PPP3CC基因或其表達產(chǎn)物在治療j11崎病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了PPP3CC基因或其表達產(chǎn)物在治療川崎病中的應(yīng)用。具體地，涉及一種鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶3催化亞基Y亞型蛋白（proteinphosphatase3，catalyticsubunit,gammaisozyme,PPP3CC)基因、蛋白、或其促進劑的用途，用于制備⑴提高1，4，5三磷酸肌醇3激酶C(1，4，5-trisphosphate3-kinaseC,ITPKC)的表達量和/或活性；和/或（ii)治療川崎病(Kawasakidisease)的藥物組合物。本發(fā)明有益于了解川崎病的發(fā)病機制和路徑，并開發(fā)治療川崎病的藥物。
【專利說明】PPP3CC基因或其表達產(chǎn)物在治療川崎病中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及自身免疫系統(tǒng)疾病領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及PPP3CC基因、蛋白或其 促進劑對ITPKC表達量和/或活性的促進作用，從而有助于治療川崎病。

【背景技術(shù)】
[0002] 川崎?。↘awasaki diseasa)，川崎病是1967年日本川崎富作醫(yī)師首選報道，并 以他的名字命名的疾病，又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征（MCLS)，臨床多表現(xiàn)：發(fā)熱、皮疹、頸 部非膿性淋巴結(jié)腫大、眼結(jié)合膜充血、口腔黏膜彌漫充血、楊梅舌、掌跖紅斑、手足硬性水腫 等。
[0003] 川崎病是一種免疫介導(dǎo)的血管炎，在急性期存在明顯的免疫失調(diào)。主要影響5歲 以下的兒童，如果未進行干預(yù)，將有20-25%的病例發(fā)生冠狀動脈損傷。
[0004] ITPKC(inositol-trisphosphate3_kinase C)是由 Onouchi Y 等首次發(fā)現(xiàn)的川崎 病的易感基因，由SNP引發(fā)的ITPKC表達失調(diào)可引發(fā)川崎病。然而ITPKC基因在川崎病發(fā) 病過程中的機制尚不清楚，因此，本領(lǐng)域迫切需要研究開發(fā)基于ITPKC作用機制的治療川 崎病的藥物和方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了 PPP3CC與ITPKC的相互作用機制，并能作為ITPKC的穩(wěn)定劑治療川 崎病的用途。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶3催化亞基Y亞型蛋白（protein phosphatase 3，catalytic subunit，gamma isozyme，PPP3CC)基因、蛋白、或其促進劑的 用途，用于制備（i)提高1，4,5三磷酸肌醇3激酶C(l，4,5-trisphosphate 3-kinase C， ITPKC)的表達量和/或活性；和/或（ii)治療川崎病（Kawasaki disease)的藥物組合物。
[0007] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括（a)PPP3CC基因、蛋白、或其促進劑；和 (b)藥學(xué)上可接受的載體。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述的促進劑包括PPP3CC的基因表達產(chǎn)物、促進型miRNA、促進 型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的PPP3CC蛋白是攜帶PPP3CC編碼序列的質(zhì)粒所表達的，或 轉(zhuǎn)染了 PPP3CC編碼序列的宿主細胞所表達的。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的PPP3CC來源于哺乳動物；較佳地，來源于人、小鼠；更佳 地，來源于人。
[0011] 本發(fā)明第二方面，提供了一種用于治療川崎病的藥物組合物，所述的藥物組合物 包括（a)PPP3CC基因、蛋白、或其促進劑；和（b)藥學(xué)上可接受的載體。
[0012] 本發(fā)明第三方面，提供了一種篩選制備PPP3CC促進劑的候選化合物的方法，包括 以下步驟：
[0013] (Pl)在測試組中，向ITPKC表達量和/或活性低的細胞培養(yǎng)體系中，添加測試化合 物，并觀察ITPKC的表達量和/或活性；在對照組中，向相同細胞培養(yǎng)體系中不添加測試化 合物，并觀察ITPKC的表達量和/或活性；
[0014] 其中，如果測試組中ITPKC表達量和/或活性大于對照組，則表明測試化合物是可 用于制備PPP3CC促進劑的化合物。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，還包括步驟（p2):對步驟（pi)中獲得的候選化合物進一步測定 其對IP3 (inositol 1，4, 5-triphosphate，IP3,三磷酸肌醇）表達量的抑制作用。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的步驟（p2)中，若測試化合物對IP3的表達量有顯著抑制 效果，則認(rèn)為測試化合物是可用于制備PPP3CC促進劑的化合物。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的顯著抑制為表達量下降至少20-50%。
[0018] 本發(fā)明第四方面，提供了一種PPP3CC抑制劑的用途，用于制備降低ITPKC表達量 和/或活性的制劑。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括PPP3CC抗體、反義核酸、SiRNA以及PPP3CC活 性抑制劑。
[0020] 本發(fā)明第五方面，提供了一種ITPKC穩(wěn)定劑的用途，用于制備治療川崎病的藥物。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的ITPKC穩(wěn)定劑包括PPP3CC基因、蛋白、或其促進劑。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種治療川崎病的方法，給需要的對象施用有效劑量的如本發(fā)明 第二方面所述的藥物組合物。
[0023] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1顯示了 PPP3CC和ITPKC在模式生物酵母中存在相互作用。
[0025] 圖IA顯示了 LacZP半乳糖苷酶報告基因檢測，其中a.pDBLeu_ITPKC+pPC86共 轉(zhuǎn)化酵母；b. pDBLeu+pPC86-PPP3CC 共轉(zhuǎn)化酵母；c. pDBLeu-ITPKC+pPC86-PPP3CC 共轉(zhuǎn)化酵 母；Control A-E :酵母對照菌株A-E，由弱到強，E為最強。
[0026] 圖IB顯示了 HIS3報告基因檢測，其中a. pDBLeu_ITPKC+pPC86共轉(zhuǎn)化酵母； b. pDBLeu+pPC86-PPP3CC 共轉(zhuǎn)化菌株；c. pDBLeu-ITPKC+pPC86-PPP3CC 共轉(zhuǎn)化菌株；酵母對 照菌株A-E。
[0027] 圖2顯示了 PPP3CC與ITPKC在體內(nèi)體外均存在相互作用。
[0028] 圖2A顯示了 GST-Pul I Down實驗驗證PPP3CC與ITPKC在原核大腸桿菌體外表達 水平上存在相互作用。其中，上層條帶：重組表達的GST-PPP3CC和GST的空載蛋白均從大 腸桿菌中純化得到；下層條帶：重組表達的GST-PPP3CC能夠與ITPKC蛋白結(jié)合，但空載蛋 白不能與ITPKC結(jié)合。
[0029] 圖2B顯示了過表達的PPP3CC蛋白與ITPKC蛋白在HEK293T細胞中相互結(jié)合， HA-ITPKC能夠與Myc-ITPKC免疫共沉淀，通過Myc抗體沉淀，HA抗體檢測；而不能與Myc空 載免疫共沉淀。
[0030] 圖2C顯示了 PPP3CC蛋白與ITPKC蛋白在細胞內(nèi)源表達水平上存在相互作用；在 不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達的條件下，通過anti-PPP3CC特異性抗體免疫沉淀，anti-ITPKC檢測，結(jié) 果表明ITPKC可與PPP3CC在內(nèi)源表達水平上相互結(jié)合。
[0031] 圖2D顯示了 PPP3CC與ITPKC共定位于細胞質(zhì)中，綠色熒光表征PPP3CC蛋白，紅 色熒光表征ITPKC蛋白。
[0032] 圖3顯示了 PPP3CC促進ITPKC的表達水平。
[0033] 圖3A顯示了通過轉(zhuǎn)染pCMV-Myc_PPP3CC，過表達PPP3CC可以提高ITPKC的蛋白表 達量。
[0034] 圖3B顯示了過表達PPP3CC不影響ITPKC的mRNA的表達水平（*表示p〈0. 05，** 表示 p〈0. 01)。
[0035] 圖3C顯示了通過轉(zhuǎn)染siRNAs，下調(diào)PPP3CC的表達量，ITPKC的蛋白表達量也隨之 減低。
[0036] 圖3D顯示了 siRNAs干擾下調(diào)PPP3CC，并不影響ITPKC在mRNA水平上表達水平， (** 表示 p〈0. 01)。
[0037] 圖4顯示了 PPP3CC通過穩(wěn)定ITPKC的表達量調(diào)節(jié)IP3_Ca2+信號通路的活性。
[0038] 圖 4A 顯示了 PPP3CC 能過延長 ITPKC 蛋白半衰期，pCMV-Myc 或 pCMV-Myc_PPP3CC 分別轉(zhuǎn)染細胞，并用亞胺環(huán)己酮（cycloheximide CHX)和MG132(蛋白酶體抑制劑）處理， 處理時間如圖所示。Western blot檢測表明：PPP3CC能夠延長抑制ITPKC蛋白的衰減，延 長其半衰期。GAPDH蛋白作為檢測內(nèi)參。
[0039] 圖 4B. PPP3CC 抑制 ITPKC 的泛素化，Myc-PPP3CC，F(xiàn)LAG-ITPKC 和 HA-Ubiqutin(HA-Ub)共轉(zhuǎn)染細胞，且用MG132處理，如圖所示，PPP3CC過表達的細胞中， ITPKC偶聯(lián)泛素 Ub的量降低，表明PPP3CC能夠抑制ITPKC的泛素化。
[0040] 圖4C. PPP3CC抑制ITPKC的磷酸化水平，過表達PPP3CC的細胞中，ITPKC蛋白總 量增加，ITPKC的磷酸化水平降低。
[0041] 圖4D.PPP3CC能降低IP3在細胞中含量。分別在細胞中過表達Myc-PPP3CC或 siRNA干擾抑制PPP3CC表達，通過ELISA檢測IP3的含量。
[0042] 結(jié)果表明過表達PPP3CC能夠降低IP3的含量，反之依然，siRNA干擾抑制PPP3CC 后，IP3的含量上升。
[0043] 圖5顯示了 PPP3CC通過穩(wěn)定ITPKC蛋白抑制川崎病發(fā)病的模式圖。

【具體實施方式】
[0044] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，PPP3CC能夠在蛋白水平上穩(wěn) 定ITPKC的表達量，PPP3CC可能降低ITPKC的磷酸化水平，抑制其進入泛素化一蛋白酶體 降解途徑。因此PPP3CC及其表達產(chǎn)物可用于增加或增強ITPKC表達量和/或活性，從而治 療川崎病。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0045] PPP3CC
[0046] 在本發(fā)明中，術(shù)語"本發(fā)明蛋白"、"本發(fā)明多肽"、"PPP3CC蛋白"、"PPP3CC多肽" 可互換使用，都指具有人蛋白PPP3CC氨基酸序列的蛋白或多肽。應(yīng)理解，所述術(shù)語還包括 PPP3CC的活性片段和衍生物。
[0047] 在本發(fā)明中，術(shù)語"本發(fā)明基因"、"本發(fā)明多核苷酸"指編碼PPP3CC蛋白或其 活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。PPP3CC基因定位于細胞染色體 8p21.3，Genbank ID:5533。可用于本發(fā)明PPP3CC基因的序列之一如SEQ ID NO. :1所示， CDS為441-2006位，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0048] 如本文所用，術(shù)語"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來（如果是天然的物 質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純 化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化 的。
[0049] 如本文所用，"分離的PPP3CC蛋白或多肽"是指PPP3CC蛋白基本上不含天然與其 相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純 化PPP3CC蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。在本發(fā) 明中，PPP3CC蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0050] 本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多 肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0051] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0052] 編碼PPP3CC的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽 的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附加編碼序列）以及非 編碼序列。術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包 括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0053] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或 非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0054] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本 文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個 核苷酸，最好是至少1〇〇個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)（如PCR)以確定 和/或分離編碼PPP3CC蛋白的多核苷酸。
[0055] 本發(fā)明的人PPP3CC核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人 工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框 序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA 庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后 再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0056] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
[0057] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0058] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引 物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方 法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
[0059] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或PPP3CC蛋 白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
[0060] 通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組 的PPP3CC蛋白。一般來說有以下步驟：
[0061] (1).用本發(fā)明的編碼人PPP3CC蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷 酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；
[0062] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；
[0063] (3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0064] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人PPP3CC編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn) 錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組 技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表 達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0065] 此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0066] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
[0067] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞 如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、C0S、或293細胞的動物細胞等。
[0068] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgC12。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0069] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群螅煤线m的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
[0070] 在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié) 合。
[0071] ITPKC
[0072] 1，4, 5 三憐酸肌醇 3 激酶 C (1，4, 5-trisphosphate 3-kinase C，ITPKC)，Genbank ID :80271, ITPKC的cDNA如SEQ ID NO. :3所示，CDS :34-2085,以及其編碼的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. :4 所示（NP 079470.1)。
[0073] ITPKC是一種IP3磷酸激酶，其底物IP3是重要第二信使分子，可以刺激細胞內(nèi)儲 存的Ca2+釋放，并引起細胞外的Ca 2+進入胞內(nèi)，胞內(nèi)Ca2+濃度升高。胞內(nèi)Ca2+結(jié)合鈣調(diào)蛋白 并激活1丐調(diào)磷酸激酶，后者使得NFAT (nuclear factor of activated T cells,活化T細 胞核因子）去磷酸化，促進其進核并激活包括IL-2在內(nèi)的若干免疫反應(yīng)相關(guān)的基因表達。
[0074] ITPKC能夠?qū)P3磷酸化成為IP4,從而阻斷了 IP3所開啟的IP3_Ca2+通道，抑制 了鈣離子濃度的升高，阻斷了胞質(zhì)中的鈣離子通過與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，抑制激活 鈣調(diào)磷酸酶活化，進而抑制了 NFAT的去磷酸化及下游基因的轉(zhuǎn)錄激活。
[0075] 當(dāng)ITPKC表達量下降時，IP3分子積累增多，細胞內(nèi)的IP3_Ca2+通路被激活，導(dǎo)致 自身免疫反應(yīng)的亢進，最終造成川崎病的發(fā)病。
[0076] ITPKC缺失或功能異常的原因而言，目前多為與基因多態(tài)性相關(guān)的推測，對于具體 的致病分子機制尚不清楚。
[0077] 研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化可以使底物蛋白迅速經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降 解，磷酸化使得泛素化機器能夠識別磷酸化底物并對其進行泛素化標(biāo)記，從而啟動蛋白降 解。
[0078] 促進劑和藥物組合物
[0079] 利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與PPP3CC蛋白發(fā)生相互作用 的物質(zhì)，尤其是促進劑等。
[0080] 本發(fā)明PPP3CC蛋白的促進劑，當(dāng)在治療上進行施用（給藥）時，可促進PPP3CC蛋 白的表達和/或活性，進而抑制ITPKC的泛素化降解。通常，可將這些促進劑配制于無毒的、 惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管 pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過 常規(guī)途徑進行給藥，其中包括（但并不限于）：瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局 部給藥。
[0081] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明PPP3CC蛋白或其 促進劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可 以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行 制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、 溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微 克-10毫克/千克體重。
[0082] 篩選方法
[0083] 本發(fā)明還提供了基于PPP3CC進行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響（促 進）PPP3CC表達或活性的化合物，然后對篩選出的化合物進一步測試其對ITPKC的表達和 /或活性有無抑制作用。
[0084] 具體的步驟為：
[0085] (pi)在測試組中，向ITPKC表達量和/或活性低的細胞培養(yǎng)體系中，添加測試化合 物，并觀察ITPKC的表達量和/或活性；在對照組中，向相同細胞培養(yǎng)體系中不添加測試化 合物，并觀察ITPKC的表達量和/或活性；
[0086] 其中，如果測試組中ITPKC表達量和/或活性大于對照組，則表明測試化合物是可 用于制備PPP3CC促進劑的化合物。
[0087] 以及任選的（p2):對步驟（pi)中獲得的候選化合物進一步測定其對IP3表達量 的抑制作用，其中，若測試化合物對IP3的表達量有顯著抑制效果，則認(rèn)為測試化合物是可 用于制備PPP3CC促進劑的化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的顯著抑制為表達量下降至少 20-50%〇
[0088] 本發(fā)明還提供了一種ITPKC穩(wěn)定劑的用途，用于制備治療川崎病的藥物。在另一 優(yōu)選例中，所述的ITPKC穩(wěn)定劑包括PPP3CC基因、蛋白、或其促進劑。
[0089] 此外，本發(fā)明還提供了一種PPP3CC抑制劑的用途，用于制備降低ITPKC表達量和 /或活性的制劑。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括PPP3CC抗體、反義核酸、SiRNA以及PPP3CC活 性抑制劑。
[0091] 本發(fā)明所述PPP3CC的抑制劑可用于川崎病動物模型的制備以及細胞研究。
[0092] 本發(fā)明的有益效果
[0093] 1.本發(fā)明PPP3CC基因或蛋白或其促進劑可以有效地抑制ITPKC蛋白的降解，從而 提高ITPKC表達量和/或活性。
[0094] 2.本發(fā)明PPP3CC基因或蛋白或其促進劑可以用于治療川崎病。
[0095] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0096] 實施例1酵母雙雜交篩選獲得PPP3CC蛋白
[0097] 利用酵母雙雜交系統(tǒng)，我們對ITPKC(GeneID :80271)的作用蛋白進行了篩選成人 肝cDNA酵母雙雜交文庫。經(jīng)測序及BLAST分析后發(fā)現(xiàn)其中含有PPP3CC (GeneID :5533)基 因的片段。
[0098] 為確證ITPKC與PPP3CC在酵母內(nèi)的相互作用，將PPP3CC全長基因裝入pPC86載 體中，與PDBLeu-ITPKC回轉(zhuǎn)酵母MaV203進行驗證。
[0099] 結(jié)果如圖1所示，可見ITPKC與PPP3CC在酵母中存在相互作用。
[0100] 實施例2 ITPKC和PPP3CC在體內(nèi)外均具有相互作用
[0101] 圖2A顯示了 GST-Pul I Down實驗驗證PPP3CC與ITPKC在原核大腸桿菌體外表達 水平上存在相互作用。其中，上層條帶：重組表達的GST-PPP3CC和GST的空載蛋白均從大 腸桿菌中純化得到；下層條帶：重組表達的GST-PPP3CC能夠與ITPKC蛋白結(jié)合，但空載蛋 白不能與ITPKC結(jié)合。
[0102] 為了在細胞水平上驗證ITPKC和PPP3CC的相互作用，構(gòu)建了 pCMV-HA-ITPKC和 p⑶EF-Myc-PPP3CC真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，進行免疫共沉淀實驗。
[0103] 利用Myc單克隆抗體將細胞裂解液中的Myc_PPP3CC蛋白沉淀下來的泳道中，用 anti-HA抗體檢測到HA-ITPKC蛋白；而只轉(zhuǎn)染Myc空載質(zhì)粒和HA-ITPKC蛋白的體系中，使 用anti-Myc抗體進行免疫沉淀后，無法檢測到HA-ITPKC蛋白（圖2B)。表明ITPKC和PPP3CC 在細胞中確實存在特異的相互作用。
[0104] 我們進一步驗證細胞內(nèi)源表達水平下，ITPKC和PPP3CC是否存在相互作用。結(jié) 果顯示，當(dāng)使用anti-PPP3CC的特異性抗體沉淀細胞裂解液中的內(nèi)源性PPP3CC蛋白時， 可以利用anti-ITPKC的抗體檢測到內(nèi)源性ITPKC蛋白；而在同樣的裂解液中加入非特異 anti-IgG抗體時，則不能檢測到內(nèi)源性ITPKC蛋白（圖2C)。結(jié)果表明，在內(nèi)源表達水平下， 細胞中的ITPKC和PPP3CC之間存在相互作用。
[0105] 實施例3 ITPKC和PPP3CC在細胞內(nèi)的熒光共定位
[0106] 為了解ITPKC和PPP3CC在細胞內(nèi)的定位情況，把PPP基因構(gòu)建到pEGFP-Cl質(zhì)粒 載體上。將PEGFP-C1-PPP3CC轉(zhuǎn)染HeLa細胞，并對ITPKC蛋白進行免疫熒光標(biāo)記。熒光顯 微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，GFP-PPP3CC蛋白主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)；ITPKC蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中 廣泛分布；它們能共定位于細胞質(zhì)中，如圖2D所示。因此，ITPKC和PPP3CC在細胞內(nèi)的共 定位提示其在空間上有相互作用的可能性。
[0107] 實施例4 PPP3CC能夠促進ITPKC的蛋白表達
[0108] 在實施例2中，轉(zhuǎn)染了 Myc_PPP3CC表達載體的細胞，ITPKC的蛋白表達量高于 對照。對應(yīng)的當(dāng)通過siRNA干擾了 PPP3CC的表達后，ITPKC的蛋白表達量也下降；而在 mRNA水平上，PPP3CC的表達量改變不影響ITPKC的轉(zhuǎn)錄水平，如圖3所示；進一步通過 eyeloheximide (CHX)處理細胞，中止其蛋白翻譯，檢測PPP3CC對ITPKC蛋白半衰期的影響。 [0109] 在轉(zhuǎn)染空載的細胞中，由于CHX蛋白阻斷了蛋白的翻譯，ITPKC在兩小內(nèi)逐步 減少，而轉(zhuǎn)染了 PPP3CC的細胞中ITPKC的減少程度降低，且ITPKC的表達量降低能夠被 MG132(蛋白酶體抑制劑）所抑制，提示其降解可能是通過了蛋白酶體途徑，如圖4A所示。 以上結(jié)果顯示PPP3CC對于ITPKC蛋白量的影響發(fā)揮在翻譯后修飾，促進了其蛋白穩(wěn)定性， 抑制了 ITPKC的降解。
[0110] 實施例5 PPP3CC抑制了 ITPKC的泛素化降解
[0111] ITPKC的降解可以被MG132所阻斷，提示ITPKC可能是通過泛素化蛋白酶體途徑被 降解的，為了研究PPP3CC是否通過抑制其泛素化降解而發(fā)揮穩(wěn)定其蛋白表達量的作用，在 HEK293T中檢測PPP3CC過表達對ITPKC泛素化水平的影響。
[0112] 在 H293T 細胞中，共轉(zhuǎn)染 FLAG-ITPKC，Myc-PPP3CC 和 HA-taged ubiquitin (HA-Ub)，并用MG132刺激，結(jié)果如圖4B所示，在轉(zhuǎn)染了 Myc_PPP3CC的實驗組中， ITPKC蛋白的泛素化程度降低。
[0113] 結(jié)果顯示PPP3CC能夠抑制ITPKC的泛素化水平，從而阻止其降解。
[0114] 實施例6 PPP3CC降低ITPKC的磷酸化水平，阻止其進入泛素-蛋白酶體降解途徑
[0115] 由于PPP3CC的磷酸酯酶活性，本實施例檢測其是否能夠影響ITPKC的磷酸化水 平。
[0116] 在細胞中梯度轉(zhuǎn)染Myc-PPP3CC，檢測ITPKC和p-ITPKC的表達量變化。
[0117] 結(jié)果如圖4C所示，隨著PPP3CC表達量的上升，ITPKC蛋白量增加，而其磷酸化程 度降低。
[0118] 由上可見，隨著PPP3CC表達量的增加，ITPKC表達量增加，而p-ITPKC的量減少。 以上結(jié)果提示我們PPP3CC可能抑制了 ITPKC的磷酸化。
[0119] 實施例7 PPP3CC可能通過ITPKC負調(diào)控胞內(nèi)IP3的表達量
[0120] 分別轉(zhuǎn)染Myc_PPP3CC和siRNAs，上調(diào)或下調(diào)細胞中PPP3CC的表達量，然后通過 ELISA的方法檢測胞漿中IP3的含量。
[0121] 結(jié)果如圖4D所示：在過表達PPP3CC的細胞中其胞漿中所含IP3量降低，反之亦 然，在RNAi抑制PPP3CC表達的實驗組中，胞漿中IP3含量增高。
[0122] 由上可見，在過表達組中，上調(diào)PPP3CC的表達量，胞漿中的IP3含量下降；在RNAi 組中，下降PPP3CC的表達量，胞漿中的IP3相對于Mock和SiNC上升。提示我們PPP3CC的 確可以影響胞漿中IP3的含量。PPP3CC可能通過影響IP3的含量，影響IP3-Ca 2+信號傳導(dǎo)， 如模式圖所示（圖5)。
[0123] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種|丐調(diào)神經(jīng)磷酸酶3催化亞基Y亞型蛋白（protein phosphatase 3, catalytic subunit, gamma isozyme, PPP3CC)基因、蛋白、或其促進劑的用途，其特征在于，用于制備 (1)提高1，4,5三磷酸肌醇3激酶0(1，4,541^?11〇8?11&七6 3-1^11&86(：，打?1(〇的表達量 和/或活性；和/或（ii)治療川崎?。↘awasaki disease)的藥物組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物包括（a)PPP3CC基因、蛋 白、或其促進劑；和（b)藥學(xué)上可接受的載體。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促進劑包括PPP3CC的基因表達產(chǎn)物、 促進型miRNA、促進型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進型靶向小分子化合物。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PPP3CC來源于哺乳動物。
5. -種用于治療川崎病的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括（a) PPP3CC基因、蛋白、或其促進劑；和（b)藥學(xué)上可接受的載體。
6. -種篩選制備PPP3CC促進劑的候選化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟： (Pl)在測試組中，向ITPKC表達量和/或活性低的細胞培養(yǎng)體系中，添加測試化合物， 并觀察ITPKC的表達量和/或活性；在對照組中，向相同細胞培養(yǎng)體系中不添加測試化合 物，并觀察ITPKC的表達量和/或活性； 其中，如果測試組中ITPKC表達量和/或活性大于對照組，則表明測試化合物是可用于 制備PPP3CC促進劑的化合物。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括步驟（p2):對步驟（pi)中獲得的候 選化合物進一步測定其對IP3(inositol l，4,5-triphosphate，IP3,三磷酸肌醇）表達量 的抑制作用。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步驟（p2)中，若測試化合物對IP3的 表達量有顯著抑制效果，則認(rèn)為測試化合物是可用于制備PPP3CC促進劑的化合物。
9. 一種PPP3CC抑制劑的用途，其特征在于，用于制備降低ITPKC表達量和/或活性的 制劑。
10. -種ITPKC穩(wěn)定劑的用途，其特征在于，用于制備治療川崎病的藥物。
【文檔編號】A61P27/02GK104208720SQ201310217292
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月31日
【發(fā)明者】霍克克, 李璞, 林穎 申請人:霍克克, 李璞