一種猴頭菌菌絲體提取物在制備抗直結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種猴頭菌菌絲體提取物在制備抗直結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。該提取物是將猴頭菌菌絲體經(jīng)兩次常溫閃式提取后再減壓濃縮，最后真空冷凍干燥而制備出來的。該提取物具有抗直結(jié)腸癌的作用，可用于制備抗直結(jié)腸癌藥物。
【專利說明】-種猴頭菌菌絲體提取物在制備抗直結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及猴頭菌菌絲體提取物及其在制備抗直結(jié) 腸癌藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 胃腸道癌如肝癌，胃癌，直結(jié)腸癌是最常見的癌癥之一，據(jù)美國癌癥學(xué)會估計約占 所有癌癥的25%.直結(jié)腸癌在西方國家是最常見和死亡率最多的癌癥類型之一，直結(jié)腸癌 往往在50歲W后才被發(fā)現(xiàn)，發(fā)病率和死亡率居癌癥第H位。直結(jié)腸癌在中國的發(fā)病率低 于西方國家，但近年來明顯增加，特別是在發(fā)達(dá)地區(qū)。胃腸道癌的治療包括手術(shù)、化學(xué)藥物 治療、放射治療與免疫療法?；瘜W(xué)治療是最常用的方法雖然無法徹底治愈。在過去的幾十 年里，分子生物學(xué)的發(fā)展在直結(jié)腸治療上取得了明顯的進(jìn)步，特別是對晚期轉(zhuǎn)移直結(jié)腸癌 的化療，能明顯提高五年存活率，但藥物耐受性和毒性依然限制了治療方法的進(jìn)步，難W治 愈。因此，急需尋找和發(fā)展高效低毒新型抗直結(jié)腸癌的藥物。
[0003] 藥用真菌是指能治療疾病，具有藥用價值的一類真菌，即在菌絲體、子實體、菌核 或抱子中能產(chǎn)生諸如氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、多糖及糖蛋白、式類、生物堿、留醇類、意釀 類、黃麗類等多類物質(zhì)，對人體有保健作用，對疾病有預(yù)防抑制或治療作用的真菌。真菌作 為藥用在我國已有2000多年的歷史，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就記載了巧冬、豬冬等真菌藥 物，《本草綱目》中也收載了 20多種生物藥用菌，目前我國傳統(tǒng)作為藥用及試驗證實具有藥 效的真菌已超過400種，主要集中在擔(dān)菌亞口和子囊菌亞口。然而日常廣泛應(yīng)用于臨床的 卻僅有20余種，《中國藥典》2010年版明確收錄了 7種，該說明對生物藥用菌的研究還很不 完善，開發(fā)空間較大?，F(xiàn)有的研究主要集中于靈芝、蟲草等少數(shù)幾個品種，并且主要針對真 菌多糖作為劑型的研究及開發(fā)應(yīng)用。
[0004] 隨著生物科學(xué)的發(fā)展，真菌、粘菌、地衣等已從植物界中分離出來，單獨成立菌物 界。除目前久負(fù)盛名的靈芝、巧冬、蟲草、槐耳種類外，該界入選中藥的品種還較少，但其中 高等真菌數(shù)千種，今后無疑將會出現(xiàn)更多此類菌物藥，潛力巨大，將會大大豐富中藥寶庫。 此外，W藥用真菌為主體的菌物藥，除傳統(tǒng)應(yīng)用子實體外，現(xiàn)代已發(fā)展到采用液體(深層）發(fā) 酵(應(yīng)用菌球與發(fā)酵液)、固體發(fā)酵(應(yīng)用菌質(zhì)）等生產(chǎn)工藝。固體發(fā)酵產(chǎn)生的普通菌質(zhì)其主 要藥用部位仍只是它所含的菌絲體及其次生物質(zhì)，但值得注意的是藥用菌子實體除可自身 入藥外，還可用W進(jìn)行中藥生物工程研究，W研制新藥。而發(fā)酵工程，尤其是我國特有的固 體發(fā)酵工程，它存在的時間已有2000多年歷史，通過長時間的固體發(fā)酵，產(chǎn)生了生物代謝 產(chǎn)物包括生物酶類物質(zhì)，其生成的藥用菌質(zhì)比液體發(fā)酵藥效好。但固體發(fā)酵存在缺陷，容易 雜菌污染，現(xiàn)固體發(fā)酵技術(shù)研究是國內(nèi)研究熱點，主要研究的方向是無菌培養(yǎng)、二次培養(yǎng)、 雜菌抑制、中藥材作為營養(yǎng)基實施雙向固體發(fā)酵技術(shù)，突破固體發(fā)酵技術(shù)的瓶頸，實現(xiàn)生物 藥用菌的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。
[0005] 猴頭菌是一種猴頭菌科磨茹(真菌)，在中藥用于治療胃腸道疾病已經(jīng)有2000年的 歷史了，含有的一系列小分子化合物如erinacines，被認(rèn)為具有神經(jīng)再生，并且可W透過血 腦屏障修復(fù)受損神經(jīng)組織，猴頭菌還有抗?jié)?，抗炎，和抗微生物，免疫調(diào)節(jié)，提高肝功能， 抗衰老，降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加也臟輸出、改善備注循環(huán)等作用，包含猴頭 菌的醫(yī)用制劑在中國已廣泛使用。
[0006] 猴頭菌菌絲體的活性物質(zhì)中最重要的是多糖及糖蛋白，目前國內(nèi)外對猴頭多糖的 研究表明，猴頭菌多糖具有多種生物活性和藥理作用，能增強巨瞻細(xì)胞的吞瞻功能，促進(jìn)溶 血素的形成，抗白細(xì)胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突變和抗衰老等。因此，猴頭菌多糖 備受人們關(guān)注，成為近年來分子生物學(xué)、醫(yī)藥、食品科學(xué)等領(lǐng)域研究和開發(fā)應(yīng)用的熱點?！逗?南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2009年版，122-123頁記載了猴頭菌培養(yǎng)物，本發(fā)明所述的猴頭菌菌絲體 是該標(biāo)準(zhǔn)記載的猴頭菌培養(yǎng)物。
[0007] 當(dāng)前，從高等真菌及其培養(yǎng)物中進(jìn)行篩選和發(fā)現(xiàn)活性成分，應(yīng)用于抗腫瘤、抗病 毒、和治療糖尿病等，不僅成為國家重點研究新藥的發(fā)展方向，也是當(dāng)今世界各國開發(fā)生物 醫(yī)藥的熱點。但是，目前并未見將猴頭菌菌絲體的提取物應(yīng)用于抗直結(jié)腸癌的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種猴頭菌菌絲體提取物，該猴頭菌菌絲 體提取物在體外能殺死人直腸癌SW620和HT-29細(xì)胞和在體內(nèi)能抑制直腸癌移植瘤的生 長，因此可應(yīng)用于制備抗直結(jié)腸癌藥物。
[0009] 本發(fā)明所述的猴頭菌菌絲體提取物的制備方法包括如下步驟：
[0010] (1)取猴頭菌菌絲體，進(jìn)行第一次水常溫閃式提取，提取15?25分鐘，然后進(jìn)行第 二次水常溫閃式提取，提取10?20分鐘，第一次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌 絲體重量的4?6倍，優(yōu)選為5倍；第二次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重 量的2?4倍，優(yōu)選為3倍；
[0011] (2)將提取液離也后得到的上清液在55?6(TC條件下減壓濃縮至有沉淀析出；將 濃縮液在-60?-55C條件下真空冷凍干燥，既得猴頭菌菌絲體提取物。
[0012] 其中，所述水常溫閃式提取的溫度為20?5(TC。步驟（2)中所述提取液離也條件 為；轉(zhuǎn)速3500?4500轉(zhuǎn)/分鐘，離也8?15分鐘。
[0013] 優(yōu)選地，所述提取物的制備步驟還包括；將步驟（2)的濃縮液再用重量為該濃縮 液重量4?6倍的且體積百分比濃度為70?80%的己醇溶解，將溶解部分在55?6(TC減 壓濃縮至無醇味，將所得濃縮物在-60?-55C真空冷凍干燥。
[0014] 優(yōu)選地，所述提取物的制備步驟還包括；將步驟（2)的濃縮液再用重量為該濃縮 液重量4?6倍的且體積百分比濃度為70?80%的己醇溶解，將不溶解部分在-60?-55C 真空冷凍干燥。
[0015] 本發(fā)明所述猴頭菌菌絲體是《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2009年版，122-123頁記載的猴 頭菌培養(yǎng)物，該猴頭菌菌絲體為猴頭菌科真菌猴頭菌化ricium erinaceum (Bull.ex化.） Pers.的菌絲體與其附生的固體培養(yǎng)基的干燥混合物。
[0016] 本發(fā)明常溫閃式提取猴頭菌菌絲體，在常溫或者室溫下（20-5(TC )，不加熱，加水 動力打漿式水溶出有效成分，無溫度破壞，既能溶解有效成分又不破壞有效成分；6(TC減壓 濃縮，不會破壞有效成分，特別是活性酶類物質(zhì)；為了不影響有關(guān)活性物質(zhì)，本發(fā)明采用了 真空冷凍干燥手段。
[0017] 本發(fā)明對所得的猴頭菌菌絲體提取物進(jìn)行了抑制人直結(jié)腸癌SW620和HT-29細(xì)胞 及動物抗直結(jié)腸癌移植瘤的實驗，從圖1至圖9和表1至表3的結(jié)果可知，該猴頭菌菌絲體 提取物具有抗直結(jié)腸癌的作用，可用于制備抗直結(jié)腸癌藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1:HTJ#2對人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的抑制作用。濃度為0. 078 - 2. 5毫克/毫 升，72小時藥物處理，喔哇蘭（MTT)方法測定細(xì)胞活性；
[0019] 圖2:HTJ#5對人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的抑制作用。濃度為0. 39 - 12. 5毫克/毫 升，72小時藥物處理，喔哇蘭（MTT)方法測定細(xì)胞活性；
[0020] 圖3:HTJ#5對人直結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制作用。濃度為0. 3125 - 20毫克/毫 升，72小時藥物處理，喔哇蘭（MTT)方法測定細(xì)胞活性；
[0021] 圖4:HTJ#5A對人直結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制作用。濃度為0. 3125 - 20毫克/毫 升，72小時藥物處理，喔哇蘭（MTT)方法測定細(xì)胞活性；
[0022] 圖5:圖5A為HTJ#2, HTJ#5和五氣尿嚼巧體內(nèi)對人直結(jié)腸癌SW620移植瘤的療 效分析；圖5B為HTJ#2, HTJ#5和五氣尿嚼巧體內(nèi)對人直結(jié)腸癌SW620移植瘤的動物毒性 分析；對照組，五氣尿嚼巧（35毫克/公斤/天)，HTJ#2 (200或500毫克/公斤/天），和 HTJ#5 (200或500毫克/公斤/天），通過連續(xù)5天腹腔注射或口服給藥，對荷人直結(jié)腸癌 SW620移植瘤的SCID小鼠的抗瘤作用和毒副反應(yīng)。每組3-5只動物；
[0023] 圖6:圖6A為HTJ#5, HTJ#5A和五氣尿嚼巧體內(nèi)對人直結(jié)腸癌HT-29移植瘤的療 效分析；圖6B為HTJ#5, HTJ#5A和五氣尿嚼巧體內(nèi)對人直結(jié)腸癌HT-29移植瘤的動物毒性 分析。對照組、五氣尿嚼巧（30毫克/公斤/天，腹腔注射），HTJ#5 (500毫克/公斤/天， 口服），HTJ#5 (500毫克/公斤/天，口服），連續(xù)5天給藥，每組5只動物；
[0024] 圖7:HTJ#5, HTJ#5A，和五氣尿嚼巧腹腔對人直結(jié)腸癌HT-29移植瘤的個體療效； 對照組，五氣尿嚼巧（30毫克/公斤/天，腹腔注射)，HTJ#5(500毫克/公斤/天，口服）， 和HTJ#5A巧00毫克/公斤/天，口服），通過連續(xù)5天給藥；其中，圖7A為對照組，圖7B 為五氣尿嚼巧（30毫克/公斤/天，腹腔注射)，圖7C為HTJ#5 (500毫克/公斤/天，口 服），圖7D為HTJ#5A巧00毫克/公斤/天，口服）；圖中橫坐標(biāo)為時間(天)，縱坐標(biāo)為腫瘤 重量(暈克）；
[00巧]圖8:圖8A為HTJ#5, HTJ#5A和五氣尿嚼巧體內(nèi)對人直結(jié)腸癌HT-29移植瘤的療 效分析；圖8B為HTJ#5, HTJ#5A和五氣尿嚼巧體內(nèi)對人直結(jié)腸癌HT-29移植瘤的動物毒性 分析；對照組、五氣尿嚼巧（30毫克/公斤/天，腹腔注射)，HTJ#5 (1000毫克/公斤/天， 口服），HTJ#5 (1000毫克/公斤/天，口服），連續(xù)5天給藥.每組5只動物；
[0026] 圖9:HTJ#5，HTJ#5A，和五氣尿嚼巧腹腔對人直結(jié)腸癌HT-29移植瘤的個體療效； 對照組，五氣尿嚼巧（30毫克/公斤/天，腹腔注射)，HTJ#5(l〇〇〇毫克/公斤/天，口服）， 和HTJ#5A(1000毫克/公斤/天，口服），通過連續(xù)5天給藥；其中，圖9A為對照組，圖9B 為五氣尿嚼巧（30毫克/公斤/天，腹腔注射)，圖9C為HTJ#5(l〇〇〇毫克/公斤/天，口 服），圖9D為HTJ#5A(1000毫克/公斤/天，口服）；圖中橫坐標(biāo)為時間（天)，縱坐標(biāo)為腫 瘤重量(毫克)。

【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0028] 實施例1
[0029] -種猴頭菌菌絲體提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0030] (1)取猴頭菌菌絲體，進(jìn)行第一次水常溫閃式提取，提取20分鐘，然后進(jìn)行第二次 水常溫閃式提取，提取15分鐘；第一次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重量 的5倍；第二次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重量的3倍；
[0031] (2 )將上述兩次提取后獲得的提取液離也后得到的上清液在6(TC條件下減壓濃縮 至有沉淀析出得到濃縮液；將濃縮液在-6(TC條件下真空冷凍干燥，即得猴頭菌菌絲體提 取物。
[0032] 其中，所述水常溫閃式提取的溫度為3(TC。步驟（2)中所述提取液離也條件為；轉(zhuǎn) 速4000轉(zhuǎn)/分鐘，離也10分鐘。
[003引 實施例2
[0034] -種猴頭菌菌絲體提取物，其制備方法包括如下步驟：
[00巧](1)取猴頭菌菌絲體，進(jìn)行第一次水常溫閃式提取，提取20分鐘，然后進(jìn)行第二次 水常溫閃式提取，提取15分鐘；第一次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重量 的5倍；第二次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重量的3倍；
[0036] (2)將上述兩次提取后獲得的提取液離也后得到的上清液在6(TC條件下減壓濃縮 至有沉淀析出得到濃縮液；
[0037] (3)將步驟（2)的濃縮液再用重量為該濃縮液重量5倍的且體積百分比濃度為80% 的己醇溶解，將溶解部分在6(TC減壓濃縮至無醇味，將所得濃縮物在-6(TC真空冷凍干燥， 得進(jìn)一步提取的猴頭菌菌絲體提取物。
[0038] 其中，所述水常溫閃式提取的溫度為3(TC。步驟（2)中所述提取液離也條件為；轉(zhuǎn) 速4000轉(zhuǎn)/分鐘，離也10分鐘。
[00測 實施例3
[0040] -種猴頭菌菌絲體提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0041] (1)取猴頭菌菌絲體，進(jìn)行第一次水常溫閃式提取，提取20分鐘，然后進(jìn)行第二次 水常溫閃式提取，提取15分鐘；第一次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重量 的5倍；第二次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重量的3倍；
[0042] (2)將上述兩次提取后獲得的提取液離也后得到的上清液在6(TC條件下減壓濃縮 至有沉淀析出得到濃縮液；
[0043] (3)將步驟（2)的濃縮液再用重量為該濃縮液重量5倍的且體積百分比濃度為80% 的己醇溶解，將不溶部分在-6(TC真空冷凍干燥，得進(jìn)一步提取的猴頭菌菌絲體提取物。
[0044] 其中，所述水常溫閃式提取的溫度為3(TC。步驟（2)中所述提取液離也條件為；轉(zhuǎn) 速4000轉(zhuǎn)/分鐘，離也10分鐘。
[004引 實施例4
[0046] 猴頭菌菌絲體提取物功能鑒定試驗-對結(jié)直腸癌SW620和HT-29細(xì)胞的抑制作用
[0047] 一、材料與方法
[0048] 1、細(xì)胞和培養(yǎng)：人直結(jié)腸癌SW620和HT-29細(xì)胞來自美國模式培養(yǎng)物研究 所（American Type Cuhure Collection, ATCC;Manassas, VA, UA巧。SW620 細(xì)胞飼 養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液，HT-29細(xì)胞飼養(yǎng)于DMHM培養(yǎng)液，含10%小牛血清（Atlanta Biological, Lawrenceville，GA，USA)，100單位/毫升的青霉素，和0. 1微克/毫升的鏈霉 素（Invitrogen, Grand Island, NY, USA)。
[0049] 2、藥物；由實施例I制備方法最終獲得的猴頭菌菌絲體提取物，命名為HTJ#2 ;由 實施例2制備方法最終獲得的猴頭菌菌絲體提取物，命名為HTJ#5 ;由實施例3制備方法 最終獲得的猴頭菌菌絲體提取物，命名為HTJ#5A ;將前述猴頭菌菌絲體提取物分別溶于含 0. 1%DMS0 的 RPMI1640(SW620 細(xì)胞）DMEM〇lT-29 細(xì)胞）培養(yǎng)液中。
[0050] 3、藥物濃度與方案：HTJ#2, HTJ#5,和HTJ#5A藥物濃度在0. 625 - 20mg/ml (毫克 /毫升）連續(xù)72小時藥物處理。
[0051] 4.抑制人結(jié)直腸癌SW620和HT-29細(xì)胞生長活性；72小時藥物處理，然后用喔哇 蘭（MTT)方法測定細(xì)胞活性。
[00閲二、實驗結(jié)果
[0053] 1. HTJ#2和HTJ#5對人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的生長抑制作用。
[0054] 我們首先用八種不同的HTJs炸1-#8)處理體外培養(yǎng)的人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞72 小時來觀察對直結(jié)腸癌細(xì)胞的體外生長抑制作用。試驗結(jié)果表明所有HTJs都能有效的抑 制人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的生長，其抑制作用量效曲線(數(shù)據(jù)沒有顯示)。其中，HTJ#2和 HTJ#5的抑制作用較強。圖1數(shù)據(jù)表明HTJ#2對人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的抑顯示制作用非 常強，其半數(shù)殺傷濃度（ICw)為0. 8毫克/毫升，HTJ#2在1. 25毫克/毫升能殺傷大于85% 的SW620細(xì)胞。圖2數(shù)據(jù)表明HTJ#5對人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的半數(shù)殺傷濃度（ICw)為 2. 0毫克/毫升，HTJ#5在6. 25毫克/毫升能殺傷大于85%的SW620細(xì)胞。
[00巧]2. HTJ#5和HTJ#5A對人直結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長抑制作用。
[0056] -般來說，人直結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞對多數(shù)化療比較耐藥。我們用HTJ#5和HTJ#5A72 小時處理培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞來觀察其體外生長抑制作用。試驗數(shù)據(jù)見圖3至圖4。數(shù)據(jù)結(jié) 果表明通過72小時HTJ#5或HTJ#5A對細(xì)胞的處理能有效的抑制HT-29細(xì)胞的生長，其抑制 作用量效曲線。圖3數(shù)據(jù)表明HTJ#5對HT-29細(xì)胞的半數(shù)殺傷濃度（ICw)為1. 25毫克/毫 升，HTJ#5在20毫克/毫升能殺傷大于80%的HT-29細(xì)胞。圖4數(shù)據(jù)表明HTJ#5A對HT-29 細(xì)胞殺傷能力與HTJ#5相似或較強。其半數(shù)殺傷濃度（ICw)為1. 25毫克/毫升，HTJ#5A 在20毫克/毫升能殺傷大于90%的HT-29細(xì)胞。
[0057] 實施例5
[0058] 猴頭菌菌絲體提取物功能鑒定試驗
[0059] -、材料與方法
[0060] 1、動物；8 ?12 周的 SCID 雌鼠（重量 18 ?22g)，來自 Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, NY)，并按規(guī)定飼養(yǎng)。
[0061] 2、藥物；由實施例I制備方法最終獲得的猴頭菌菌絲體提取物，命名為HTJ#2 ; 由實施例2制備方法最終獲得的猴頭菌菌絲體提取物，命名為HTJ#5 ;由實施例3制備 方法最終獲得的猴頭菌菌絲體提取物，命名為HTJ#5A ;將前述猴頭菌菌絲體提取物溶于 含10%DMS0的無菌生理鹽水中，五氣尿嚼巧（5-即；50mg/ml)購于Hof fmann-La Roche， Inc (Nutl巧，NJ) W無菌生理鹽水稀釋。.
[0062] 3、腫瘤細(xì)胞；SW620和HT-29直結(jié)腸癌細(xì)胞。移植瘤的建立首先注射約1000000個 培養(yǎng)細(xì)胞并經(jīng)過數(shù)代移植。
[0063] 4、藥物劑量與方案；HTJ#2 口服或注射200-500毫克/公斤/天，HTJ#5 口服或注 射200-1000毫克/公斤/天，HTJ#5A 口服500-1000毫克/公斤/天，五氣尿嚼巧30-35 毫克/公斤/天，腹腔注射給藥，一天一次，療程5天。對照組口服或注射10%DMS0溶液， 小鼠每20g體重給予200-400U1 (與實驗組相同）。每組3-5只小鼠，部分實驗中，同一只 鼠荷兩種不同的移植瘤。
[0064] 5.腫瘤測量；用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的軸線（L表示長軸，W表示短軸）腫瘤重量按 下式計算：腫瘤重量=1/2(L X W2) (mm). (Img=lmm3)，每天同一時間進(jìn)行腫瘤測量，每周3-4 次。
[0065] 6.最大耐受劑量（MTD)和毒性評價；最大耐受劑量定義為給藥導(dǎo)致小鼠體重減輕 在20%左右，不會導(dǎo)致藥物引起小鼠死亡的劑量。接受藥物治療后的前十天，每天測量腫瘤 和小鼠體重，然后是每兩天測量一次。
[0066] 7.抗腫瘤活性；抗腫瘤活性評價指標(biāo)，最大腫瘤生長抑制，W治療組的平均腫瘤 重量和對照組的腫瘤平均重量來計算；腫瘤體積倍增時間，為腫瘤重量增長到最初重量的 兩倍所需的平均時間；腫瘤部分反應(yīng)（PR)，當(dāng)腫瘤大小減少一半(至最初的50%或W上)時； 腫瘤完全反應(yīng)（CR)，當(dāng)無法檢測到腫瘤(腫瘤完全消失）時；治愈定義為藥物治療后至少60 天內(nèi)檢測不到腫瘤(達(dá)到腫瘤完全反應(yīng)保持至少60天，此時一般腫瘤不會復(fù)發(fā)，動物不再 保留)。
[0067] 二、實驗結(jié)果
[0068] 1、HTJ#2, HTJ#5和五氣尿嚼巧對荷SW620人直結(jié)腸癌移植瘤的SCID小鼠的抗腫 瘤活性與毒性。
[0069] 我們的體外MT試驗發(fā)現(xiàn)HTJ#2和HTJ#5對人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞具有明顯的細(xì) 胞毒性。HTJ#2和HTJ#5的ICw分別是0. 8mg/ml和2. Omg/ml。因此我們使用了 HTJ#2和 HTJ#5在荷SW620移植瘤的SCID小鼠來觀察其抗腫瘤活性。圖5和表1的試驗數(shù)據(jù)顯示溶 媒對照組，五氣尿嚼巧劑量為35毫克/公斤/天，HTJ#2和HTJ#5劑量為200毫克/公斤/ 天和500毫克/公斤/天，每天一次，連續(xù)5天的對荷SW620直結(jié)腸癌的SCID小鼠的抗腫 瘤活性和毒性。試驗結(jié)果表明SW620移植瘤生長較快，平均倍增時間為3. 1 + 0. 1。HTJ#2 和HTJ#5在口服及腹腔注射使用劑量為200毫克/公斤/天和500毫克/公斤/天時，對 于腫瘤抑制和延長腫瘤倍增時間均有一定的作用。然而，HTJ#2在500毫克/公斤/天腹 腔注射顯示明顯毒性，并且導(dǎo)致67%的試驗動物死亡（H分之二動物死亡）。而同樣劑量 的HTJ#2 (500毫克/公斤/天，口服時，沒有明顯毒性。.數(shù)據(jù)還顯示五氣尿嚼巧在35毫 克/公斤/天，腹腔注射對于SW620移植瘤只有48. 4%的抑制率，并且延長腫瘤倍增時間從 3. 1 ±0. 1天(溶媒對照組)到4. 8 + 0. 4天。然而，五氣尿嚼巧在35毫克/公斤/天）毒性 太大而導(dǎo)致22. 5%體重減輕，可能超過最大耐受劑量。數(shù)據(jù)顯示HTJ#2和HTJ#5相比于五 氣尿嚼巧抗瘤活性相似或更強(抑制率48. 7-61. 4%)毒性低，但延長腫瘤倍增時間較短（? 五天）表明腫瘤在藥物治療停止之后恢復(fù)較快。結(jié)果也表明町T#2和HTJ#5 口服與腹腔注 射的抗瘤療效相似。
[0070] 2. HTJ#5, HTJ#5A和五氣尿嚼巧對荷HT-29移植瘤的SCID小鼠的抗腫瘤活性和毒 性。
[0071] 根據(jù)我們W前的經(jīng)驗，SW620移植瘤對于大多數(shù)化學(xué)藥物比HT-29移植瘤更敏感。 所W，我們應(yīng)用HTJ#5, HTJ#5A和五氣尿嚼巧對荷HT-29直結(jié)腸癌腫瘤移植瘤的SCID小 鼠的抗腫瘤活性和毒性。試驗結(jié)果見圖.6-7和表2的試驗數(shù)據(jù)顯示溶媒對照組，五氣尿 嚼巧劑量為30毫克/公斤/天，腹腔注射（由于35毫克/公斤/天，毒性太大)，HTJ#5和 HTJ#5A劑量為500毫克/公斤/天，口服，每天一次，連續(xù)5天。數(shù)據(jù)表明，HT-29倍增時間 為8. 7± 1. 0天，五氣尿嚼巧的腫瘤抑制率為42. 7± 10%。然而，并明顯延長腫瘤倍增時間至 14. 2天（P<0. 05)，口服HTJ#5劑量500毫克/公斤/天，治療5天，對HT-29移植瘤的，腫 瘤生長抑制率為65. 0 + 17. 3,倍增時間達(dá)到19. 3 + 4. 9天，比五氣尿嚼巧劑量抗瘤活性更 強，毒性明顯低?？诜﨟TJ#5A500毫克/公斤/天，療程5天，腫瘤生長抑制為66. 2 + 17. 8 倍增時間延長至19. 2 + 3. 3天，也比五氣尿嚼巧劑量抗瘤活性更強，毒性明顯低。
[0072] 我們又提高HTJ#5和HTJ#5A至1000毫克/公斤/天，觀察是否能進(jìn)一部提高抗 瘤療效。試驗結(jié)果見圖.8-9和表3。數(shù)據(jù)表明，HT-29倍增時間為6. 4 + 0. 3天，比上次移 植瘤生長較快。五氣尿嚼巧的腫瘤抑制率提高至63. 2 + 5. 9%。然而，延長腫瘤倍增時間至 10.4天任<0.05)，口服陽\1#5劑量1000毫克/公斤/天，治療5天，對陽'-29移植瘤的， 腫瘤生長抑制率為66. 8 + 4. 6,倍增時間達(dá)到16. 2 + 1. 3天，比五氣尿嚼巧劑量抗瘤活性更 強，毒性明顯低。口服HTJ#5A1000毫克/公斤/天，療程5天，腫瘤生長抑制為64. 2 + 2. 9 倍增時間延長至15. 6± 1. 7天，也比五氣尿嚼巧劑量抗瘤活性更強，毒性明顯低。結(jié)果表明 提高HTJ#5和HTJ#5A從500毫克/公斤/天至1000毫克/公斤/天，并沒有進(jìn)一部提高 抗瘤療效，也沒有增加毒性。
[0073] 結(jié)論：
[0074] 1. HTJ#2和HTJ#5在體外對人直結(jié)腸癌SW620細(xì)胞有明顯的抑制作用。
[00巧]2. HTJ#5和HTJ#5A在體外對人直結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞有明顯的抑制作用。
[0076] 3. HTJ#2和HTJ#5在200或500毫克/公斤/天）在體內(nèi)對人直結(jié)腸癌SW620人 頭頸部癌移植瘤有一定的抗腫瘤療效，與五氣尿嚼巧劑量抗瘤活性相似或更強，但延長腫 瘤倍增時間較短。
[0077] 4.町T#2和HTJ#5 口服與腹腔注射的抗瘤療效相似。
[007引 5. HTJ#2在500毫克/公斤/天腹腔注射有明顯毒性但口服沒有明顯毒性。
[0079] 6. HTJ#5和HTJ#5A (500-1000毫克/公斤/天，口服5天）比五氣尿嚼巧（30-35 毫克/公斤/天，腹腔注射5天）對HT-29移植瘤的抗瘤療效好并且毒性明顯低。
[0080] 7.結(jié)果表明提高HTJ#5和HTJ#5A從500毫克/公斤/天至1000毫克/公斤/ 天，不能進(jìn)一部提高抗瘤療效，也沒有增加毒性。
[0081] 表1:總結(jié)HTJ#2, HTJ#5和五氣尿嚼巧對SW620結(jié)直腸癌的抗瘤療效和動物毒性
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 一種猴頭菌菌絲體提取物在制備抗直結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。 (1) 取猴頭菌菌絲體，進(jìn)行第一次水常溫閃式提取，提取15?25分鐘，然后進(jìn)行第二次 水常溫閃式提取，提取10?20分鐘；第一次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體 重量的4?6倍；第二次水常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重量的2?4倍； (2) 將上述兩次提取后獲得的提取液離心后得到的上清液在55?60°C條件下減壓濃 縮至有沉淀析出得到濃縮液；將濃縮液在-60?_55°C條件下真空冷凍干燥，即得猴頭菌菌 絲體提取物。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，猴頭菌菌絲體提取物制備方法中第一次水 常溫閃式提取中，水的重量為猴頭菌菌絲體重量的5倍；第二次水常溫閃式提取中，水的重 量為猴頭菌菌絲體重量的3倍。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，猴頭菌菌絲體提取物制備方法中水常溫閃 式提取的溫度為20?50°C。
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，猴頭菌菌絲體提取物制備方法的步驟（2)中 所述提取液離心條件為：轉(zhuǎn)速3500?4500轉(zhuǎn)/分鐘，離心8?15分鐘。
5. 如權(quán)利要求1至4之一所述的應(yīng)用，其特征在于，猴頭菌菌絲體提取物制備方法 的步驟還包括：將步驟（2)的濃縮液再用重量為該濃縮液重量4?6倍的且體積百分比 濃度為70?80%的乙醇溶解，將溶解部分在55?60°C減壓濃縮至無醇味，將所得濃縮物 在-60?-55 °C真空冷凍干燥。
6. 如權(quán)利要求1至4之一所述的猴頭菌菌絲體提取物，其特征在于，猴頭菌菌絲體提取 物制備方法的步驟還包括：將步驟（2)的濃縮液再用重量為該濃縮液重量4?6倍的且體 積百分比濃度為70?80%的乙醇溶解，將不溶解部分在-60?-55°C真空冷凍干燥。
【文檔編號】A61P35/00GK104224857SQ201310234812
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
【發(fā)明者】何述金, 常耀臺, 曹壽松 申請人:湖南新匯制藥股份有限公司