Gadd45g基因及其表達(dá)產(chǎn)物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了GADD45G基因及其表達(dá)產(chǎn)物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑的用途，用于制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞尤其是肝癌細(xì)胞衰老的藥物組合物。此外，本發(fā)明還提供了GADD45G基因蛋白或其促進(jìn)劑用于抑制JAK-STAT3信號(hào)通路從而進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞生長或增殖。本發(fā)明方法揭示了GADD45G基因作為抑癌基因的作用機(jī)制，并能將該機(jī)制廣泛應(yīng)用于腫瘤尤其是肝癌的治療。
【專利說明】GADD45G基因及其表達(dá)產(chǎn)物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域。具體地，涉及GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑通過誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞衰老從而抑制腫瘤細(xì)胞生長中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝癌是一種惡性程度較高以及預(yù)后差的惡性腫瘤，其在全球死亡率和發(fā) 病率分別列所有腫瘤的第4位和第7位，尤其中國是肝癌的高發(fā)病地區(qū)。因其初期癥狀不 明顯，檢測(cè)出時(shí)病人已多處于晚期，而晚期因癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致預(yù)后不良，所以肝 癌的防治十分重要。研究表明，當(dāng)體細(xì)胞發(fā)生遺傳改變時(shí)，往往能造成細(xì)胞衰老，從而抑制 腫瘤發(fā)生；因此，細(xì)胞衰老是機(jī)體保持穩(wěn)態(tài)的一種調(diào)節(jié)機(jī)制。細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化需要克服細(xì) 胞衰老的阻礙。
[0003] 對(duì)于已發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞而言，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老相關(guān)機(jī)制的研究，對(duì)于腫 瘤臨床治療具有十分重要的意義。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老從 而抑制腫瘤生長或擴(kuò)增的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明提供了一種GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老從而抑制 腫瘤細(xì)胞生長或擴(kuò)增的用途。
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑的用途，用于制備 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的藥物組合物。
[0006] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞來自以下腫瘤：肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巢 癌、胰腺癌。
[0007] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞來自肝癌。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45G基因核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示，其編碼 的蛋白序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45G來自哺乳動(dòng)物，較佳地，來源于大鼠、小鼠、人， 更佳地，來源于人。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑包括的GADD45G基因表達(dá) 產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45G促進(jìn)劑為MG-132。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括所述GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑以 及藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的藥物組合物，所述的藥 物組合物包括GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑以及藥學(xué)上可接受的鹽。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45G促進(jìn)劑包括的GADD45G基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型 miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45G促進(jìn)劑為MG-132。
[0016] 本發(fā)明第三方面，提供了一種篩選制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的候選化合物的方法， 包括步驟：
[0017] (a)在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系添加測(cè)試化合物，并觀察測(cè)試組中所述細(xì)胞 GADD45G的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，向相同的培養(yǎng)體系不添加測(cè)試化合物，并觀察 對(duì)照組中所述細(xì)胞的GADD45G的表達(dá)量和/或活性；
[0018] 其中，如果測(cè)試組中的GADD45G的表達(dá)量和/或活性大于對(duì)照組，則說明該化合物 是對(duì)GADD45G有促進(jìn)作用的用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的候選化合物。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的步驟還包括：
[0020] (b)對(duì)（a)中獲得的候選化合物，還進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)JAK-STAT3的抑制作用。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，步驟（b)中還包括：在測(cè)試組中，向腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系添加測(cè)試 化合物，并觀察所述的腫瘤細(xì)胞的生長情況和/或細(xì)胞量；在對(duì)照組中，向相同培養(yǎng)體系不 添加測(cè)試化合物，并觀察所述的腫瘤細(xì)胞的生長情況和/或細(xì)胞量；
[0022] 其中，若測(cè)試組中衰老的細(xì)胞比例顯著大于對(duì)照組，和/或若測(cè)試組中的細(xì)胞量 顯著少于對(duì)照組，則說明，該化合物是用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的候選化合物。
[0023] 本發(fā)明第三方面，提供了一種JAK-STAT3抑制劑的用途，用于制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 衰老的藥物組合物。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞來自肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巢癌、胰腺癌。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞來自肝癌。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的JAK-STAT3來自哺乳動(dòng)物，較佳地，來源于大鼠、小鼠、 人，更佳地，來源于人。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括JAK-STAT3抑制劑以及藥學(xué)上可接受的 載體。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的JAK-STAT3抑制劑包括GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑和 /或shP2基因、蛋白或其促進(jìn)劑。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑包括的GADD45G基因表達(dá) 產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。
[0030] 本發(fā)明第三方面，提供了一種體外非治療性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的方法，向細(xì)胞 培養(yǎng)體系中加入GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老。
[0031] 本發(fā)明第四方面，提供了一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老從而治療腫瘤的方法，向所需要 的對(duì)象施用安全有效量的GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑；和/或向所需要的對(duì)象施用安全 有效量的JAK-STAT3抑制劑。
[0032] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033] 圖1顯示了 GADD45G在肝癌中低表達(dá)。其中：圖IA的qRT-PCR結(jié)果顯示GADD45G 在人肝癌細(xì)胞系及永生化肝細(xì)胞系THLE-2中的表達(dá)情況。圖IBqRT-PCR結(jié)果顯示GADD45G 在DEN藥物誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞性腫瘤模型中，癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。圖IC qRT-PCR 結(jié)果顯不GADD45G在人肝癌臨床樣本的癌及癌芳組織中的表達(dá)情況。（***P〈0. 001)圖ID Western blotting結(jié)果顯示GADD45G在人肝癌臨床樣本的癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。
[0034] 圖2顯示了 GADD45G與肝癌的分化呈負(fù)性相關(guān)：免疫組化評(píng)分顯示，臨床肝癌樣本 中GADD45G表達(dá)強(qiáng)弱與肝癌分化等級(jí)的相關(guān)性（**P〈0. 01)。
[0035] 圖3顯示了 GADD45G條件表達(dá)載體的建立。
[0036] 圖4顯示了過表達(dá)GADD45G誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。其中，圖4A過表達(dá)GADD45G及對(duì)照組 的SA- β -gal染色結(jié)果。圖4B qRT-PCR結(jié)果顯示過表達(dá)GADD45G及對(duì)照組中IL-8的表達(dá) 情況。圖4C Annexin V/7-AAD染色檢測(cè)過表達(dá)GADD45G及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況。圖4D BrdU染色檢測(cè)過表達(dá)GADD45G及對(duì)照組的細(xì)胞增殖情況。（*P〈0. 05, **P〈0. 01)
[0037] 圖5顯示了過表達(dá)GADD45G誘導(dǎo)Sk-H印1細(xì)胞衰老。其中，圖5A Dox誘導(dǎo)過表達(dá) GADD45G及對(duì)照組Sk-H印1細(xì)胞的SA- β -gal染色結(jié)果。圖5BqRT-PCR結(jié)果顯示Dox誘導(dǎo) 過表達(dá)GADD45G及對(duì)照組中IL-6的表達(dá)情況。圖5C qRT-PCR結(jié)果顯示Dox誘導(dǎo)過表達(dá) GADD45G及對(duì)照組中IL-8的表達(dá)情況。圖Western blotting檢測(cè)顯示Dox誘導(dǎo)過表達(dá) GADD45G及對(duì)照組中衰老標(biāo)志物γ -H2AX及GADD45G的表達(dá)情況。
[0038] 圖6顯示了 GADD45G在體內(nèi)抑制腫瘤生長。其中，圖6A過表達(dá)GADD45G及對(duì)照組 Sk-H印1細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤形成情況（*P〈0. 05)。圖6B過表達(dá)GADD45G及對(duì)照組Sk-H印1 細(xì)胞形成的腫瘤生長狀況（**P〈〇. 01)。圖6C H&E染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)過表達(dá)GADD45G 及對(duì)照組Sk-H印1細(xì)胞所形成的腫瘤中細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)情況。（X400)
[0039] 圖7顯示了在Sk-H印1細(xì)胞中GADD45G誘導(dǎo)細(xì)胞衰老不通過p53/p21或pl6/Rb通 路。其中，圖7A轉(zhuǎn)有SV40-LT及對(duì)照質(zhì)粒的Sk-Hepl經(jīng)doxorubicin處理24小時(shí)后，Western blotting檢測(cè)顯示p53及p21的表達(dá)情況。圖7BTet-GADD45G-Sk-H印1及對(duì)照細(xì)胞轉(zhuǎn)有 SV40-LT及對(duì)照質(zhì)粒后，經(jīng)Dox誘導(dǎo)表達(dá)4天后，SA- β -gal染色檢測(cè)各細(xì)胞衰老情況。圖 7C Western blotting 檢測(cè)顯示 siRNA 干擾 p21、p27、p53 或 Rb 后，Tet-GADD45G-Sk-H印 1 細(xì)胞中P21、p27、p53或Rb的表達(dá)情況。圖7D SA-P-gal染色檢測(cè)siRNA干擾p21、p27、 p53或Rb后，Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)的細(xì)胞的衰老比率情況。圖7E MTT檢測(cè)siRNA干擾 p21、p27、p53或Rb后，Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)的細(xì)胞的存活比率情況。
[0040] 圖8顯示了 GADD45G誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老不通過p53/p21或pl6/Rb通路。其中， 圖8A在LPC-H-Ras V12細(xì)胞中，Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)后細(xì)胞克隆形成情況（2000, 1000 和500個(gè)細(xì)胞每孔)。圖8B在LPC-H-Ras V12細(xì)胞中，Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)后SA-β -gal 染色檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。圖8C在Tet-GADD45G-H印3B細(xì)胞中，siRNA干擾pl6后Dox誘導(dǎo) GADD45G表達(dá)3天，SA- β -gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。圖8D在Tet-GADD45G-H印3B細(xì)胞 中，siRNA 干擾 pl6 后 Dox 誘導(dǎo) GADD45G 表達(dá) 3 天，Western blotting 檢測(cè) pl6 及 GADD45G 的表達(dá)情況。
[0041] 圖9顯示了 GADD45G抑制Jak2, Tyk2和Stat3的活化。其中，圖9A Dox誘 導(dǎo)表達(dá) GADD45G 后，Western blotting 檢測(cè) Sk-H印 1、SMMC-7721 及 H印3B 細(xì)胞中 p-Stat3 (Tyr705)，Stat3 及 GADD45G 的表達(dá)情況。圖 9BTet-GADD45G-Sk-H印 1 細(xì)胞經(jīng) Dox 處 理不同時(shí)間后，Western blotting 檢測(cè) p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、p_Tyk2 (Tyrl054/1055)、 Tyk2、p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表達(dá)情況。
[0042] 圖10顯示了 Na3V04能夠抑制GADD45G造成的細(xì)胞衰老。其中，圖10ATet-GADD45G Sk-H印1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的Na3V04 (100 μ Μ, 250 μ Μ, 500 μ Μ, 1000 μ Μ)處理0· 5小時(shí)后， Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)4天，SA-β -gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。圖IOB Tet-GADD45G Sk-H印1 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的 Na3V04 (100 μ Μ, 250 μ Μ, 500 μ Μ, 1000 μ Μ)處理 0· 5 小時(shí) 后，Dox 誘導(dǎo) GADD45G 表達(dá) 4 小時(shí)，Western blotting 檢測(cè) p_Stat3(Tyr705)、Stat3、 p-Tyk2 (Tyrl054/1055)、Tyk2、p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表達(dá)情況。
[0043] 圖11顯示了 Shp抑制劑介導(dǎo)GADD45G對(duì)JAK-Stat3通路的抑制。其中，圖IIA Dox 誘導(dǎo) GADD45G 表達(dá)不同時(shí)間點(diǎn)后，Western blotting 檢測(cè) p_Shp2 (Tyr580)、Shp2 及GADD45G表達(dá)情況。圖IlB Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)并用NSC-87877(10yM)處理4小 時(shí)后，Western blotting 檢測(cè) p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、p_Tyk2 (Tyrl054/1055)、Tyk2、 p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表達(dá)情況。
[0044] 圖12顯示了敲除Shp2能夠抑制GADD45G介導(dǎo)的JAK-Stat3通路活性抑制。其 中，圖12A在Tet-GADD45G-Sk-H印1細(xì)胞中，siRNA干擾Shp2表達(dá)后，Dox誘導(dǎo)GADD45G表 達(dá) 4 小時(shí)，Western blotting 檢測(cè) p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、Shp2 及 GADD45G 的表達(dá)情況。 圖12B在Tet-GADD45G-Sk-H印1細(xì)胞中，siRNA干擾Shp2表達(dá)后，Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)4 天，SA-β -gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。圖12C在Tet-GADD45G-Sk-H印1細(xì)胞中，siRNA干 擾Shp2表達(dá)后，Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)24小時(shí)，PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期。（**P〈0. 01)
[0045] 圖13顯示了組成性活化Stat3能夠抑制GADD45G介導(dǎo)的細(xì)胞衰老和增殖抑 制。其中，圖13A Tet-GADD45G-Sk-H印1經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)Ca-Stat3表達(dá)及對(duì)照質(zhì)粒后，Dox誘導(dǎo) GADD45G 表達(dá) 4 小時(shí)，Western blotting 檢測(cè) p_Stat3(Tyr705)、Stat3 及 GADD45G 的表 達(dá)情況。圖13B Tet-GADD45G-Sk-H印1經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)Ca-STAT3表達(dá)及對(duì)照質(zhì)粒后，Dox誘導(dǎo) GADD45G表達(dá)4天，SA-β-gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。圖13C Tet-GADD45G-Sk-H印1經(jīng) 轉(zhuǎn)導(dǎo)Ca-Stat3表達(dá)及對(duì)照質(zhì)粒后，Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)4天，PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期。圖 13D Tet-GADD45G-Sk-H印1經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)Ca-Stat3表達(dá)及對(duì)照質(zhì)粒后，Dox誘導(dǎo)GADD45G表達(dá)4 天，qRT-PCR檢測(cè)端粒酶hTERT的表達(dá)情況。（*P〈0. 05, **P〈0. 01)
[0046] 圖14顯示了組成性活化Stat3能夠在體內(nèi)抵抗GADD45G介導(dǎo)的腫瘤生長抑制 作用。其中，圖14A穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ca-Stat3或?qū)φ召|(zhì)粒的Tet-GADD45G-Sk-H印1皮下荷瘤， 經(jīng)Dox誘導(dǎo)GADD45G的表達(dá)后腫瘤形成情況。圖14B穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ca-Stat3或?qū)φ召|(zhì)粒的 Tet-GADD45G-Sk-H印1皮下荷瘤，經(jīng)Dox誘導(dǎo)GADD45G的表達(dá)后腫瘤生長狀況。圖14C各組 荷瘤組織的H&E染色及免疫組化檢測(cè)各組荷瘤組織的p-Stat3、Ki-67的表達(dá)情況。（X400)
【具體實(shí)施方式】
[0047] 本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了 GADD45G基因?qū)δ[瘤細(xì)胞尤其是 肝癌細(xì)胞的抑制作用是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老而得到的。促進(jìn)GADD45G基因的表達(dá)和/ 或活性有助于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了 GADD45G基因通過shp2介導(dǎo)的JAK-STAT3通路的抑制，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老。在此基 礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0048] GADD45G
[0049] GADD45家族蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，控制細(xì)胞的命運(yùn)。近年來的研究表明， GADD45家族GADD45A、GADD45B和GADD45G雖然蛋白同源性較高，但是功能仍然不近相同。
[0050] 在肝癌細(xì)胞H印G2中，體外實(shí)驗(yàn)表明GADD45家族蛋白皆能抑制細(xì)胞增殖，提示其 作為抑癌基因在發(fā)生發(fā)展中起較為重要作用。
[0051] GADD45G在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，機(jī)制涉及啟動(dòng)子甲基化或轉(zhuǎn)錄后修飾改變。 GADD45G表達(dá)的下調(diào)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是一潛在的抑癌基因。
[0052] 但是，目前GADD45G對(duì)肝癌的生物學(xué)效應(yīng)以及其中的作用機(jī)制仍然不完全清楚。 本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GADD45G對(duì)腫瘤的抑制作用是通過對(duì)腫瘤細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)而完成的， 旨在探討GADD45G對(duì)肝癌細(xì)胞生長的影響及其體內(nèi)、外生物學(xué)效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制。
[0053] 在本發(fā)明中，術(shù)語"本發(fā)明蛋白"、"本發(fā)明多肽"、"GADD45G蛋白"、"GADD45G多肽" 可互換使用，都指具有人蛋白GADD45G氨基酸序列的蛋白或多肽。應(yīng)理解，所述術(shù)語還包括 GADD45G的活性片段和衍生物。
[0054] 在本發(fā)明中，術(shù)語"本發(fā)明基因"、"本發(fā)明多核苷酸"指編碼GADD45G蛋白或 其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。人GADD45G基因位于染 色體9q22. I_q22. 2 ;其編碼序列長度為480bp。GADD45G基因的核酸序列如SEQ ID N0.:l(Genbank ID:NM_006705.3，CDS:lll-590)所示，Gene ID:10912,其編碼的蛋白序列 如 SEQ ID NO. :2,（Genbank ID:NP_006696. 1)所示：
[0055] 如本文所用，術(shù)語"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來（如果是天然的物 質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純 化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化 的。
[0056] 如本文所用，"分離的GADD45G蛋白或多肽"是指GADD45G蛋白基本上不含天然與 其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù) 純化GADD45G蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。在本 發(fā)明中，GADD45G蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0057] 本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多 肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0058] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0059] 編碼GADD45G的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多 肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附加編碼序列）以及 非編碼序列。術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還 包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0060] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或 非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0061] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本 文所用，"核酸片段"的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè) 核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)（如PCR)以確定 和/或分離編碼GADD45G蛋白的多核苷酸。
[0062] 本發(fā)明的人GADD45G核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或 人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱 讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的 cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增， 然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0063] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。 [0064] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通 過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0065] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引 物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方 法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0066] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或GADD45G蛋 白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
[0067] 通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組 的GADD45G蛋白。一般來說有以下步驟：
[0068] (1).用本發(fā)明的編碼人GADD45G蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核 苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0069] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0070] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0071 ] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人GADD45G編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn) 錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組 技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表 達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0072] 此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0073] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0074] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞 如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、C0S、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
[0075] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl 2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0076] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0077] 在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié) 合。
[0078] JAK-STAT3
[0079] JAK-STAT信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)重要的 生物學(xué)過程。它主要由三個(gè)成員組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子 STAT。
[0080] 其中，JAK是一類非跨膜型酪氨酸激酶，其蛋白家族共包括4個(gè)成員：JAKl、JAK2、 JAK3以及Tyk2。STAT則被稱為"信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子"，即其同時(shí)具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn) 錄激活的重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)六個(gè)STAT家族成員，即STAT1-STAT6。
[0081] 促進(jìn)劑和藥物組合物
[0082] 利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與GADD45G蛋白發(fā)生相互作 用的物質(zhì)，尤其是促進(jìn)劑等。
[0083] 本發(fā)明GADD45G蛋白的促進(jìn)劑，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用（給藥）時(shí)，可促進(jìn)GADD45G 蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老。在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45G促進(jìn) 劑包括的GADD45G基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分 子化合物。一種優(yōu)選的GADD45G促進(jìn)劑為MG-132。
[0084] 通常，可將這些促進(jìn)劑配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中， 其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括（但并不限 于）：瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
[0085] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明GADD45G蛋白或其 促進(jìn)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可 以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行 制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、 溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微 克-10毫克/千克體重。
[0086] 篩選藥物的方法
[0087] 本發(fā)明還提供了一種篩選制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的候選化合物的方法，包括步 驟：
[0088] (a)在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系添加測(cè)試化合物，并觀察測(cè)試組中所述細(xì)胞 GADD45G的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，向相同的培養(yǎng)體系不添加測(cè)試化合物，并觀察 對(duì)照組中所述細(xì)胞的GADD45G的表達(dá)量和/或活性；
[0089] 其中，如果測(cè)試組中的GADD45G的表達(dá)量和/或活性大于對(duì)照組，則說明該化合物 是對(duì)GADD45G有促進(jìn)作用的用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的候選化合物。
[0090] 本發(fā)明篩選藥物的方法還包括：
[0091] (b)對(duì)（a)中獲得的候選化合物，還進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)JAK-STAT3的抑制作用。
[0092] 在另一優(yōu)選例中，步驟（b)中還包括：在測(cè)試組中，向腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系添加測(cè)試 化合物，并觀察所述的腫瘤細(xì)胞的生長情況和/或細(xì)胞量；在對(duì)照組中，向相同培養(yǎng)體系不 添加測(cè)試化合物，并觀察所述的腫瘤細(xì)胞的生長情況和/或細(xì)胞量；
[0093] 其中，若測(cè)試組中衰老的細(xì)胞比例顯著大于對(duì)照組，和/或若測(cè)試組中的細(xì)胞量 顯著少于對(duì)照組，則說明，該化合物是用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的候選化合物。
[0094] 通用方法
[0095] I. 1 材料
[0096] 人肝癌細(xì)胞株H印3B、PLC/PRF/5、SK-H印1、SUN475以及THLE-2人正常肝細(xì)胞株 (CRL-2706)來自ATCC，人肝癌細(xì)胞株HuH-7購自日本Riken，人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購 自中科院細(xì)胞庫，人肝癌細(xì)胞株HCC-LM3、MHC-97H購自中山醫(yī)院肝癌研究所，LPC-H-Ras V12小鼠肝腫瘤細(xì)胞（CCTCC N0:C2010115)。pTRIPZ Tet-on表達(dá)質(zhì)粒來自Thermo公司，其 中 pTRIPZ-Con (空載）載體中，紅色突光蛋白（Turbo Red Fluorescent protein，tRFP)能 夠被強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)；cFUGW-Ca-Stat3及pT/CMV-SV40-LgT質(zhì)粒均購自Addgene公司。 細(xì)胞培養(yǎng)液 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、DMEM:F12 (1:1)以及胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國HyClone公司。噻唑蘭（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, MTT)、碘化丙陡（Propidium Iodide, PI)、7_氨基放線菌素 D(7_Aminoactinomycin D, 7-AAD)、強(qiáng)力霉素（doxycycline, Dox)、噪呤霉素和Na3VO4購自美國sigma公司； NCS-87877購自德國Merck公司。質(zhì)粒小抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公 司；LipofetAMINE 2000, optiDMEM 和總 RNA 提取試劑 TRIzol 購自美國 Invitrogen 公司； 限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，高保真酶PrimeStar?，RNA反轉(zhuǎn)試劑盒PrimeScript? RT Kit 和以 SYBY Green 為染料用于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (Quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 的 SYBR Premix Ex Taq? 試劑盒購自大連 TaKaRa。APC(allophycocyanin)_Annexin V 抗 體購于美國eBioscience公司。細(xì)胞衰老染色試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。 兔抗人GADD45G多克隆抗體、兔抗人Rb多克隆抗體、兔抗人p53單克隆抗體、鼠抗人p21/ ⑶KNlA單克隆抗體、兔抗人p27多克隆抗體、鼠抗人a -Tubulin單克隆抗體、兔抗人pl6 多克隆抗體、兔抗人Tyk2多克隆抗體和兔抗人Shp2多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公 司；兔抗人￥托4多克隆抗體、兔抗人燈-67多克隆抗體、兔抗人？-允1^2〇>1' 1°°7/1°°8)多克 隆抗體和兔抗人Jak2多克隆抗體購自美國Epitomics公司；兔抗人p-Stat3 (Tyr7°5)多克 隆抗體、兔抗人p-Tyk2(T yr1(l54/1°55)多克隆抗體、兔抗人p-Shp2(Tyr 58°)多克隆抗體和鼠抗 人Stat3單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。肝癌芯片及組織樣本 HLiv-HCC150CS-01 75對(duì)，150點(diǎn)肝癌芯片購于上海芯超公司；其余45對(duì)肝癌及癌旁組織樣 本來源于江蘇省啟東市肝癌防治研究所，用于RNA的提取以及蛋白檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)所用BALB/ c雄性裸鼠，6周齡，體重20g左右，皆購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于華東 師范大學(xué)動(dòng)物房。
[0097] I. 2GADD45G真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0098] 從GenBank中檢索獲得人源GADD45G的編碼序列，取其上、下游序列各約20bp為 引物，同時(shí)在引物兩端引入限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI (上游引物SEQ ID NO. :3:5'-CG GACCGGTGCCACCATGACTCTGGAAGAAGTCCG-3'；下游引物 SEQ ID N0.:4:5'-GCCGAATTCTCACT CGGGGAGGGTGATGCTGGGC-3'）。提取THLE-2細(xì)胞(人肝永生化細(xì)胞）的mRNA，然后逆轉(zhuǎn)錄得 到全基因組cDNA，以此為模板，做PCR擴(kuò)增反應(yīng)：98°C預(yù)變性30s ;98°C 10s，60°C 15s， 72°〇458共30個(gè)循環(huán)；最后721：延伸51^11。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳后回收 目的片段。PCR產(chǎn)物目的片段經(jīng)膠回收后，與pTRIPZ載體一并用限制性內(nèi)切酶AgeI和 EcoRI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，4h后再次瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，得到產(chǎn)物行酶連反應(yīng)，反 應(yīng)體系為 pTRIPZ0.5yL (含 300ng DNA)，外源 DNA 插入片段 4.5yL (含 400ng DNA)和 Solution I 5yL，16°C水浴中過夜連接，然后轉(zhuǎn)化大埃希菌Stble3,均勻涂于含氨節(jié)青霉 素 （amp i c i 11 in, Amp)的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌落，加入含有Amp抗性的LB 液體培養(yǎng)液中，37°C，275r / min搖菌15h，提取質(zhì)粒后再酶切鑒定，后送至上海英駿生物有 限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的克隆采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，存放于-20°C冰箱 中保存。
[0099] 1. 3病毒制備和細(xì)胞感染
[0100] 接種細(xì)胞數(shù)約為3. 5X IO5個(gè)/孔(使用不加抗生素的培養(yǎng)基）的慢病毒包裝293T 細(xì)胞于6孔板中，24h培養(yǎng)后將載體質(zhì)粒pTRIPZ-Con (空載)和pTRIPZ-GADD45G (含目的基 因載體）分別與輔助質(zhì)粒PSPAX2及pMD2G(共4μ g ;質(zhì)量比，載體：psPAX2 :pMD2G=3:2:1) 相互混合，加入 250 μ L optiDMEM 里，然后將 10 μ L LipofetAMINE 2000 亦放入 250 μ L optiDMEM中，靜置3min，混合，室溫放置30?40min，使表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體充分混勻，隨后將 混合液加至293T細(xì)胞中。48h后，收取含有病毒的上清，500 X g離心5min，0. 45 μ m的濾網(wǎng) 過濾。將處于對(duì)數(shù)生長期的待感染的目的細(xì)胞鋪至24孔板，細(xì)胞密度為30%，貼壁培養(yǎng)24h 后準(zhǔn)備感染。在病毒上清液中，加入凝聚胺（polybrene;終質(zhì)量濃度為8yg/mL)，混勻后， 加入待感染細(xì)胞中（每孔300 μ L，），重復(fù)感染2次，每次12?16h，采用終濃度為5 μ g/mL 的嘌呤霉素篩選病毒感染后的目的細(xì)胞1周，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞系。
[0101] I. 4BrdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖
[0102] 6孔板中接種滿度為30%?40%目的細(xì)胞，過夜后去上清液，換條件培養(yǎng)基，處理 72h后按照BrdU流式檢測(cè)試劑盒（BD公司）說明書進(jìn)行BrdU摻入及流式檢測(cè)。
[0103] I. 5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖
[0104] 取對(duì)數(shù)生長期的目的細(xì)胞，按I X IO4個(gè)/mL的密度200 μ L每孔接種于96孔板。 過夜后，去上清液，換含有0. 5 μ g/mL Dox和10%FBS的DMEM處理細(xì)胞72h后于每孔中加入 MTT溶液20 μ L (5ng / mL)，37°C條件下培養(yǎng)3h，棄去上清液，每孔加入DMS0150 μ L，混勻， 利用分光光度計(jì)于540nm波長處測(cè)定各孔吸光度（D)值。
[0105] 1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)
[0106] 6孔板中接種滿度為30%?40%目的細(xì)胞，過夜后去上清液，換條件培養(yǎng)姐，處 理72h后用胰酶消化，經(jīng)PBS沖洗后，500Xg離心收集細(xì)胞，以ImL染色緩沖液（binding buffer)懸浮細(xì)胞，并移人流式管中，再500Xg離心收集細(xì)胞，以100 μ L染色緩沖液懸浮 并移人流式管中避光加入2. 5 μ LAPC-Annexin V以及0. 1 μ L7-AAD，混勻反應(yīng)30min，補(bǔ)充 100?200 μ L染色緩沖液，上流式細(xì)胞儀（FACSCalibur?流式細(xì)胞儀，Becton Dickinson) 檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
[0107] 1.7細(xì)胞周期檢測(cè)
[0108] 取對(duì)數(shù)生長期的目的細(xì)胞，按5 X IO4個(gè)/mL的密度2mL每孔接種于6孔板中。過 夜后去除上清液，細(xì)胞換條件培養(yǎng)基培養(yǎng)96h后用胰酶消化，經(jīng)PBS沖洗后，500Xg離心 5min收集細(xì)胞。除上清液，加預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞，于-20° C長期固定。待細(xì)胞染色 時(shí)，500 Xg離心5min收集細(xì)胞，用ImL的PBS洗細(xì)胞一次，加入IOOyL含PI (50yg/mL) 和RNase A (100 μ g/mL)的PBS重懸細(xì)胞，室溫避光孵育30min。在加入200 μ L PBS后，上 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞檢測(cè)周期。
[0109] 1. 8衰老相關(guān)半乳糖苷酶染色
[0110] 6孔板中接種滿度為30%?40%目的細(xì)胞，過夜后去上清液，換條件培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì) 胞，72h后，用PBS洗滌2次，染色固定液固定15min，再用PBS洗滌3次，加入衰老相關(guān)半乳 糖苷酶染色（senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal)染色液 lmL，37°C 條件下隔絕CO2染色過夜后于倒置顯微鏡（Zeiss)明場(chǎng)觀察。
[0111] I. 9qRT-PCR檢測(cè)目的基因 mRNA的表達(dá)
[0112] 利用TRIzol試劑提取目的細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄mRNA得到cDNA。IL-8上游引物：5 ，-ACCACCGGAAGGAACCATCTCAC-3'（SEQ ID NO. :5)，下游引物：5'-AGCACTCCTTGGCMAACTGCAC -3'（SEQ ID NO. :6) ;IL-6 上游引物：5'-GAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGA-3'（SEQ ID NO. :7)， 下游引物：5' -GTTGGGTCAGGGGTGGTTATT-3'（SEQ ID NO. :8) ;GADD45G 上游引物：5' -GTCTA CGGAGTCAGCCAAAGTC-3'（SEQIDN0·:9)，下游引物：5'-AAAGCCTGGATCAGCGTAAAAT-3'（SEQ ID NO. :10) ;hTERT 上游引物：5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'（SEQ ID NO. :11)，下游引物： 5' -GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'（SEQ ID NO. :12);內(nèi)參照 GAPDH 上游引物：5' -CATGAGAAGT ATGACAACAGCCT-3'（SEQIDN0·:13)，下游引物：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'（SEQID NO. : 14)(引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）。然后采用SYBR方法，按SYBR Premix Ex Taq? 試劑盒的要求在 Real-time7300PCR 儀（ABI7300，Applied Biosystem)上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。結(jié)果采用相對(duì)定量法比較mRNA的表達(dá)差異，利用Ct值計(jì)算，以表示目的基 因 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，Λ ACt = (Ct目的基因一Ct GAPDH)實(shí)驗(yàn)組一（Ct目的基因一Ct GATOH)對(duì)照組。
[0113] 1. 10蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)哀老相關(guān)蛋白的表達(dá)
[0114] 收取目的細(xì)胞，冰冷PBSlmL洗滌2次，加適量的蛋白裂解液，冰上裂解細(xì)胞lh，其 中每隔20min吹打一次，然后12000 X g4°C離心30min，上清即為裂解所得蛋白，每孔上樣總 蛋白50 μ g，經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜，轉(zhuǎn)膜90min后，用5%的BSA 封閉60min，加入1:1000稀釋的一抗，4°C過夜；TBST緩沖液充分漂洗后加入I :5000稀釋 的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗，室溫反應(yīng)2h，TBST洗膜3次，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試 劑（ECL)顯色，由ChemiDoc?XRS成像系統(tǒng)（Bio-Rad)獲取條帶圖像。
[0115] 1.11克隆形成實(shí)驗(yàn)
[0116] 取對(duì)數(shù)生長期的目的細(xì)胞，按IX IO3個(gè)/mL、0. 5X IO3個(gè)/mL和0. 5X IO3個(gè)/mL密 度2mL每孔接種于35mm皿中，鋪板均勻。24小時(shí)貼壁后各組分別給予或不給予Dox處理。 每3d換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)7d后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗兩次。甲醛固定30min，用自來水洗 5min后利用結(jié)晶紫染色lh，再次用自來水洗去背景，過夜晾干后于掃描儀掃描。
[0117] I. 12RNA 干擾
[0118] 取對(duì)數(shù)生長期的目的細(xì)胞，按5X104個(gè)/mL的密度2mL每孔接種于6孔板中。24h 后去除上清液，換為ImL DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)lh。準(zhǔn)備兩個(gè)已加入250yLopti-DMEMRNase Freel. 5mL EP管，一管加入終濃度為IOOpM的目標(biāo)siRNA，另一管加入5μ L的脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000,室溫靜置5min。充分混勻后，室溫靜置45min。將500 μ L轉(zhuǎn)染混 合物均勻滴加到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，前后移動(dòng)培養(yǎng)皿，混合均勻。6 h后去除上清液換成完全 DMffl培養(yǎng)基。p21特異siRNA隨機(jī)混合物(貨號(hào):EHU003861). p27特異siRNA混合物(貨 號(hào):EHU025821). p53特異siRNA混合物(貨號(hào):EHU123221)、Rb特異siRNA混合物(貨 號(hào):EHU023531)購自 Sigma 公司、Shp2_l 特異 siRNA (貨號(hào)：SASI_Hs02_00334550)及 Shp2-3 特異 siRNA (貨號(hào)：SASI_Hs02_00334551)均購自 Sigma 公司；pl6 特異 siRNA 序列 為CGCACCGCCTAGTTACGGT，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
[0119] 1.13荷瘤實(shí)驗(yàn)
[0120] 實(shí)驗(yàn)一：過表達(dá)GADD45G皮下荷瘤情況
[0121] 每只BalB/C裸鼠右下側(cè)腿周皮下接種含5X IO6個(gè)導(dǎo)入不同質(zhì)粒的SK-H印1細(xì)胞 的200 μ L PBS (每組10只）。每組又隨機(jī)分為兩組，一組給予含2 μ g/mL Dox的水，另一組 正常給水。觀察50d，每隔3d觀察一次腫瘤大小。
[0122] 實(shí)驗(yàn)二：過表達(dá)組成性活化的Stat3對(duì)GADD45G細(xì)胞成瘤影響
[0123] 每只BalB/C裸鼠右下側(cè)腿周皮下接種含6X IO6個(gè)導(dǎo)入不同質(zhì)粒的SK-H印1細(xì)胞 的200 μ L PBS (每組16只）。每組又隨機(jī)分為兩組，一組給予含2 μ g/mL Dox的水，另一組 正常給水。觀察50d，每隔3d觀察一次腫瘤大小。
[0124] 1.14 免疫組化（IHC)
[0125] 取新鮮的腫瘤組織放入4%福爾馬林（PFA)中，室溫24h后于4°C保存。按照常規(guī) 石蠟包埋的方法進(jìn)行包埋、切片（4 μ m厚)、烤片、脫蠟。然后將貼有切片的載玻片放入PH=6 的0. OlM的檸檬酸緩沖液中，微波爐中火加熱lOmin，再用大火加熱IOmin冷卻至室溫。于 蒸饋水中處理一次，5min。在放入3%H 202，10min。蒸饋水中處理一次，5min，再用PBS洗二 次。小心去除液體，用10%TBST配置的BSA封閉，lh。加入適量比例的一抗，4°C過夜，PBS洗 三次，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37°C孵育lh，PBS洗三次。DAB顯色，自來水沖洗 3min后，蘇木素染色2min，自來水沖洗15min。中性樹膠封片。于正置顯微鏡下觀察分析。
[0126] 本發(fā)明的有益效果
[0127] 1.本發(fā)明應(yīng)激蛋白GADD45G基因或其表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老，可用于抑制 腫瘤細(xì)胞尤其是肝癌細(xì)胞的生長或增殖。
[0128] 2. GADD45G基因或其表達(dá)產(chǎn)物通過JAK-STAT3通路誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，而非通過常規(guī) 細(xì)胞衰老途徑。
[0129] 3.通過上調(diào)Shp2抑制JAK-STAT3通路是誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的關(guān)鍵因素。
[0130] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0131] 實(shí)施例1GADD45G基因在肝癌與其癌旁組織之間表達(dá)比較，及其表達(dá)與臨床病理 評(píng)分之間的關(guān)系
[0132] I. 1檢測(cè)了 8個(gè)肝癌細(xì)胞系中GADD45G的表達(dá)情況，以SV-40轉(zhuǎn)化的永生化正常肝 細(xì)胞系THLE-2的GADD45G表達(dá)為參照。
[0133] 結(jié)果顯示，8個(gè)肝癌細(xì)胞系中GADD45G的轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于THLE-2細(xì)胞系（圖 1A，Ρ〈0· 05)。
[0134] 1.2以DEN藥物誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞性腫瘤作為模型，分別提取小鼠肝癌及癌旁組織 RNA，GADD45G轉(zhuǎn)錄水平亦是在肝癌中顯著下降（圖1Β，Ρ〈0. 05)。分別提取了 45對(duì)以及12 對(duì)人肝癌和癌旁組織的RNA和蛋白，發(fā)現(xiàn)在人肝癌中GADD45G轉(zhuǎn)錄（圖1C，Ρ〈0. 001)和蛋白 水平顯著低于癌旁組織（圖1D)。
[0135] 1. 3分析GADD45G的表達(dá)是否與臨床病理評(píng)分相關(guān)
[0136] 經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)GADD45G的表達(dá)與性別，年齡以及腫瘤大小沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(表 1)。
[0137] 表1組織芯片中GADD45G表達(dá)情況一覽表
[0138]
【權(quán)利要求】
1. 一種GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰 老的藥物組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GADD45G來自哺乳動(dòng)物。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑包括 的GADD45G基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合 物。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物包括所述GADD45G基因、 蛋白或其促進(jìn)劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
5. -種用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括 GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑以及藥學(xué)上可接受的鹽。
6. -種篩選制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的候選化合物的方法，其特征在于，包括步驟： (a) 在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系添加測(cè)試化合物，并觀察測(cè)試組中所述細(xì)胞GADD45G 的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，向相同的培養(yǎng)體系不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組中 所述細(xì)胞的GADD45G的表達(dá)量和/或活性； 其中，如果測(cè)試組中的GADD45G的表達(dá)量和/或活性大于對(duì)照組，則說明該化合物是對(duì) GADD45G有促進(jìn)作用的用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的候選化合物。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步驟還包括： (b) 對(duì)（a)中獲得的候選化合物，還進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)JAK-STAT3的抑制作用。
8. -種JAK-STAT3抑制劑的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的藥物組 合物。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的JAK-STAT3抑制劑包括GADD45G基 因、蛋白或其促進(jìn)劑和/或shP2基因、蛋白或其促進(jìn)劑。
10. -種體外非治療性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的方法，其特征在于，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加 入GADD45G基因、蛋白或其促進(jìn)劑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老。
【文檔編號(hào)】A61K38/19GK104225621SQ201310242123
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月18日
【發(fā)明者】劉永忠, 楊兆娟, 張力, 馬愛輝 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所