一種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其包括如下步驟：構(gòu)建攜帶金屬硫蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV-MCS-hMT；制備攜帶人金屬硫蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT，測(cè)定滴度；將重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，得到攜帶人金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明得到的攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用于衰老模型小鼠，能有效延緩小鼠衰老進(jìn)程；將其用于高血鉛模型小鼠，可明顯降低小鼠血鉛含量。
【專利說明】—種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，本發(fā)明涉及一種攜帶人金屬硫蛋白(Human Metalloth1nein, hMT)基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法,及其在氧自由基、重金屬導(dǎo)致疾病或衰老治療中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]金屬硫蛋白(Metalloth1nein，MT)是指一類低分子量、高巰基含量(20%_30%)，能大量結(jié)合金屬離子的性能獨(dú)特的蛋白質(zhì)或活性肽。在人體、動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)均廣泛存在。MT具有非常保守的一級(jí)結(jié)構(gòu)和相似的空間結(jié)構(gòu)，在許多物種中MT以多種亞型存在。
[0003]MT具有較強(qiáng)的清除自由基的作用。自由基過剩或任何引起自由基過程剩的因素均會(huì)引起細(xì)胞病變，影響細(xì)胞正常功能的發(fā)揮，甚者引起衰老及疾病。天然形式下MT中的巰基均以還原狀態(tài)存在，巰基具親核性，從而使MT易與親電性物質(zhì)特別是某些自由基相互作用。MT對(duì)自由基如羥自由基(OH)，氧自由基(O2)或一氧化氮(NO)等有較強(qiáng)的清除作用。MT是訖今為止發(fā)現(xiàn)的清除自由基最強(qiáng)的活性蛋白蛋(或多肽)，其清除羥自由基(OH)的能力約為SOD的10，000倍，而清除氧自由基(O)的能力約是谷胱甘肽(GSH)的25倍。
[0004]MT富含巰基及其重金屬結(jié)合能力決定了它在重金屬解毒方面起著重要的作用。MT的巰基基團(tuán)(-SH)能強(qiáng)烈螯合有毒重金屬Hg、Pb、Cd、As等，其中螯合Pb的強(qiáng)度比Zn大200倍，而螯合Cd的強(qiáng)度又比Pb大10倍[13]，從而使它們無法毒害人體，同時(shí)對(duì)體內(nèi)Zn等微量元素?zé)o影響。這對(duì)保護(hù)大腦、肝、腎等人體重要器官具有極其重要意義。
[0005]目前，MT的來源主要有三類，一類是在培養(yǎng)基中添加金屬離子，直接誘導(dǎo)微生物生產(chǎn)MT;另一類是對(duì)動(dòng)物喂養(yǎng)含金屬離子的飼料或者注射相關(guān)溶液，然后從動(dòng)物內(nèi)臟中提取MT ;還有的就是利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)MT。這幾類生產(chǎn)方法都存在著產(chǎn)量極低，成本高、提純步驟復(fù)雜的缺陷，更值得一提的是直接誘導(dǎo)法、動(dòng)物提取法產(chǎn)生的MT為非人源性MT，且常結(jié)合有重金屬，失去了清除氧自由基和結(jié)合重金屬的能力。因此，針對(duì)MT的轉(zhuǎn)基因治療將逐漸成為研究的熱點(diǎn)方向。
[0006]胳帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical-derivedmesenchymal stem cells, UMSCs)是存在于臍帶華通氏膠和血管周圍組織中的一種干細(xì)胞，具有多向分化和自我更新的潛能。UMSCs具有以下優(yōu)點(diǎn):臍帶是分娩后的廢棄物，取材方便；UMSCs可在體外分離、培養(yǎng)，擴(kuò)增迅速，且生物學(xué)特性穩(wěn)定；UMSCs免疫原性低，異體移植不引起免疫排斥反應(yīng)；UMSCs具有分泌 SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL_6、GM-CSF、G_CSF、SDF_1、VEGF 等因子的特性，具有免疫調(diào)節(jié)功能，可用于自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。當(dāng)前，針對(duì)MSC抗衰老、MSC基因修飾等研究才剛剛興起，國(guó)內(nèi)外尚無攜帶hMT基因UMSCs構(gòu)建的報(bào)道，亦無其用于氧自由基、重金屬導(dǎo)致的疾病治療、抗衰老的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種具有較強(qiáng)實(shí)用價(jià)值的攜帶人金屬硫蛋白(HumanMetalloth1nein, hMT)基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞方法。得到的攜帶hMT基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有分泌hMT、SCF、LIF、M-CSF, Flt_3、IL-6等因子，去除氧自由基或重金屬，調(diào)節(jié)體內(nèi)微環(huán)境的特性。將其用于衰老模型小鼠，能有效延緩小鼠衰老進(jìn)程；將其用于高血鉛小鼠，可明顯降低血鉛含量。
[0008]本發(fā)明的攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，包含如下步驟:
(1)將人金屬硫蛋白基因連接到腺相關(guān)病毒載體PAAV-MCS上，得到攜帶人金屬硫蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS-hMT，鑒定人金屬硫蛋白基因已連接到腺相關(guān)病毒載體上；
(2)利用磷酸鈣共沉淀法將重組腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS-hMT、pHelper和pAAV-RC共轉(zhuǎn)染到AAV-293細(xì)胞中，培養(yǎng)直至AAV-293細(xì)胞出現(xiàn)表型變化和毒性反應(yīng)；
(3)收集細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融后，收集含有重組腺相關(guān)病毒株rAAV-hMT的上清液，純化并測(cè)定毒株的滴度；
(4)將重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT按20M0I加入第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，得到攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0009]步驟(I)所述的人金屬硫蛋白基因經(jīng)RcoR I和Xba I雙酶切后插入pAAV-MCS，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pAAV- MCS-hMT ;合成鑒定引物 5 ’ -ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3 ’，5 ’ -CAGCTGCACTTGTCTGACGT -3’ ；測(cè)序鑒定hMT基因正確連接到pAAV- MCS質(zhì)粒上；
步驟(2 )培養(yǎng)AAV-293細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80%，制備lmg/mL濃度的pAAV-MCS-hMT、pAAV-RC、pHelper，共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞進(jìn)行重組病毒包裝。于37°C、5%C02條件下轉(zhuǎn)染孵育6 h后，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)直至AAV-293細(xì)胞出現(xiàn)表型變化和毒性反應(yīng)，完成病毒包裝；
步驟(3)收集細(xì)胞懸液輪流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰凍和37°C水浴箱中融化，反復(fù)凍融4次，每次10分鐘，室溫下1000g轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集含有重組腺相關(guān)病毒株rAAV-hMT的上清液，純化并測(cè)定毒株的滴度；
步驟(4)將重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT按20M0I加入第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，5%C02, 37 V細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，得到攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0010]采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明方法可獲得一種攜帶有人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以2 X 105/ml細(xì)胞濃度結(jié)種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于5%C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)液中人金屬硫蛋白含量明顯升高。該攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或分泌液可用來制備成用于氧自由基、重金屬導(dǎo)致疾病或衰老治療的制品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1.重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT的構(gòu)建示意圖；
圖2.MTS法測(cè)定20M0I腺相關(guān)病毒rAAV-hMT感染UMSCs細(xì)胞存活率結(jié)果圖；
圖3.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定攜帶人金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)果圖；
圖4.攜帶人金屬硫蛋白基因UMSCs的成骨、成脂分化結(jié)果圖圖5.qRT-PCR法檢測(cè)攜帶人金屬硫蛋白UMSCs hMT mRAN水平結(jié)果圖； 圖6.攜帶人金屬硫蛋白基因UMSCs對(duì)重金屬Cd2+、Pb2+耐受性鑒定結(jié)果圖；
圖7.攜帶人金屬硫蛋白基因UMSCs對(duì)衰老小鼠血清MT、腦組織端粒酶影響結(jié)果圖； 圖8.攜帶人金屬硫蛋白基因UMSCs對(duì)高鉛小鼠的促排鉛作用結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0012]以下結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例一攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
本發(fā)明將兩端含有RcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)的hMT基因片段和pAAV- MCS質(zhì)粒用RcoRI和Xba I雙酶切，用T4連接酶將hMT基因連接到pAAV- MCS質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAV-MCS-hMT ;合成鑒定引物 5’ -ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3’，5’ - CAGCTGCACTTGTCTGACGT -3’ ；進(jìn)行測(cè)序鑒定hMT基因正確連接到pAAV- MCS質(zhì)粒上(見圖1)。將lmg/mL濃度的pAAV-MCS-hMT、pAAV-RC、pHelper，共轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)密度約80%的AAV-293細(xì)胞進(jìn)行重組病毒包裝，37°C、5%C02條件下孵育6 h后，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)直至AAV-293細(xì)胞出現(xiàn)表型變化和毒性反應(yīng)，完成重組腺相關(guān)病毒株rAAV-hMT的包裝。收集細(xì)胞懸液輪流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰凍和37°C水浴箱中融化，反復(fù)凍融4次，每次10分鐘，室溫下1000g轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集含有重組腺相關(guān)病毒株rAAV-hMT的上清液，超濾濃縮純化并測(cè)定毒株的滴度；將重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT按20M0I加入第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期UMSCs培養(yǎng)液中，5%C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，得到攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。將攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以3X 104/ml細(xì)胞濃度結(jié)種至96孔板，置于5%C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72、96小時(shí)，細(xì)胞具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)(見圖2)。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)果與UMSCs相比，表面標(biāo)記無明顯變化(見圖3)。攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨、成脂分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其分化能力無明顯變化(見圖4)。
[0013]實(shí)施例二攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中hMT mRAN水平鑒定
合成hMT熒光定量PCR引物5’- CCMCTGCTCCTGCTCGC -3’，5’- CAGCTGCACTTGTCTGACGT-3’。將細(xì)胞株I =UMSCs ;細(xì)胞株2:空載腺相關(guān)病毒感染的UMSCs ;細(xì)胞株3:本發(fā)明獲得的攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共3種細(xì)胞株，傳代至細(xì)胞培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%密度，用PBS洗3遍后，加I ml TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，取2 μ g的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。熒光實(shí)時(shí)定量PCR鑒定hMT mRNA水平。反應(yīng)體系:SYBR Green mix 25μ L,2.0μ L cDNA模板、引物各IyL(1nmoI/L )、用 ddH20 補(bǔ)足體系至 50 μ L。反應(yīng):95°C、2 min，然后 95°C、30s，55°C、30s，72°C、30s，共40個(gè)循環(huán)，最后72°C、5min延伸。同時(shí)設(shè)置6個(gè)濃度梯度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞株1、細(xì)胞株2和細(xì)胞株3中hMT mRNA和內(nèi)參基因β-actin mRNA的相對(duì)含量。重復(fù)檢測(cè)3次。結(jié)果顯示細(xì)胞株3中hMT mRNA表達(dá)水平較細(xì)胞株1、細(xì)胞株2增高約16培(圖5)。
[0014]實(shí)施例四攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)重金屬Cd2+、Pb2+的耐受性將細(xì)胞株I =UMSCs ;細(xì)胞株2:空載腺相關(guān)病毒感染的UMSCs ;細(xì)胞株3:本發(fā)明獲得的攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以3X104/ml細(xì)胞濃度結(jié)種至96孔板，每孔lOOul，置于5%C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜，去除舊培養(yǎng)液，分別添加含有CdCl2 (終濃度25 μ m/L)、醋酸鉛(終濃度50 μ m/L)的培養(yǎng)液100 μ L，以添加新鮮培養(yǎng)液100 μ L為正常對(duì)照。置CO2孵箱中37°C培養(yǎng)I，2，3，4天，每孔加入MTS 15 μ L，培養(yǎng)4小時(shí)，震蕩5min，用酶標(biāo)儀于490nm處測(cè)吸光度A值，繪制生長(zhǎng)曲線。其結(jié)果說明，細(xì)胞株I，細(xì)胞株2的生長(zhǎng)均受到50 μ m/L CdCl2,75 μ m/L醋酸鉛的抑制；而細(xì)胞株3對(duì)50 μ m/LCdCl2、75 μ m/L醋酸鉛具有顯著的耐受性(圖6)。
[0015]實(shí)施例五攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用
本發(fā)明采用D-半乳糖致小鼠衰老模型評(píng)價(jià)UMSCs-hMT的抗衰老作用。將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常組、模型組、治療組1、治療組2、治療組3。治療組I在衰老模型制備成功后，經(jīng)尾靜脈給予UMSCs 5X105，間隔3天，給予第二次注射；治療組2在衰老模型制備成功后，經(jīng)尾靜脈給予空載腺相關(guān)病毒感染UMSCs 5X 105，間隔3天，給予第二次注射；治療組3在衰老模型制備成功后，經(jīng)尾靜脈給予攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞5X105，間隔3天，給予第二次注射；正常組、模型組均同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射給予等量生理鹽水。采用Gd-血紅素飽和法檢測(cè)血清中MT變化、端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法檢測(cè)腦組織端粒酶活性，可見治療組1、治療組2和治療組3小鼠的兩項(xiàng)指標(biāo)均具有一定程度的升高，治療組3升高尤為顯著(圖7)。其結(jié)果說明，D-半乳糖致衰老模型小鼠經(jīng)尾靜脈輸入攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能有效地延緩小鼠衰老進(jìn)程。
[0016]實(shí)施例六攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高鉛小鼠的促進(jìn)排鉛作用本發(fā)明采用預(yù)防性高鉛小鼠模型評(píng)價(jià)攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的排鉛作用。將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、治療組1、治療組2、治療組3。正常組給予飲用水；模型組給予飲用lg/L醋酸鉛水溶液；治療組在給予飲用Ig/L醋酸鉛水溶液的同時(shí)，治療組I經(jīng)尾靜脈給予UMSCs 5X 105，治療組2經(jīng)尾靜脈給予空載腺相關(guān)病毒感染UMSCs 5X105,治療組3經(jīng)尾靜脈給予攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞5 X 15,正常組和模型組均經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。經(jīng)24小時(shí)，取適量血，原子吸收廣譜測(cè)定鉛含量。正常組小鼠血鉛含量平均約為0.04 μ g/g，模型組小鼠血鉛含量平均約為0.53 μ g/g,治療組I小鼠血鉛含量平均約為0.45 μ g/g,治療組2小鼠血鉛含量平均約為0.48 μ g/g,治療組3小鼠血鉛含量平均約為0.15 μ g/g，其結(jié)果說明，UMSCs-hMT對(duì)高鉛小鼠具有顯著的促進(jìn)排鉛作用(圖8)。
【權(quán)利要求】
1.一種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)將金屬硫蛋白基因連接到腺相關(guān)病毒載體PAAV-MCS上，得到攜帶金屬硫蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS-hMT，鑒定金屬硫蛋白基因已連接到腺相關(guān)病毒載體上； (2)利用磷酸鈣共沉淀法將重組腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS-hMT、包裝質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到AAV-293細(xì)胞中，培養(yǎng)至AAV-293細(xì)胞出現(xiàn)表型變化和毒性反應(yīng)； (3)收集細(xì)胞懸液，采用反復(fù)凍融方法，收集含有重組腺相關(guān)病毒株rAAV-hMT的上清液，純化并測(cè)定rAAV-hMT毒株的滴度； (4)重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，得到攜帶有金屬硫蛋白基因的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)獲得重組腺相關(guān)病毒株rAAV-hMT的步驟為:收集細(xì)胞懸液輪流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰凍和37°C水浴箱中融化，反復(fù)凍融4次，每次10分鐘，室溫下1000g轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集上清液，純化并測(cè)定毒株滴度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟為:將重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT按20M0I加入第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，5%C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述重組腺相關(guān)病毒rAAV-hMT 所用載體為 pAAV_MCS 質(zhì)粒、pHelper 和 pAAV-RC 質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述攜帶人金屬硫蛋白基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或其分泌液制備成用于氧自由基、重金屬等導(dǎo)致疾病或衰老治療的制品O
【文檔編號(hào)】A61P39/02GK104232585SQ201310251408
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月24日
【發(fā)明者】湛敏, 其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開姓名 申請(qǐng)人:丁長(zhǎng)才, 湛敏