一種攜帶Neuritin基因的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮變性藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程和視網(wǎng)膜損傷【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種攜帶Neuritin基因的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮變性藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建的一種攜帶Neuritin基因的慢病毒，用于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞變性動(dòng)物模型，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，證實(shí)Neuritin慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)染大鼠RPE并高表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)視網(wǎng)膜的RPE、視細(xì)胞等并改善功能恢復(fù)。
【專利說(shuō)明】-種攜帶Neurit in基因的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜色素 上皮變性藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和視網(wǎng)膜損傷【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種攜帶Neuritin基因 的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮變性藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE)位于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間，具有吞噬、屏障及離子轉(zhuǎn)運(yùn) 等多種功能。RPE變性是一組以視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞和RPE的漸進(jìn)性凋亡以及死亡為結(jié)局， 引起視力下降和視野缺損等為共同表現(xiàn)的疾病，具有遺傳傾向性，現(xiàn)已經(jīng)有100多個(gè)的相 關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)。該病發(fā)病率較高，約1/4000,是致盲性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。（參考文獻(xiàn)[1] Sung CH，Chuang JZ. The cell biology of vision. J Cell Biol2010; 190:953-63)。而且目前 對(duì)這些疾病還沒(méi)有有效的治療措施，幾乎不可避免的致盲，引起人們的廣泛關(guān)注和研究。另 夕卜，年齡相關(guān)性黃斑變性，也稱老年黃斑變性（AMD)，是當(dāng)前中老年人致盲的主要原因，至今 仍未找到一種能阻止本病病程進(jìn)展的確切有效的治療方法。黃斑區(qū)RPE細(xì)胞損傷往往被認(rèn) 為是其始動(dòng)環(huán)節(jié)，受損RPE對(duì)視細(xì)胞外界盤(pán)膜吞噬消化功能下降，最終導(dǎo)致黃斑變性發(fā)生。 越來(lái)越多的眼底病與RPE細(xì)胞凋亡有關(guān)，如遺傳性外層視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良以及視網(wǎng)膜移植術(shù) 后等。因此，抑制RPE細(xì)胞凋亡就成為治療上述疾病的關(guān)鍵。
[0003] 視網(wǎng)膜色素上皮變性（Retinitis pigmentosa, RP)的治療，目前已出現(xiàn)針對(duì)致病 基因的基因治療、針對(duì)RP發(fā)生機(jī)制的藥物治療（如干預(yù)視蛋白循環(huán)通路以減少代謝產(chǎn)物的 堆積，阻滯Ca2+通道等）、神經(jīng)保護(hù)治療（如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，抗凋亡因子等）以及旨在恢復(fù) 視功能的細(xì)胞、組織移植或人工視覺(jué)等多種方法，但尚無(wú)一種方法能夠完全阻止RP發(fā)展或 恢復(fù)受損視功能。（參考文獻(xiàn)[2]Hamel C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis， 2006,1 :40.)。由于RP具有顯著的遺傳異質(zhì)性，從病因?qū)W角度治療RP難度較大，但神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子治療RP的療效受致病基因差異的影響較小，因而其對(duì)RP變性視網(wǎng)膜組織的神經(jīng)保 護(hù)效應(yīng)一直成為研究熱點(diǎn)。（參考文獻(xiàn)[1]張湘，李根林.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療視網(wǎng)膜色素變 性的研究進(jìn)展.中華眼科雜志2009年9月第45卷第9期：855-859.)
[0004] 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可直接作用于RPE、光感受器細(xì)胞或間接作用于視網(wǎng)膜其他細(xì)胞 進(jìn)而促光感受器細(xì)胞存活。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor, NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、睫狀神經(jīng) 營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、喊性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF)、色素上皮源性生長(zhǎng)因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，均顯示可增強(qiáng)RPE增殖、減少 RPE凋亡，增加光感受器細(xì)胞存活，緩解視功能減退，部分神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子聯(lián)合使用還具有 協(xié)同作用。但神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的應(yīng)用受到一定限制，主要原因是：（1)具有生物活性的生長(zhǎng) 因子半衰期短，而且局部使用時(shí)易被稀釋，難以保持有效的濃度，需反復(fù)多次給藥或增加 使用劑量；（2)提取或基因重組的生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴；（3)已經(jīng)證明內(nèi)源性合成的蛋白與 外源重組蛋白相比，生物活性更高。因此，目前人們主要致力于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因轉(zhuǎn) 移治療 RP。（參考文獻(xiàn)[3]Brian Rossmiller，Haoyu Mao, Alfred S.Lewin.Review:Gene therapy in animal models of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Molecular Vision2012;18:2479-2496.)
[0005] 如NGF能拮抗神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸毒性、缺氧損傷，能抑制視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞凋亡的發(fā) 生。它還通過(guò)刺激BDNF、bFGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等因子的分泌而對(duì) 遺傳性視網(wǎng)膜色素變性動(dòng)物模型的光感受器起保護(hù)作用。（參考文獻(xiàn)[4]Lenzi L，Coassin M, Lambiase A, Bonini S, Amendola T, Aloe L. Effect of exogenous administration of nerve growth factor in the retina of rats with inherited retinitis pigmentosa. Vision Res. 2005Jun; 45 (12) :1491-500.)神經(jīng)生長(zhǎng)因子腺病毒載體注射入視網(wǎng)膜下腔，能 轉(zhuǎn)染所有RPE，使遺傳性視網(wǎng)膜色素變性RCS大鼠視細(xì)胞得以營(yíng)救，使其凋亡的發(fā)生推遲。 (參考文獻(xiàn)[5]劉世全，張薇，賈東輝，等.腺病毒介導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)遺傳性視網(wǎng)膜變 性RCS大鼠視細(xì)胞的營(yíng)救.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000, 32 (5) : 403-407.)
[0006] BDNF對(duì)視網(wǎng)膜色素變性疾病的有效性己得到了證實(shí)。在體電穿孔輔助BDNF 基因轉(zhuǎn)染至RPE和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，能減少RCS大鼠 RPE凋亡，延緩其視網(wǎng)膜色素變性的 病程。（參考文獻(xiàn)[6]Zhang Μ, Mo X，F(xiàn)ang Y, Guo W，Wu J, Zhang S, Huang Q. Rescue of photoreceptors by BDNF gene transfer using in vivo electroporation in the RCS rat of retinitis pigmentosa. Curr Eye Res. 2009Sep;34(9):791-9.)
[0007] GDNF治療RP動(dòng)物模型可維持光感受器細(xì)胞存活，并保存視功能。Ohnaka等用GDNF 腺相關(guān)病毒載體能轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜退行性變小鼠 rdlO的RPE和視細(xì)胞并高表達(dá)，能有效減緩視 細(xì)胞變性的程度。（參考文獻(xiàn)[7]0hnaka M，Miki K, Gong YY, Stevens R，Iwase T，Hackett SF, Campochiaro PA. Long-term expression of glial cell line-derived neurotrophic factor slows,but does not stop retinal degeneration in a model of retinitis pigmentosa. J Neurochem. 2012Sep;122(5):1047-53.)
[0008] bFGF是公認(rèn)的光感受器存活因子，能夠挽救光感受器的變性，恢復(fù)RPE細(xì)胞吞 噬功能，治療RP。RCS (royal college of surgeons)鼠是公認(rèn)的遺傳性視網(wǎng)膜病變動(dòng) 物模型。RCS鼠的RPE細(xì)胞對(duì)于光感受器外節(jié)盤(pán)膜的吞噬功能缺陷，bFGF在7?10d 的RCS鼠 RPE細(xì)胞的表達(dá)減少。對(duì)RCS鼠原代培養(yǎng)的RPE，加入bFGF后能恢復(fù)細(xì)胞的 吞噬功能。（參考文獻(xiàn)[8]McLaren MJ，Inana G. Inherited retinal degeneration: basic FGF induces phagocytic competence in cultured RPE cells from RCS rats. FEBS Lett，1997, 412:21-29.)將牛bFGF重組腺相關(guān)病毒載體注射到視網(wǎng)膜變性轉(zhuǎn) 基因鼠的視網(wǎng)膜下腔，提高了眼大量光感受器細(xì)胞存活，降低了光感受器的變性機(jī)率， 并且沒(méi)有觀察到顯著的炎癥反應(yīng)和新生血管化。（參考文獻(xiàn)[9]Lau D，McGee LH，Zhou S, Rendahl KG, Manning WC, Escobedo JA, Flannery JG. Retinal degeneration is slowed in transgenic rats by AAV-mediated delivery of FGF-2. Invest Ophthalmol Vis Sci. 20000ct;41 (11):3622-33.)
[0009] 猿猴慢病毒為載體介導(dǎo)PEDF轉(zhuǎn)基因治療RCS大鼠，能轉(zhuǎn)染RPE并高表達(dá)PEDF，減 少光感受器細(xì)胞凋亡，并可維持視功能。（參考文獻(xiàn)[l0]Miyazaki M，Ikeda Y，Yonemitsu Y，Goto Y，Sakamoto Τ，Tabata Τ，Ueda Υ，Hasegawa Μ，Tobimatsu S，Ishibashi T，Sueishi K.Simian lentiviral vector-mediated retinal gene transfer of pigment epithelium-derived factor protects retinal degeneration and electrical defect in Royal College of Surgeons rats. Gene Ther. 2003Aug;10 (17):1503-11.)
[0010] 目前，以腺相關(guān)病毒為載體的轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞包囊技術(shù)作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的給藥 途徑在多種RP動(dòng)物模型上取得較好療效，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與針對(duì)致病基因的病因?qū)W治療 和（或）細(xì)胞移植技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可能獲得優(yōu)劣互補(bǔ)、相得益彰的效果?；蛑委煹某霈F(xiàn)， 給我們的研究帶來(lái)了新的曙光，但基因治療存在病毒載體潛在安全性等問(wèn)題。慢病毒載 體具有可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組能長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小，適于 體內(nèi)基因治療，已批準(zhǔn)進(jìn)行臨床研究。慢病毒載體較其他病毒載體，特別易于轉(zhuǎn)染RPE和 Mllller細(xì)胞。（參考文獻(xiàn)[ll]Kostic C，Chiodini F，Salmon P，Wiznerowicz M，Deglon N，et al.Activity analysis of housekeeping promoters using self-inactivating lentiviral vector delivery into the mouse retina. Gene Ther，2003, 10:818 - 82L 參 考文獻(xiàn)[12]Mats Hellstr5m and Alan R. Harvey. Retinal Ganglion Cell Gene Therapy and Visual System Repair. Current Gene Therapy, 2011, 11, 116-131.)
[0011] Neuritin(又名CPG15)是Nedivi等1993年通過(guò)構(gòu)建海人藻酸激活型大鼠海馬齒 狀回cDNA文庫(kù)得到的一個(gè)基因。人類的Neuritin基因位于染色體6P2513,全長(zhǎng)2072bp， 開(kāi)放讀碼框?yàn)?26bp，表達(dá)的蛋白含有142個(gè)氨基酸，其中第1?27個(gè)氨基酸為信號(hào)肽， 第116?142個(gè)氨基酸為糖基磷脂酰肌醇（glycolsylphosphatidlinositol，GPI)錨定位 點(diǎn)。人類與鼠類、爪蟾的Neuritin基因經(jīng)同源性比較分析分別為98%、88%，具有高度的保 守性，提示Neuritin在不同物種胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。成熟的Neuritin蛋 白是小分子量的糖蛋白，以可溶性和膜蛋白兩種形式存在，膜蛋白以GPI錨定位點(diǎn)錨定在 細(xì)胞膜上。（參考文獻(xiàn)[13]Loebrich S，Nedivi E. The function of activity-regulated genes in the nervous system. Physiol Rev. 2009, 89 (4) :1079-103.參考文獻(xiàn)[14]Leslie JH, Nedivi E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Prog Neurobiol, 2011, 94:223 - 237.)
[0012] Neuritin在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)、調(diào)節(jié)及作用。Neuritin高表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)育 時(shí)主要在新大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球，成年后僅表達(dá)在發(fā)生結(jié)構(gòu)改變并與神經(jīng)活動(dòng)密切相 關(guān)的組織，如海馬、嗅球、小腦蒲肯野細(xì)胞。Neuritin是活動(dòng)依賴性表達(dá)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子（NTF)。神經(jīng)活動(dòng)可誘導(dǎo)Neuritin蛋白的表達(dá)。生理性刺激如光刺激、觸覺(jué)刺激以及 電刺激可誘導(dǎo)Neuritin的表達(dá)，促進(jìn)樹(shù)突和軸突的生長(zhǎng)和突觸成熟，調(diào)節(jié)突觸回路的形 成?而眾多 NTF 如 NGF (參考文獻(xiàn)[15]Karamoysoyli E，Burnand RC，Tomlinson DR，et al. Neuritin mediates nerve growth factor-induced axonal regeneration and is deficient in experimental diabetic neuropathy. Diabetes，2008,57 (1):181-189.)、 BDNF (參考文獻(xiàn)[16]Naeve GS，Ramakrishnan M，Kramer R，et al. Neuritin:a gene induced by neural activity and neurotrophins that promotes neuritogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A，1997,94(6) :2648-2653.)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3 (NT-3)、神 經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF)(參考文獻(xiàn)[17]Pahnke J，Mix E，Knoblich R，et al.Overexpression of glial cell line-derived neurotrophic factor induces genes regulating migration and differentiation of neuronal progenitor cells. Exp Cell Res，2004, 297(2) :484-494.)等均能單獨(dú)誘導(dǎo) Neuritin 蛋白的表達(dá)，Neuritin 還是介導(dǎo)這些NTF發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用（促進(jìn)神經(jīng)元存活和突起生長(zhǎng)）的關(guān)鍵下游因 子。Neuritin定位于神經(jīng)元胞體和軸突，在軸突呈點(diǎn)狀分布，以細(xì)胞內(nèi)囊泡形式分泌至 細(xì)胞表面經(jīng)GPI錨定在細(xì)胞膜上，通過(guò)募集AMPA受體到突觸來(lái)促進(jìn)突觸成熟，促進(jìn)突 觸后樹(shù)突樹(shù)的發(fā)育。在發(fā)育期間，Neuritin還可阻止神經(jīng)祖細(xì)胞ca SpaSe3的激活而 免于凋亡，能維持神經(jīng)元的存活（參考文獻(xiàn)[18]Putz U, Harwell C，Nodivi E.Soluble CPG15expressed during early development rescues cortical progenitors from apoptosis. Nat Neurosci, 2005, 8 (3) : 322-331.)。在體外培養(yǎng)神經(jīng)兀，Neuritin 富 集于軸突伸出突起處和生長(zhǎng)錐處，旁分泌促進(jìn)鄰近神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)(參考文獻(xiàn)[19] Cantallops I, Cline HT. Rapid activity-dependent delivery of the neurotrophic protein CPG15 to the axon surface of neurons in intact Xenopus Tadpoles. Dev Neurobiol, 2008, 68:744 - 759. )〇
[0013] Neuritin在視覺(jué)系統(tǒng)中主要分布在視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、外側(cè)膝狀體、視皮層及視上 丘。在視網(wǎng)膜，Neuritin mRNA僅表達(dá)于RGC中。Nedivi等發(fā)現(xiàn)Neuritin在大鼠視覺(jué)系統(tǒng) 發(fā)育過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)變化，先后高表達(dá)于外側(cè)膝狀體和視皮層，并與眼優(yōu)勢(shì)柱的形成有關(guān)。通 過(guò)光刺激可以誘導(dǎo)Neuritin在成年大鼠視皮層的表達(dá)。提示Neuritin在視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育和 功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
[0014] Neuritin在神經(jīng)系統(tǒng)傷后表達(dá)的變化。大鼠腦彌漫性軸索損傷(參考文獻(xiàn)[20] 賀亞龍，賀曉生，章翔，等.候選可塑性相關(guān)基因15在大鼠腦彌漫性軸索損傷中的表達(dá).中 華神經(jīng)外科雜志，2010, 26 (2) :186-188.)、小鼠局部腦缺血（[21]Han Y，Chen X，Shi F，et al. CPG15, a new factor upregulated after ischemic brain iniury contributes to neuronal network reestablishiment after glutamate-induced injury.J Neurotrauma, 2007, 24:722-731·)、大鼠脊髓損傷（參考文獻(xiàn)[22]Di Giovanni S,Faden AI, Yakovlev A, et al. Neuronal plasticity after spinal cord injury:identification of a gene cluster driving neurite outgrowth. FASEB J, 2005. 19, 153-154.)后，腦或 脊髓內(nèi)Neuritin表達(dá)增強(qiáng)。席紹松、黎興毅等蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)管注入外源性Neuritin,能 促進(jìn)大鼠急性脊髓損傷(改良Allen打擊法）后傷區(qū)軸突再生相關(guān)蛋白神經(jīng)絲蛋白200及 生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43 (growth associated protein 43, GAP-43)的表達(dá)，并能促進(jìn)大鼠后肢運(yùn) 動(dòng)功能的恢復(fù)(參考文獻(xiàn)[23]席紹松，劉維鋼，張紅，等.Neuritin蛋白對(duì)大鼠急性脊 髓損傷后神經(jīng)元軸突再生的作用·中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2009, 23 (10) :1219-1223.)。 而Sharma等在大鼠面神經(jīng)損傷后的面神經(jīng)核神經(jīng)元中，觀察到Neuritin表達(dá)略低于正 常。雄激素、電刺激促進(jìn)面神經(jīng)再生必須通過(guò)Neuritin才能發(fā)揮作用（參考文獻(xiàn)[24] Sharma N, Marzo SJ,Jones KJ,et al.Electrical stimulation and testosterone differentially enhance expression of regeneration-associated genes.Exp Neurol, 2010, 223:183 - 191.)。提示Neuritin在神經(jīng)系統(tǒng)的創(chuàng)傷修復(fù)和治療中具有重要 作用，極富應(yīng)用前景。
[0015] 由上可見(jiàn)，Neuritin錨在軸突生長(zhǎng)活躍區(qū)的細(xì)胞膜外或分泌至細(xì)胞外，與其他 NTF-樣具有促進(jìn)神經(jīng)元存活及其突起生長(zhǎng)和突觸成熟的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，特別是為眾多 NTF發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的關(guān)鍵的、共同的下游分子，在神經(jīng)系統(tǒng)包括視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育和功能 調(diào)節(jié)中至關(guān)重要，脊髓和視神經(jīng)損傷后早期的表達(dá)量顯著下調(diào)Neuritin，而同時(shí)軸突再生 夭折，推測(cè)Neuritin為影響神經(jīng)軸突內(nèi)在再生能力的關(guān)鍵和重要分子。
[0016] 本 申請(qǐng)人:長(zhǎng)期以來(lái)致力于Neuritin的相關(guān)研究，已于2013年1月30日申請(qǐng)了中 國(guó)專利CN201310043613. 9,發(fā)明名稱為"一種攜帶Neuritin基因的慢病毒及其在修復(fù)視神 經(jīng)損傷中的應(yīng)用"，并于2013年5月17日申請(qǐng)了中國(guó)專利CN201310182950. 6,發(fā)明名稱為 "一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關(guān)病毒及其在修復(fù)視神經(jīng)損傷中的應(yīng)用"。
[0017] 目前，尚未見(jiàn)Neuritin在RP后表達(dá)變化及作用的研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶Neuritin基因的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜色素 上皮變性藥物(或稱治療RP藥物）中的應(yīng)用。
[0019] 本 申請(qǐng)人:認(rèn)為，雖然RPE細(xì)胞不是神經(jīng)細(xì)胞，但它是從神經(jīng)外胚層分化而來(lái)的，受 到眾多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用。Neuritin具有獨(dú)特的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，且為其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子和共同下游分子，有可能也能作用于RPE。
[0020] 基于RPE變性和凋亡是RP發(fā)生的始動(dòng)和關(guān)鍵因素；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療RP為當(dāng)今 研究熱點(diǎn)和有效方法之一；Neuritin為其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子和共同下 游分子。我們推測(cè)以Neuritin為靶點(diǎn)治療RP，較單一神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為靶點(diǎn)治療RP，可更強(qiáng) 地保護(hù)RPE，獲得更好的功能恢復(fù)。由于外源性Neuritin如同其他NTF -樣，在體內(nèi)半衰期 較短，玻璃體注射Neuritin基因重組慢病毒以轉(zhuǎn)染RPE，可使之持續(xù)高表達(dá)Neuritin,并可 觀察Neuritin長(zhǎng)期作用的效果。
[0021] 本發(fā)明的技術(shù)方案，主要是構(gòu)建Neuritin的慢病毒載體，并在RP動(dòng)物模型中 和體外培養(yǎng)的RPE受損細(xì)胞模型上，利用Neuritin的慢病毒載體感染RPE，觀察并探討 Neuritin基因治療RP的作用及機(jī)制，為臨床治療RP提供新的有力手段和理論基礎(chǔ)。
[0022] Neuritin基因，以下也稱NRN1基因或Nrnl基因。
[0023] 本發(fā)明的第一方面，是提供一種攜帶Neuritin基因的慢病毒載體，該慢病毒載體 是攜帶如SEQ ID NO: 1所示的Neuritin基因的DNA序列。
[0024] 所述的慢病毒載體選用Tronolab系統(tǒng)為四質(zhì)粒系統(tǒng)，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、 pMD2G和目的穿梭質(zhì)粒。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包裝所必須的元件， 目的穿梭質(zhì)粒含有目的基因（Nrnl)以及標(biāo)記基因紅色熒光蛋白（RFP)。較優(yōu)的，目的穿梭 質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入如SEQ ID NO: 1所示的Neuritin基因的DNA序列。
[0025] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種攜帶Neuritin基因的慢病毒載體的構(gòu)建方法，具 體步驟如下：
[0026] 1. Neuritin基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
[0027] 根據(jù) Neuritin (NRN1)基因（GenBank:BC002683. 2)設(shè)計(jì)并合成如下 PCR 引物：
[0028] NRN1-正向引物：5'-CGACGCGTATGGGACTTAAGTTGAAC-3'（SEQ ID N0:2);
[0029] NRN1-反向引物：5'-TTTGCGGCCGCTCAGAAGGAAAGCCA-3'（SEQ ID N0:3);
[0030] 使用PCR方法從含有NRN1基因 cDNA (155lbp，如SEQ ID NO: 1所示)克隆模板中 擴(kuò)增NRN1基因 CDS區(qū)；將慢病毒載體和目的基因分別雙酶切，純化酶切產(chǎn)物后與NRN1基因 PCR產(chǎn)物進(jìn)行定向連接或重組，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，對(duì)生長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行Nrnl基因 PCR 鑒定，PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆，證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。再對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的 克隆進(jìn)行測(cè)序和分析比對(duì)，比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好 的融合蛋白表達(dá)載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提，鈣轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，36-48小時(shí)后 通過(guò)熒光顯微鏡觀察融合蛋白R(shí)FP。
[0031] 2. Neuritin基因慢病毒包裝
[0032] 制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，四種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度 無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8小時(shí)更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)后，收集富 含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，感染Hela細(xì)胞后采 用倍比稀釋法檢測(cè)病毒滴度。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)慢病毒滴度的要求不同，生產(chǎn)過(guò)程中可過(guò) 濃縮得到不同滴度的慢病毒顆粒。
[0033] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種攜帶Neuritin基因的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜 色素上皮變性藥物(或稱治療RP藥物）中的應(yīng)用。
[0034] 所述的一種攜帶Neuritin基因的慢病毒，其Neuritin基因如SEQ ID NO: 1所示。
[0035] 所述的慢病毒載體選用Tronolab系統(tǒng)為四質(zhì)粒系統(tǒng)，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、 pMD2G和目的穿梭質(zhì)粒。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包裝所必須的元件， 目的穿梭質(zhì)粒含有目的基因（Nrnl)以及標(biāo)記基因紅色熒光蛋白（RFP)。較優(yōu)的，目的穿梭 質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入如SEQ ID NO: 1所示的Neuritin基因的DNA序列。
[0036] 攜帶Neurit in基因的慢病毒載體在制備治療RP藥物中的應(yīng)用，臨床上，具體可采 用玻璃體注射該藥物進(jìn)行RP的基因治療。
[0037] 本發(fā)明所述的一種攜帶Neuritin基因的慢病毒，用于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞變性 動(dòng)物模型，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，證實(shí)Neuritin慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)染大鼠 RPE并高表達(dá)， 進(jìn)而保護(hù)視網(wǎng)膜的RPE、視細(xì)胞等并改善功能恢復(fù)。
[0038] 本發(fā)明基于Neuritin獨(dú)特的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用及其在神經(jīng)創(chuàng)傷、疾病中的表達(dá)變化 和作用，以Neuritin為靶標(biāo)對(duì)RP進(jìn)行基因治療，以增強(qiáng)RP的內(nèi)在再生能力，改善其存活。 并推測(cè)其對(duì)RPE和視細(xì)胞這兩RP的關(guān)鍵細(xì)胞具有明顯的作用，從而達(dá)到甚至超過(guò)給予多種 NTF、或多種治療方法保護(hù)RPE的療效，為臨床治療RP提供有力的手段和理論依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1是Neuritin慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建圖；
[0040] 圖2是Neuritin慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜切片顯示慢病毒轉(zhuǎn)染色素上皮層 (A、B、C),其中（A)為DAPI染核，核為藍(lán)色；（B)箭頭示Neuritin慢病毒轉(zhuǎn)染色素上皮細(xì) 胞，呈紅色熒光；（C) A與B合并的照片。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明 范圍的限制。
[0042] 實(shí)施例1 :
[0043] 1. Neuritin基因慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建
[0044] ( 1)慢病毒表達(dá)載體及目的基因的酶切
[0045] 采用pLen〇-RIP (購(gòu)自Addgene公司）載體使用Not I、Mlu I進(jìn)行酶切，酶切后 的載體準(zhǔn)備載體構(gòu)建時(shí)使用（圖1)。以NRN1基因 CDS區(qū)的cDNA克隆為模板采用PCR擴(kuò)增 NRN1基因片段，產(chǎn)物使用Not I、Mlu I進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收載體及目的 基因 DNA。
[0046] (2)連接反應(yīng)
[0047] 將酶切后的慢病毒載體和NRN1基因的PCR產(chǎn)物按照表1中的反應(yīng)體系進(jìn)行連接 反應(yīng)。
[0048] 表1 :連接反應(yīng)體系
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種攜帶Neuritin基因的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮變性藥物中的應(yīng)用， 所攜帶的Neuritin基因如SEQ ID N0:1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種攜帶Neuritin基因的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜色素上 皮變性藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的慢病毒載體選用Tronolab系統(tǒng)，為四質(zhì)粒系統(tǒng) 由 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G 和目的穿梭質(zhì)粒；其中 pRsv-REV，pMDlg-pRRE 和 pMD2G 含 有病毒包裝所必須的元件，目的穿梭質(zhì)粒含有目的基因以及標(biāo)記基因紅色熒光蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種攜帶Neuritin基因的慢病毒在制備修復(fù)視網(wǎng)膜色素上 皮變性藥物中的應(yīng)用，其特征在于，目的穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入如SEQ ID N0:1所示的 Neuritin基因的DNA序列。
【文檔編號(hào)】A61P27/02GK104208721SQ201310219995
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月4日
【發(fā)明者】許家軍, 劉芳, 曹文珞, 藺海燕 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)