和微環(huán)質(zhì)粒。
[0013]有益效果:本發(fā)明所提供的嵌合抗原受體通過采用2A短肽將嵌合抗原受體與兩個共刺激分子配體連接，使其同時表達于免疫細胞的表面；而一旦與抗原特異性的結(jié)合，這兩個共刺激分子配體則迅速遷移到細胞結(jié)合形成的突觸部位，有效增強免疫細胞的活性。因此，采用此嵌合抗原受體編碼基因修飾的免疫細胞，在增強殺傷活性的同時也增強了與靶抗原結(jié)合的特異性。采用所述編碼基因修飾的免疫細胞可用于腫瘤治療，也可用于乙肝和其他慢性傳染病治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明實施例2中構(gòu)建攜帶有嵌合抗原受體基因的慢病毒載體的示意圖。
[0015]圖2為本發(fā)明實施例2中攜帶嵌合抗原受體基因的慢病毒載體的單/雙酶切鑒定結(jié)果圖。
[0016]圖3為本發(fā)明實施例3中瞬時轉(zhuǎn)染慢病毒載體的293T細胞中⑶3 ζ的表達檢測結(jié)果圖。
[0017]圖4為本發(fā)明實施例4中經(jīng)嵌合抗原受體基因修飾后的免疫細胞對靶細胞的殺傷活性檢測結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體、編碼基因、表達載體及其應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0019]本發(fā)明所提供的一種嵌合抗原受體，攜帶有兩個共刺激分子配體，并分別通過兩個不同的2Α短肽將兩個共刺激分子配體與所述嵌合抗原受體連接在同一載體上。所述共刺激分子配體可以為 4-1BBL、0X40L、CD70、LIGHT、CD30L、CD80、CD86、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21或GM-CSF等。由于通過采用不同的2A短肽將嵌合抗原受體與兩個共刺激分子配體連接，使其同時表達于免疫細胞的表面；而一旦與抗原特異性的結(jié)合，這兩個共刺激分子配體則迅速遷移到細胞結(jié)合形成的突觸部位，有效增強免疫細胞的活性。
[0020] 本發(fā)明中，以CD80和4-1BBL為例，提供一種新型嵌合抗原受體一Super-CAR，其結(jié)構(gòu)為ScFv-⑶8 α -⑶3 ζ -2Α-⑶80-2A_4_lBBL。具體地，所述嵌合抗原受體是由單鏈可變區(qū)片段(Single Chain Variable Fragment, ScFv),用于連接 ScFv 到細胞膜上的 CD8 α 跨膜區(qū)，⑶3 ζ胞內(nèi)信號區(qū)，第一共刺激分子配體⑶80和第二共刺激分子配體4-1BBL依次串聯(lián)組成，其中，所述單鏈可變區(qū)片段主要包括Vh和'片段。其中，ScFv (CEA)的氨基酸序列依次包括信號前導(dǎo)區(qū)、CEA的Vh片段、Linker (GGGGS)3和'片段。所述⑶3 ζ胞內(nèi)信號區(qū)與所述⑶80之間串聯(lián)有第一 2Α短肽，所述⑶80與所述4-1BBL之間串聯(lián)有第二 2Α短肽。2A-CD80-2A-4-1BBL基因的氨基酸序列依次包括Τ2Α片段(即第一 2Α短肽)、CD80片段、F2A片段(即第二 2A短肽)、4_1BBL片段。其氨基酸序列如下表1所示。
[0021]表1

【權(quán)利要求】
1.一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體包括依次串聯(lián)的單鏈可變區(qū)片段、CDSd跨膜區(qū)、CD3(胞內(nèi)信號區(qū)，第一共刺激分子配體和第二共刺激分子配體；所述CD3 ζ胞內(nèi)信號區(qū)與所述第一共刺激分子配體之間串聯(lián)有第一 2Α短肽，所述第一共刺激分子配體與所述第二共刺激分子配體之間串聯(lián)有第二 2Α短肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其特征在于，所述第一和第二共刺激分子配體分別為TNF類配體、Ig超家族分子或者細胞因子中的一種；所述TNF類配體包括4-1BBL、0X40L、CD70、LIGHT和CD30L ;所述Ig超家族分子為CD80和CD86 ;所述細胞因子包括IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-1U IL-12、IL-15、IL-21 或 GM-CSF0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嵌合抗原受體，其特征在于，第一共刺激分子配體為CD80，第二共刺激分子配體為4-1BBL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其特征在于，所述第一2A短肽的氨基酸序列為 EGRGSLLTCGDVEENPGP ;第二 2A 短肽的氨基酸序列為 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。
5.一種編碼基因，其特征在于，所述編碼基因用于表達如權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的編碼基因，其特征在于，用于編碼第一2A短肽的核苷酸序列如SEQ N0.7所示；用于編碼第二 2A短肽的核苷酸序列如SEQ N0.8所示。
7.—種如權(quán)利要求5所述編碼基因的應(yīng)用，其特征在于，將所述編碼基因用于修飾免疫細胞。
8.—種表達載體，其特征在于，所述表達載體中裝載有如權(quán)利要求5所述的編碼基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒或質(zhì)粒。
【文檔編號】A61P35/00GK104177499SQ201310200787
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月27日
【發(fā)明者】張鴻聲 申請人:張鴻聲