專利名稱：熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，屬于生物工程和生物免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，治愈性肝切除以及肝移植是目前肝癌病人的首選方法，但是由于肝癌的肝內(nèi)多發(fā)病灶、肝外轉(zhuǎn)移及供體缺乏的因素，診斷出的病人中僅有10% 15%的病人可以接受手術(shù)治療。臨床資料還顯示，大多數(shù)肝癌患者對(duì)化療、放療不敏感，且對(duì)正常細(xì)胞造成一定的損害，毒副反應(yīng)大，易復(fù)發(fā)，因此肝癌的臨床治療迫切地需要新技術(shù)和新方法。近年來，腫瘤免疫治療已成為繼手術(shù)、化療和放療后另一種很有前途的治療手段。其吸引人之處在于能夠激發(fā)患者自身免疫系統(tǒng)，誘發(fā)高特異性免疫反應(yīng)，不僅實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤病灶的腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷，而且還可以消除血液和淋巴系統(tǒng)中的癌細(xì)胞，有效地阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，因此，成為近年來國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。肝腫瘤細(xì)胞疫苗是將自身或異體同種肝癌細(xì)胞經(jīng)過物理因素(照射、高溫)、化學(xué)因素(酶解)以及生物因素(病毒感染、基因轉(zhuǎn)染等)的處理，改變或消除其致瘤性，保留其免疫原性，免疫機(jī)體，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫，以達(dá)到治療肝癌、預(yù)防肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的目的。然而，腫瘤疫苗研制過程中存在的一個(gè)共同問題是大多數(shù)腫瘤抗原的免疫原性弱，抗原表位少，表達(dá)分布不同，很難引起機(jī)體特異性免疫應(yīng)答，需添加佐劑來增強(qiáng)其免疫原性。鋁鹽佐劑是目前唯一全球公認(rèn)的人用佐劑，但存在對(duì)蛋白亞單位疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力較弱，激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答能力差等，而且在某些情況下，還會(huì)產(chǎn)生與過敏反應(yīng)有關(guān)的IgE，其副作用難以避免。因此，需要研發(fā)更為安全有效的人用新型佐劑，尤其是安全無(wú)毒、能夠刺激較強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的佐劑。近年來，從藥用植物中提取安全、高效的自然組分作為免疫佐劑成為佐劑·研究的趨勢(shì)。熊果酸(Ursolic acid, UA),又名烏索酸、烏蘇酸,是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，以游離形式或與糖結(jié)合成苷的形式分布于枇杷葉、熊果、女貞子、山楂、車前草、夏枯草、白花蛇舌草等多種植物中。研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等多種生物學(xué)效應(yīng)。經(jīng)系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)和專利資料，目前未發(fā)現(xiàn)熊果酸在抗腫瘤免疫佐劑方面的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，該方法是將熊果酸和H22細(xì)胞共培養(yǎng)，采用常規(guī)方法制備肝癌細(xì)胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，結(jié)果表明熊果酸為佐劑的疫苗免疫小鼠后，荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)明顯抑制，小鼠的生命延長(zhǎng)率明顯高于模型組，胸腺等免疫器官得到保護(hù)，脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著升高，血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4含量明顯升高，⑶47⑶8+T細(xì)胞含量比例明顯升高，免疫熒光顯示免疫小鼠血清可與H22細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，ELISA從血清中檢測(cè)到高滴度抗體。熊果酸作為佐劑制備的肝腫瘤全細(xì)胞疫苗，可有效的提高肝腫瘤疫苗的免疫原性，通過該方法獲得的熊果酸免疫佐劑疫苗安全，無(wú)毒，來源廣泛，克服了目前免疫佐劑單一，免疫效果低，副作用難以避免的問題。本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，按下列步驟進(jìn)行:
a、在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H22腫瘤細(xì)胞5X IO7個(gè)接種于Iml含滅活的10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，加入20 μ mol/mL的熊果酸培養(yǎng)48h ；
b、離心棄上清液，剩余物細(xì)胞懸浮于Iml生理鹽水中，再放入液氮中冷凍，時(shí)間5-10分鐘，再將冷凍物取出，放入溫度37°C水融化，反復(fù)5-8次，即可得到熊果酸免疫佐劑疫苗。一種所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝腫瘤全細(xì)胞的疫苗。一種所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備預(yù)防肝腫瘤全細(xì)胞的疫苗。本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，其中熊果酸的結(jié)構(gòu)式為:.H Pcooh I Hi,.H 1:
本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，通過該方法獲得的熊果酸免疫佐劑疫苗中，包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細(xì)胞的活性成分；其中所述的活性成分為蛋白質(zhì)、多肽、脂類、蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物、DNA分子、RNA分子、腫瘤相關(guān)抗原或特異性腫瘤抗原。本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，通過所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝癌腫瘤全細(xì)胞和預(yù)防肝癌腫瘤全細(xì)胞的新用途，其中:
(1)、小鼠肝腫瘤全細(xì)胞免疫疫苗的制備:采用熊果酸與小鼠給腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，反復(fù)凍融，獲得小鼠肝腫瘤全細(xì)胞免疫疫苗；
(2)、建立小鼠免疫模型，檢測(cè)各個(gè)組的免疫小鼠存活情況，結(jié)果表明全細(xì)胞疫苗組可明顯提高小鼠的成活率及延長(zhǎng)小鼠的生存天數(shù)；而且全細(xì)胞疫苗組可抑制腫瘤的快速生長(zhǎng);
(3)、小鼠免疫模型各組中，全細(xì)胞疫苗組可以在一定程度上保護(hù)小鼠的免疫器官，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的活性，提高⑶47⑶8+比值，提高細(xì)胞因子IL-2、IL-4的表達(dá)量；
(4)、利用免疫熒光檢測(cè)小鼠免疫模型各組中抗原、抗體結(jié)合情況，結(jié)果表明，免疫成功小鼠血清中存在與腫 瘤抗原結(jié)合的特異抗體，而且體液中特異性抗體IgG的表達(dá)也得到了提聞。
(全細(xì)胞+UA)疫苗免疫小鼠后，胸腺等免疫器官得到保護(hù)，脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著升高，⑶47⑶8+T細(xì)胞含量比例明顯升高，血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4含量明顯升高，免疫熒光顯示免疫小鼠血清可與H22細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，ELISA從血清中檢測(cè)到高滴度抗體。本發(fā)明的有益效果是:熊果酸作為佐劑制備的腫瘤全細(xì)胞疫苗，可有效的提高腫瘤疫苗的免疫原性，提高小鼠的生存率及生存天數(shù)，保護(hù)肝腫瘤導(dǎo)致的脾免疫器官異常增大、增強(qiáng)細(xì)胞免疫活性，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的作用，可作為抗肝腫瘤免疫佐劑；其另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是安全，無(wú)毒，來源廣泛。


圖1為本發(fā)明免疫小鼠生長(zhǎng)過程中體重的變化圖，其中一 一為模型組，一■一為熊果酸組，一▲一為細(xì)胞組，一X—為疫苗組，一 一為空白組；
圖2為本發(fā)明接種腫瘤后，腫瘤生長(zhǎng)曲線圖，其中一 一為模型組，一▲一為熊果酸組，一.一為細(xì)胞組，一 一為疫苗組；
圖3為本發(fā)明免疫各組的細(xì)胞因子IL-2 (a) IL-4 (b)的變化 圖4為本發(fā)明熒光顯微鏡觀察免疫血清抗體(X20) 圖5為本發(fā)明免疫各組血清中IgG的表達(dá)情況圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，按下列步驟進(jìn)行:
a、在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H22腫瘤細(xì)胞5X IO7個(gè)接種于Iml含滅活的10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，加入20 μ mol/mL的熊果酸培養(yǎng)48h ；
b、離心棄上清液，剩余物細(xì)胞懸浮于Iml生理鹽水中，再放入液氮中冷凍，時(shí)間5-10分鐘，再將冷凍物取出，放入溫度37°C水融化，反復(fù)5-8次，即可得到熊果酸免疫佐劑疫苗。實(shí)施例2
通過本發(fā)明所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝腫瘤全細(xì)胞或預(yù)防肝腫瘤全細(xì)胞的用途:
小鼠肝癌疫苗的免疫模型的建立:
小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白組、模型組、熊果酸免疫組、細(xì)胞免疫組、熊果酸細(xì)胞共培養(yǎng)免疫組(簡(jiǎn)稱疫苗免疫組);
熊果酸免疫組為在Iml生理鹽水中加入熊果酸至終濃度為20ymol/L，細(xì)胞免疫組為在Iml含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H22細(xì)胞5 X IO7個(gè)，培養(yǎng)48h后取出，離心棄上清，懸浮于Iml生理鹽水中，液氮中反復(fù)凍融5-8次，空白組不進(jìn)行處理，模型組給予0.2ml/只生理鹽水，熊果酸組給予0.2ml/只熊果酸，細(xì)胞免疫組和疫苗免疫組分別給予相應(yīng)疫苗0.2ml/只；背部皮下免疫，每周I次，第3次免疫后7天給模型組、熊果酸組、細(xì)胞組和疫苗免疫組分別右側(cè)腋窩皮下接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H22細(xì)胞2 X IO6個(gè)/只，觀察各組的觀察各組小鼠的成瘤率、出瘤時(shí)間、腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)以及生存期； 結(jié)果:小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，開始接種免疫，期間各組小鼠體重變化趨于一致，自腋窩皮下接種H22細(xì)胞建模后，每日稱量小鼠體重，繪制小鼠體重隨時(shí)間變化圖(圖1);建模7天后，各組體重變化開始出現(xiàn)明顯差異；模型組和熊果酸免疫組體重明顯升高，細(xì)胞免疫組和疫苗免疫組升高幅度較小，且后期逐漸持平；至實(shí)驗(yàn)結(jié)束模型組平均體重為42.10±2.16g,熊果酸免疫組平均體重為40.45±3.96g,細(xì)胞免疫組平均體重為37.78±3.64g，疫苗免疫組平均體重為37.15±4.50g，空白組平均體重為36.35±3.80g，其中細(xì)胞免疫組和疫苗免疫組體重與空白組最接近；說明單純癌細(xì)胞疫苗和全細(xì)胞疫苗均有一定的免疫預(yù)防作用，其中全細(xì)胞疫苗組效果最好。免疫小鼠存活情況及腫瘤生長(zhǎng)檢測(cè):
各組小鼠自免疫開始，測(cè)量體重變化并記錄生存時(shí)間，計(jì)算小鼠生命延長(zhǎng)率和存活率，生命延長(zhǎng)率(ILS)=(各免疫組平均生存時(shí)間-模型組平均生存時(shí)間)/模型組平均生存時(shí)間 X100% ；
接種腫瘤后，每日觀察腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積(mm3) =長(zhǎng)X寬2X0.5 ；結(jié)果:模型組和熊果酸組在接種實(shí)體瘤20天時(shí)開始出現(xiàn)死亡，至27天已全部死亡；細(xì)胞免疫組存活時(shí)間有所延長(zhǎng)，但接種實(shí)體瘤30天后也全部死亡；至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，疫苗免疫組仍有50%小鼠存活，生命延長(zhǎng)率大幅提高，平均存活時(shí)間為38.00±7.07天，與模型組比較存在極顯著性差異(P〈0.01)，說明注射的疫苗能明顯的延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間見表1:
表I各免疫組小鼠生存狀況(n=10)
權(quán)利要求
1.一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行 a、在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H22腫瘤細(xì)胞5X IO7個(gè)接種于Iml含滅活的10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，加入20 μ mol/mL的熊果酸培養(yǎng)48h ； b、離心棄上清液，剩余物細(xì)胞懸浮于Iml生理鹽水中，再放入液氮中冷凍，時(shí)間5-10分鐘，再將冷凍物取出，放入溫度37°C水融化，反復(fù)5-8次，即可得到熊果酸免疫佐劑疫苗。
2.一種如權(quán)利要求I所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，其特征在于該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝腫瘤全細(xì)胞的疫苗。
3.—種如權(quán)利要求I所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，其特征在于該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備預(yù)防肝腫瘤全細(xì)胞的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，該方法是將熊果酸和H22細(xì)胞共培養(yǎng)，采用常規(guī)方法制備肝癌細(xì)胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，結(jié)果表明熊果酸為佐劑的疫苗免疫小鼠后，荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)明顯抑制，小鼠的生命延長(zhǎng)率明顯高于模型組，胸腺等免疫器官得到保護(hù)，脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著升高，血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4含量明顯升高，CD4+/CD8+T細(xì)胞含量比例明顯升高，免疫熒光顯示免疫小鼠血清可與H22細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，ELISA從血清中檢測(cè)到高滴度抗體。熊果酸作為佐劑制備的肝腫瘤全細(xì)胞疫苗，可有效的提高肝腫瘤疫苗的免疫原性，通過該方法獲得的熊果酸免疫佐劑疫苗安全，無(wú)毒，來源廣泛，克服了目前免疫佐劑單一，免疫效果低，副作用難以避免的問題。
文檔編號(hào)A61K39/39GK103251944SQ20131021182
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月31日
發(fā)明者李曉波, 李艷紅, 陸雪瑩, 肖向文 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所