豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清1型鋅離子結(jié)合蛋白a缺失株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清1型鋅離子結(jié)合蛋白A（znuA）缺失株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，其微生物保藏號(hào)是CCTCC?NO：M2012476，分類命名：Actinobacillus?pleuropneumoniae?APP-1（ΔznuA），保藏時(shí)間是：2012年11月23日；保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：中國.武漢.武漢大學(xué)。本發(fā)明將znuA基因缺失突變菌株與親本株進(jìn)行比較，研究其生物學(xué)特性和致病性免疫原性，發(fā)現(xiàn)表明該基因缺失株的致病性比親本株APP明顯要弱，可用于研制APP的基因缺失滅活疫苗，為更加安全而有效地防治豬傳染性胸膜肺炎提供有效的技術(shù)和方法。
【專利說明】豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清1型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的是涉及豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A (znuA)缺失株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病。本病主要引起豬發(fā)生伴有胸膜炎的出血性、壞死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死。該病可發(fā)生于任何年齡的豬只，且流行于世界各地，一旦爆發(fā)，經(jīng)濟(jì)損失巨大。當(dāng)前國內(nèi)豬胸膜肺炎的控制主要依賴滅活疫苗免疫和抗生素治療。滅活疫苗雖然可以有效地控制同源菌株的感染，但由于血清型眾多且抗原成分復(fù)雜，對異源菌株的控制效果差強(qiáng)人意。抗生素的濫用已導(dǎo)致了我國大量耐藥菌株的出現(xiàn)，增加了多重耐藥的危險(xiǎn)，使得疾病的預(yù)防和治療更加困難，并且易導(dǎo)致豬肉產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)而引發(fā)公共衛(wèi)生問題。
[0003]APP是一種革蘭氏陰性菌，分為2個(gè)生物型，共15種血清型(1-15型)，毒力因子有溶血外毒素(Αρχ)、莢膜多糖(Capsular Polysaccharide, CP)等。此外，Sheehan等運(yùn)用信號(hào)標(biāo)簽誘變技術(shù)(Signature tagged mutagenesis, STM)對豬胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)znuA基因?qū)ζ湓谪i體內(nèi)存活非常重要(Sheehan et al.，2003)。znuA基因的缺失在一些致病菌中被證實(shí)能導(dǎo)致毒力明顯下降(Ammendola et al., 2008;Dahiya andStevenson, 2010; Gunasekera et al.，2009),表明 znuA 在致病過程中發(fā)揮了重要作用。
[0004]鑒于此，著手于豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌新型基因工程疫苗的研究，通過同源重組的原理構(gòu)建了 znuA基因缺失突變菌株，研究其遺傳特性、生長特性、對動(dòng)物致病性等，發(fā)現(xiàn)其毒力較親本菌株大大降低，并且保留有良好的免疫原性，這為更加安全而有效的防控豬傳染性胸膜肺炎提供技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)而提出一種適用于豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，其安全性更強(qiáng)、免疫原性更好。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株，其微生物保藏號(hào)是CCTCC NO:M2012476，分類命名:Actinobacillus pleuropneumoniae APP-1 ( ΔζηιιΑ),保藏時(shí)間是:2012 年 11 月 23 日；保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址:中國.武漢.武漢大學(xué)。
[0007]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株的構(gòu)建方法是:首先將鋅離子結(jié)合蛋白A基因的上游同源臂基因znuAs和下游同源臂基因znuAx進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后再分別克隆入PMD18-T載體，測序后酶切，回收目的片段再克隆入經(jīng)相同酶切的pEM0C2載體中，最后獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒ρΕ Δ znuA ;將重組質(zhì)粒ρΕ Δ znuA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌β 2155中，挑選其中的陽性克隆，用得到的陽性克隆與親本菌株以混合培養(yǎng)，然后采用TSB進(jìn)行洗滌兩次后均勻涂于含NAD和氯霉素(Cm)的TSA平皿培養(yǎng)24h，挑取單菌落，并用引物P5/P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出一條約lOOObp，另一條約250bp共兩個(gè)片段的菌落，進(jìn)一步用氯霉素基因(Cm)引物P9/P10能擴(kuò)增出約750bp的帶有截短片段的菌落，即可判斷為單交換子克隆子，將單交換子克隆子接種不含氯霉素抗性的TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)8h后，連續(xù)10倍稀釋，涂于含10%蔗糖的TSA平皿，挑取蔗糖抗性的克隆，用引物P5/P6和P9/P10同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只能擴(kuò)增得到一段截短片段的菌落即可初步判斷為znuA基因缺失突變菌株，挑選陽性克隆子進(jìn)一步用引物P7/P8進(jìn)行RT-PCR，如果僅能擴(kuò)增出一段約250bp片段，即可斷定為znuA基因缺失突變菌株，命名為(APP-1 ( Δ znuA))。
[0008]按上述方案，所述的引物P5的序列為:TTCCGCCATTTCAAGATAAG ;所述的引物P6的序列為CTATGCCTTTTATCTGCCGA ;所述的引物P7的序列為:GTGCCGAATAAATTACAC ;所述的引物 P8 的序列為:ATACCGCAGTTGCTCCTA。
[0009]按上述方案，所述的混合培養(yǎng)的方法是:用得到的陽性克隆與親本菌以1:3的比例混合培養(yǎng)5h。
[0010]所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株在制備防治豬傳染性胸膜肺炎滅活疫苗中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的有益效果在于:將本發(fā)明的ZnuA基因缺失突變菌株與親本株進(jìn)行比較，研究其生物學(xué)特性和致病性免疫原性，發(fā)現(xiàn)表明該基因缺失株的致病性比親本株APP明顯要弱，可用于研制APP的基因缺失滅活疫苗，為更加安全而有效地防治豬傳染性胸膜肺炎提供有效的技術(shù)和方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明使用的pMD18-T質(zhì)粒限制性圖譜；
[0013]圖2為本發(fā)明使用的PEM0C2質(zhì)粒限制性圖譜；
[0014]圖3為豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型znuA的上游同源臂znuAs的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中 M:DNA Ladder (DL2000) ；1:znuAs ；2:陰性對照；
[0015]圖4為豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型znuA的下游同源臂znuAx的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中 M:DNA Ladder (DL2000) ；1:陰性對照；2:znuAx ；
[0016]圖5為本發(fā)明制備的重組質(zhì)粒ρΕΜ Δ znuA的酶切鑒定結(jié)果，其中Ml、M2:DNALadder (DL15000) ；1:NotI/SalI 酶切；2:NotI/XbaI 酶切；3:SalI/XbaI 酶切；
[0017]圖6為引物P3和P4鑒定單交換子，其中1:陰性對照；2、3、4:單交換子；5:親本株；M =Marker DL2000 ；
[0018]圖7為擴(kuò)增Cm基因鑒定單交換子，其中M:Marker DL2000 ;1:親本株；2、3、4:單交換子；5:陰性對照；
[0019]圖8為引物P5和P6鑒定znuA基因缺失株(APP-l(AznuA))，其中1:親本株；2:Δ znuA突變株；3:陰性對照；
[0020]圖9為本發(fā)明中的豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型znuA基因缺失突變菌株的生長特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；[0021]圖10本發(fā)明的APP-1 ( Δ znuA)與商品化滅活苗對小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合具體實(shí)施例和說明書附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0023]實(shí)施例:
[0024]一、材料
[0025]1、工具酶和試劑
[0026]各種限制性內(nèi)切酶、Ex/LA Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、Klenow片段等工具酶、DNA Marker、RNase酶均購自大連寶生物公司。
[0027]DNA回收試劑盒購自Tiangen公司。
[0028]胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar, TSA)、胰蛋白大豆肉湯(Tryptic SoyBroth, TSB)購自美國 Becton Dickinson and Company 公司。
[0029]二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid, DAP)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD+)、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 / 豬 IgG 二抗以及負(fù)向篩選用鹿糖購自美國Sigma公司。
[0030]新生牛血清購自杭州四季青材料有限公司，使用前經(jīng)56°C滅活30min。
[0031]氨節(jié)青霉素(Ampicillin，Amp)、卡那霉素(kanamycin，Kan)、氯霉素(Chloramphenicol, Cm)、溶菌酶、蛋白酶 K 均購自 Invitrogen 公司。
[0032]2、培養(yǎng)基、抗生素及緩沖液
[0033]培養(yǎng)基:
[0034]TSB(Tryptic Soy Broth)液體培養(yǎng)基:6g培養(yǎng)基溶于180mL水中，121°C高壓蒸氣滅菌20min。使用時(shí)加入終溶度為10 μ g/mL的NAD和10%小牛血清。
[0035]TSA(Tryptic Soy Agar)固體培養(yǎng)基:8g培養(yǎng)基溶于180mL水中，121°C高壓蒸氣滅菌30min。使用時(shí)加入終溶度為10 μ g/mL的NAD和10%小牛血清。
[0036]LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NaCllOg，溶于ddH20中，完全溶解后用5mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0~7.2，定容至lOOOmL，121°C高壓蒸氣滅菌20min，室溫保存。
[0037]LB固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉，121°C高壓蒸氣滅菌20min。待培養(yǎng)基溫度降至50°C左右，加入相應(yīng)的抗生素后，鋪制平板，待培養(yǎng)基凝固后，于4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0038]抗生素:
[0039]氨芐青霉素(Amp):用滅菌ddH20配成貯存濃度50mg/mL，_20°C備用。
[0040]卡那霉素(Kan):用滅菌ddH20配成C存濃度25mg/mL, _20°C備用。
[0041]氯霉素(Cmp):用無水乙醇配成忙存濃度25mg/mL,-20°C備用。
[0042]細(xì)菌基因組DNA提取溶液:
[0043]TE: 10mmol /T, Tris.HCl (pH8.5), lmmol/L EDTA, 50mg/mL 的溶菌酶，2mol/LNaCl, 10%SDS，20mg/mL的蛋白酶K，酚:氯仿:異戊醇(100:99:1)，異丙醇，75%的乙醇。
[0044]質(zhì)粒抽提相關(guān)溶液
[0045]溶液1:50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-Cl (ρΗ8.0),高壓滅菌后置4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0046]溶液II:0.2mol/L NaOH, 1%SDS,現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0047]溶液II1:3mol/L乙酸鉀，冰醋酸調(diào)pH值至4.8。
[0048]50XTAE 緩沖液:Tris base242g 加入到 700mL ddH20 中，再加入冰醋酸 5.7mL,0.5mol/LEDTA (pH8.0) lOOmL，用 ddH20 定容至 lOOOmL，室溫保存?zhèn)溆谩?br> [0049]0.8%瓊脂糖凝膠:2.0mL50 X TAE緩沖液，98mL ddH20，瓊脂糖0.8g，加熱完全溶解。
[0050]7.5mol/L 醋酸銨(NH4Ac)溶液:57.8g NH4Ac 溶于少量 ddH20，然后用 ddH20 定容至 10OmT, η
[0051]TE 緩沖液(ρΗ8.0):1.0mmoI/L EDTA (ρΗ8.0)，10.0mmoI/L Tris-Cl (ρΗ8.0)。
[0052]酚:氯仿:異戊醇(25:24:1):用吸管分別吸取飽和酚25.0mL、氯仿24.0mL和異戊醇1.0mL于已裝有適量TE(pH8.0)的棕色瓶底部，輕輕混勻。
[0053]氯仿:異戊醇(24:1):氯仿48.0mL,異戊醇2.0mL, TE(pH8.0)覆蓋，儲(chǔ)存于棕色瓶備用。其他緩沖液和試劑:
[0054]TE(pH8.0):10.0mmol/L Tris-HCl, 1.0mmol/L EDTA。
[0055]50 X TAE:242.0g Tris 堿，57.1mL冰乙酸，100.0mL0.5mol/L EDTA，pH8.0，加 ddH20定容至1，OOOrnL。
[0056]0.lmol/L CaCl2溶液:取11.1g CaCl2溶于去離子水中并定容至1，OOOmL,過濾除雜，高溫滅菌，用于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備。
[0057]3、引物設(shè)計(jì)與合成
[0058]應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0，設(shè)計(jì)了引物(表1)，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
[0059]表1:本發(fā)明所用的引物
[0060]
【權(quán)利要求】
1.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株，其微生物保藏號(hào)是CCTCC NO:M2012476,分類命名:Actinobacillus p leuropneumoniae APP-1 (ΔζηιιΑ),保藏時(shí)間是:2012年11月23日；保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址:中國.武漢.武漢大學(xué)。
2.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株的構(gòu)建方法是:首先將鋅離子結(jié)合蛋白A基因的上游同源臂基因znuAs和下游同源臂基因znuAx進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再分別克隆入PMD18-T載體，測序后酶切，回收目的片段再克隆入經(jīng)相同酶切的PEM0C2載體中，最后獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒ρΕ Δ znuA ;將重組質(zhì)粒ρΕ Δ znuA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌β 2155中，挑選其中的陽性克隆，用得到的陽性克隆與親本菌株混合培養(yǎng)，然后用TSB洗滌兩次后均勻涂于含NAD和氯霉素的TSA平皿培養(yǎng)24h，挑取單菌落，并用引物P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，擴(kuò)增結(jié)果中帶有截短片段即可判斷為單交換子克隆子，將單交換子克隆子接種不含氯霉素抗性的TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)8h后，連續(xù)10倍稀釋，涂于含10%蔗糖的TSA平皿，挑取蔗糖抗性的克隆，用引物P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆即可初步判斷為znuA基因缺失突變菌株，挑取陽性克隆子進(jìn)一步用引物P7/P8進(jìn)行RT-PCR，如果僅能擴(kuò)增出一段約250bp的片段，即可斷定為znuA基因缺失突變菌株，命名為APP-1 ( Δ znuA)。
3.按權(quán)利要求2所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于所述的引物P5的序列為:TTCCGCCATTTCAAGATAAG ;所述的引物P6的序列為CTATGCCTTTTATCTGCCGA ;所述的引物P7的序列為:GTGCCGAATAAATTACAC ;所述的引物 P8 的序列為:ATACCGCAGTTGCTCCTA。
4.按權(quán)利要求2或3所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株的構(gòu)建方法，其特征在于所述的混合培養(yǎng)的方法是:用得到的陽性克隆與親本菌以1:3的比例混合培養(yǎng)5h。
5.權(quán)利要求1所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型鋅離子結(jié)合蛋白A缺失株在免疫防治豬傳染性胸膜肺炎中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK103589656SQ201310203118
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月28日
【發(fā)明者】袁芳艷, 田永祥, 劉澤文, 周丹娜, 楊克禮, 段正贏, 郭銳 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所