抗pd-1抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了以高親和力與PD-1特異性結(jié)合的抗體或其功能性片段。還提供了編碼本發(fā)明抗體或其功能性片段的核酸分子，用于表達本發(fā)明抗體或其功能性片段的表達載體和宿主細胞，以及本發(fā)明抗體或其功能性片段的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明抗體或其功能性片段的免疫綴合物以及藥物組合物，以及使用本發(fā)明的抗體或其功能性片段治療多種疾病(包括癌癥和感染性疾病、炎性疾病)的方法。
【專利說明】抗PD-1抗體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及以高親和力與ro-i特異性結(jié)合的抗體或其功能 性片段。還提供了編碼本發(fā)明抗體或其功能性片段的核酸分子，用于表達本發(fā)明抗體或其 功能性片段的表達載體和宿主細胞，以及本發(fā)明抗體或其功能性片段的生產(chǎn)方法。本發(fā)明 還提供了包含本發(fā)明抗體或其功能性片段的免疫綴合物以及藥物組合物，以及使用本發(fā)明 的抗體或其功能性片段治療多種疾?。òò┌Y和感染性疾病、炎性疾?。┑姆椒?。

【背景技術(shù)】
[0002] 程序性死亡因子1 (programmed cell deathl，PD-1)是⑶28家族成員，并且是 在活化T細胞和B細胞表面上表達的免疫抑制性受體（Yao，Zhu et al. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation. Nat Rev Drug Discov，2013，12(2):130-146)。該受體和其配體PD-L1和PD-L2相結(jié)合可以有 效降低免疫T細胞參與的免疫應(yīng)答。腫瘤細胞通過高表達ro-Li逃逸機體內(nèi)免疫監(jiān)督 (Okazaki 和 Hon jo, PD-1 and PD-1 ligands ：from discovery to clinical application. International Immunology，2007,19 (7) :813-8242007)。阻斷 PD1 與 PD-L1 的相互作用可 以顯著提高CD8+細胞毒T細胞的活性，以殺傷腫瘤細胞。
[0003] ro-Ι主要表達于⑶4+Τ細胞、⑶8+Τ細胞、ΝΚΤ細胞、Β細胞和活化的單核細胞 表面，主要受T細胞受體（TCR)或B細胞受體（BCR)信號的誘導表達，TNF可增強ro-1 在這些細胞表面的表達（Francisco，Sage et al.，The PD-lpathway in tolerance and autoimmunity. Immunol Rev，2010, 236 :219-242)。人Η)_1 由基因 Pdcdl 編碼，位于 2q37. 3， 全長9. 6kb，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，其上游包含663bp的啟動子。ro-1分子結(jié)構(gòu) 由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成，胞外區(qū)的氨基酸序列和CTLA-4有24%的同源性，和CD28 具有28%的同源性，其基因主要有7個單核甘酸多態(tài)性位點。胞外區(qū)含有一個免疫球蛋白 可變區(qū)IgV結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)含有兩個基于酪氨酸的信號轉(zhuǎn)導模體ITIM(免疫受體酪氨酸抑 制作用模體）和itsm(免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換作用模體）。在τ細胞被激活后，ro-i主要通 過ITSM模體，將酪氨酸磷脂酶SHP2集合，導致包括⑶3 ζ、PKC Θ和ZAP70等效應(yīng)分子的去 磷酸化。
[0004] PD-1 配體有兩個：PD-L1 和 PD-L2。PD-L1 又稱 B7H1 或 CD274, PD-L2 稱為 B7DC 或CD273。H)-L基因位于人的染色體9p24. 2位點，大小為42kb。這些配體和B7-1、B7-2、 IC0SL有21?27 %的氨基酸序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性：均包含一個免疫球蛋白樣可變 區(qū)結(jié)構(gòu)域、一個恒定區(qū)樣結(jié)構(gòu)域和一個跨模區(qū)和一個短的胞質(zhì)尾巴，PD-L1的胞質(zhì)尾巴比 PD-L2更保守。PD-Ll和F>D-L2表達于不同的細胞群體（Shimauchi，Kabashimaetal·， Augmented expression of programmed death-lin both neoplastic and non-neoplastic CD4+ T-cells in adult T-cell leukemia/lymphoma. Int J Cancer,2007,121 (12)： 2585-2590)，這些細胞包括非造血組織以及各種腫瘤類型。H)-L1主要表達于T細胞、B細 胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、間充質(zhì)干細胞和骨髓來源的肥大細胞。PD-L1也表達于非骨髓來 源的細胞，如血管內(nèi)皮細胞、上皮細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞、胰島細胞，腦 部星狀細胞和各類非淋巴系腫瘤如黑色素瘤、肝癌、胃癌、腎細胞癌，亦表達于免疫特赦部 位的細胞，如胎盤、眼睛。這表明ro-Ll在調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T、B細胞和免疫耐受方面具有一 定廣泛性，并且在外周組織T和B細胞應(yīng)答起作用。但是ro-L2表達區(qū)域卻極其有限，僅在 巨噬細胞和樹突細胞中存在，被認為主要在免疫呈遞中起作用。
[0005] ro-i和ro-Ll相互作用以調(diào)節(jié)控制τ細胞的活化在腫瘤和病毒感染中得到了大量 驗證。PD-L1表達于多種腫瘤細胞表面，這些腫瘤細胞包括：肺癌，肝癌，卵巢癌，宮頸癌，皮 膚癌，膀胱癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，腎癌，胃癌，食道癌，口腔鱗狀細胞癌，頭頸癌。 而且在這些癌癥周邊也發(fā)現(xiàn)了大量表達ro-Ll的⑶8+T細胞。臨床統(tǒng)計顯示，PD-L1在腫 瘤細胞上的高表達水平與癌癥患者不良預(yù)后相關(guān)（Okazaki和Honjo 2007,同上）。
[0006] 多種慢性和急性病毒也通過ro-i和ro-Li信號逃避人體免疫監(jiān)測。例如：hiv感 染者體內(nèi)ro-Ι的表達水平與T細胞的耗竭程度密切相關(guān)，且可作為AIDS病情進展的標志 之一 (Trabattoni,Saresella et al. ,B7-H1 is up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease progression. Blood,2003,101 (7) :2514-2520)〇 此現(xiàn)象也同樣適用慢性乙肝患者（Evans, Riva et al.，Programmed deathlexpression during antiviral treatment of chronic hepatitis B ：Impact of hepatitis B e-antigen seroconversion·，Hepatology，2〇〇8,48 (3) :759-769)。動物實驗顯不，PD-1 基 因剔除小鼠比正常小鼠更好地控制病毒感染；而將HBV特異型T細胞轉(zhuǎn)移到HBV轉(zhuǎn)基因動 物中會引發(fā)肝炎。 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明涉及能夠結(jié)合程序性死亡因子1 (pd-1)的抗ro-i抗體及其功能性片段。
[0008] -方面，本發(fā)明的抗體或其功能性片段包含選自氨基酸序列SEQ ID N0 :1，2, 3, 7， 8,9,13,14,15或任何所述序列之變體的重鏈CDR，和/或選自氨基酸序列SEQ ID NO :4, 5， 6,10,11，12,16,17,18或任何所述序列之變體的輕鏈CDR。
[0009] 在一些優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或其功能性片段的重鏈⑶R1XDR2和⑶R3的 氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組:_

【權(quán)利要求】
1. 能夠結(jié)合程序性死亡因子l(PD-l)的抗體或其功能性片段，其包含選自氨基酸序列 SEQ ID NO : 1，2, 3, 7,8,9,13,14,15或任何所述序列之變體的重鏈⑶R，和/或選自氨基酸 序列SEQ ID NO :4, 5,6,10,11，12,16,17,18或任何所述序列之變體的輕鏈CDR。
2. 權(quán)利要求1所述的抗體或其功能性片段，其中所述重鏈⑶R的⑶R1XDR2和⑶R3的 氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組：
和/或所述輕鏈CDR的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其 變體的組中的一組：
3. 權(quán)利要求1或2所述的抗體或其功能性片段，其重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3以及輕鏈 ⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組：
4. 權(quán)利要求1至3中任一項所述的抗體或其功能性片段，其包含選自氨基酸序列SEQ IDN0:19,21，23或任何所述序列之變體的重鏈可變區(qū)，和/或選自氨基酸序列SEQIDN0 : 20, 22, 24或任何所述序列之變體的輕鏈可變區(qū)。
5. 權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體或其功能性片段，其中所述重鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :19或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :20或其變體，或者所述重鏈可變區(qū) 為SEQ ID NO :21或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :22或其變體，或者所述重鏈 可變區(qū)為SEQ ID NO :23或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :24或其變體。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項所述的抗體或其功能性片段，其為嵌合抗體、人源化抗體或 全人抗體。
7. 權(quán)利要求1至6中任一項所述的抗體或其功能性片段，其包含選自氨基酸序列SEQ IDN0:33,35,36或任何所述序列之變體的重鏈可變區(qū)，和/或選自氨基酸序列SEQIDN0: 34, 37或任何所述序列之變體的輕鏈可變區(qū)。
8. 權(quán)利要求1至7中任一項所述的抗體或其功能性片段，其中所述重鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :33或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :34或其變體，或者所述重鏈可變區(qū) 為SEQ ID N0:35或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQ ID N0:34或其變體，或者所述重鏈 可變區(qū)為SEQ ID NO :36或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :34或其變體，或者所 述重鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :35或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :37或其變體。
9. 分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1至8中任一項所述的抗體或功能性片段。
10. 表達載體，其包含權(quán)利要求9所述的核酸分子。
11. 宿主細胞，其包含權(quán)利要求10所述的表達載體。
12. 產(chǎn)生抗ro-ι抗體或其功能性片段的方法，其包括：在允許產(chǎn)生所述抗體或其功能 性片段的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求11所述的宿主細胞，以及回收這樣產(chǎn)生的所述抗體或 其功能性片段。
13. 免疫綴合物，其包含與治療劑偶聯(lián)的權(quán)利要求1至8中任一項所述的抗體或其功能 性片段，優(yōu)選地所述治療劑為毒素、放射性同位素、藥物或細胞毒劑。
14. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至8中任一項所述的抗體或其功能性片段，以及可 藥用載體。
15. 用于通過消除、抑制或降低ro-ι活性來預(yù)防或治療疾病或病癥的方法，其包括向 有此需要的對象施用治療有效量的權(quán)利要求1至8所述的抗體或其功能性片段，權(quán)利要求 9所述的核酸分子、權(quán)利要求10所述的表達載體、權(quán)利要求11所述的宿主細胞、權(quán)利要求 13所述的免疫綴合物或權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述疾病或病癥選自癌癥、 感染性疾病或炎性疾?。凰霭┌Y優(yōu)選選自黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳癌、結(jié)腸癌、肺癌、 骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、 胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金氏病、非何杰 金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織 肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病，其包括急性髓細胞樣白血病、慢性髓細胞樣白血 病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、兒童期實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、 膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的贅生物、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤 血管發(fā)生、脊髓軸腫瘤、腦干膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細 胞淋巴瘤、環(huán)境誘發(fā)的癌癥、其包括石棉所誘發(fā)的那些，和所述癌癥的組合；所述感染性疾 病優(yōu)選選自HIV、流行性感冒、皰疹、賈第蟲病、瘧疾、利什曼病、以下病毒引起的致病感染 ： 肝炎病毒（甲型、乙型和丙型）、皰疹病毒（例如^、批￥-1、祖￥-6、批￥-11和01^、埃巴二氏 病毒）、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病 毒、腿腺炎病毒、輪狀病毒、麻疫病毒、風疫病毒、細小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病 毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒， 以下細菌引起的致病感染：衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦 膜炎球菌和conococci、克雷伯氏菌、變形菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、 桿菌、霍亂、破傷風、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病和萊姆氏病細菌，以下真菌引起的 致病感染：假絲酵母（白色假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等）、 新型隱球酵母、曲霉（煙曲霉、黑曲霉等）、毛霉目的屬（毛霉屬、犁頭霉屬、根霉屬）、申克 氏孢子絲菌、皮炎芽酵母、巴西副球孢子菌、粗球孢菌和加膜組織胞漿菌，及以下寄生蟲引 起的致病感染：痢疾內(nèi)變形蟲、結(jié)腸腸袋蟲、福納氏蟲、棘變形蟲、吸吮賈第蟲、隱孢子蟲、卡 氏肺囊蟲、間日瘧原蟲、田鼠巴貝蟲、布魯斯錐蟲、克魯茲錐蟲、多氏利什曼蟲、鼠弓漿蟲和 巴西日圓線蟲；所述炎性疾病優(yōu)選選自急性播散性腦脊髓炎、阿狄森病、強直性脊柱炎、抗 磷脂抗體綜合征、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、關(guān)節(jié)炎、貝切特病、大皰性類天 皰瘡、腹部疾病、恰加斯病、克羅恩病、皮肌炎、1型糖尿病、肺出血-腎炎綜合征、移植物抗 宿主病、格雷夫斯病、格-巴二氏綜合征、橋本病、超IgE綜合征、特發(fā)性血小板減少性紫癜、 紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、天皰瘡、惡性貧血、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、銀 屑病、類風濕關(guān)節(jié)炎、斯耶格倫綜合征、顳動脈炎、血管炎和韋格納肉芽腫病。
【文檔編號】A61P33/00GK104250302SQ201310258289
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】陳博, 武海 申請人:上海君實生物醫(yī)藥科技有限公司, 蘇州君盟生物醫(yī)藥科技有限公司