白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應(yīng)用，并且研究發(fā)現(xiàn)，白鮮堿對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度為312.5μg/ml，使用體積分?jǐn)?shù)≦4%Tween-80作為增溶劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了白鮮堿抑制體外懸浮白色念珠菌的活性，且證實(shí)白鮮堿具有抗白色念珠菌生物膜潛能，是一味值得研究開(kāi)發(fā)的抗真菌藥物。
【專利說(shuō)明】白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的講，涉及白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 念珠菌是一種常見(jiàn)條件致病菌。白色念珠菌是致病力最強(qiáng)的念珠菌中之一，也是 引起人類念珠菌病的主要病原體?？谇皇前咨钪榫畛Ｒ?jiàn)的定殖部位。目前，白色念珠 菌所引起的口腔念珠菌感染已經(jīng)是關(guān)乎人類健康的一個(gè)重要問(wèn)題?？谇话咨钪榫腥境?見(jiàn)于免疫缺陷宿主，包括HIV陽(yáng)性以及艾滋病人，接受器官移植的病人，化療病人等。由于 廣譜抗生素的濫用，免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素在臨床上的廣泛應(yīng)用，惡性腫瘤發(fā)病率升高， 加之目前我國(guó)艾滋病疫情處于快速上升期，口腔白色念珠菌感染的病例急劇上升。與口腔 黏膜病有關(guān)的白色念珠菌感染主要包括口腔念珠菌病、口腔扁平苔鮮、白斑等。白色念珠菌 作為口腔黏膜多種感染的致病因子的作用已得到肯定。白色念珠菌感染會(huì)使口腔黏膜許多 原有疾病的病情加重，例如口腔黏膜癌前病變因有白念的反復(fù)感染而增加了癌變幾率，其 中國(guó)際公認(rèn)的口腔癌前病變白斑，伴有念珠菌感染者，其癌變傾向較大。最新的研究顯示， 白色念珠菌在4-NQ0誘導(dǎo)的大鼠口腔腫瘤模型中對(duì)黏膜增生起到了關(guān)鍵的促進(jìn)作用。由于 口腔白色念珠菌常以生物膜形態(tài)存在，使得白色念珠菌的致病性和耐藥性明顯增加。因此， 如何有效控制口腔白色念珠菌感染成為臨床上頗為棘手而又亟需解決的重要問(wèn)題。
[0003] 目前臨床常用的抗真菌藥物有多烯類（如兩性霉素 B)，唑類（如氟康唑、伊曲康 唑）以及嘧啶類（如5-FC)等。它們主要是通過(guò)影響真菌細(xì)胞膜麥角固醇的合成，以及損 害細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致真菌死亡。目前，通過(guò)抗真菌藥物的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)， 選擇合適的抗真菌藥物越來(lái)越受到重視。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法很多，如微量稀釋法、紙片擴(kuò) 散法、E-TEST法等。1982年，美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS)成立了真菌藥敏試 驗(yàn)分會(huì)，以期建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化藥敏實(shí)驗(yàn)方案。目前國(guó)內(nèi)外多采用NCCLS的M27方案為酵母 菌的標(biāo)準(zhǔn)化藥敏實(shí)驗(yàn)方法。由于有效的抗真菌藥物品種很有限，而目前臨床應(yīng)用的抗真菌 藥物從高效低毒、抗菌譜和耐藥性方面評(píng)價(jià)尚不能令人滿意。具有兩千多年用藥歷史和完 整理論體系的中醫(yī)藥，為新藥的發(fā)現(xiàn)提供了一條有效捷徑。因此，從祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶藏中挖 掘具有抗真菌潛力，并且毒副作用低的新藥是一個(gè)非常重要的研究方向。
[0004] 來(lái)源于古方的五白湯已在臨床上用于口腔白色念珠菌感染病例，前期研究應(yīng)用五 白湯治療口腔黏膜糜爛病例取得滿意效果，尤其是對(duì)伴白色念珠菌感染病例，其療效與氟 康唑相似，且無(wú)明顯毒副作用。但是尚不明確五白湯抗白色念珠菌究竟是復(fù)方中的哪些藥 物起主導(dǎo)作用，是否可用中藥簡(jiǎn)單成分替代原藥,形成成分處方，以提高藥效和向中藥制劑 的標(biāo)準(zhǔn)化推進(jìn)？
[0005] 白鮮皮為云香科植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz)和狹葉白鮮 (Dictamnus angustifolius G.Don)的干燥根皮，具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒的功效，主治皮 膚瘙癢，風(fēng)疹，濕疹，疥癬，黃疸，風(fēng)濕痹痛，筋骨痿弱，小兒驚厥。白鮮皮主要化學(xué)成分為生 物堿，而白鮮堿為其重要活性成分，同時(shí)也為其較特征性成分。中醫(yī)藥指紋圖譜研究表明， 不同產(chǎn)地的白鮮皮藥材中均含有白鮮堿，而且是其含量較高的主要成分。本發(fā)明選擇白鮮 皮的有效成分白鮮堿，研究其抗白色念珠菌活性。
[0006] 白鮮堿（dictamnine)，又稱白鮮胺，分子式為C15H1()0 5，分子量為270. 24,屬呋喃喹 啉類生物堿，無(wú)色棒狀結(jié)晶，熔點(diǎn)：129--131°C。既往有文獻(xiàn)(李福鳳，李果剛，吳友忠， 等·小兒哮喘花剝苔產(chǎn)生的免疫機(jī)制研究[JL中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2005, 3(6) :446-449)報(bào) 道，白鮮堿可有效抑制有些植物致病真菌孢子的萌發(fā)。葉笑味等(地圖舌兒童血清鋅銅測(cè) 定的意義[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006, 18(8) :54-54)報(bào)道了白鮮皮多種二甲氯提取物中，白 鮮堿是最有效的抑制植物致病真菌--黃瓜黑星病菌的化合物。李伏虎等(微量元素鋅等 與幼兒地圖舌的關(guān)系[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2006)最新的研究顯示，從中藥兩面針根部提取 的白鮮堿對(duì)稻瘟病菌這一植物致病真菌有明確的抑制作用。Muzyka BC等（Prevalence of HIV-land oral lesions in pregnant women in rural Malawi[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2001Jul, 92(1) :56-61)的研究發(fā)現(xiàn)了白鮮堿對(duì)模式真 菌啤酒酵母的抗菌活性。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于白鮮堿對(duì)白色念珠菌抑制作用的報(bào)道。關(guān)于 白鮮堿抗真菌作用的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外亦有研究。已有研究應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察方 法，并作細(xì)胞掃描圖像分析，定量描述細(xì)胞形狀、面積和DNA，RNA含量，認(rèn)為白鮮堿直接或 間接影響了真菌細(xì)胞遺傳物質(zhì)的正常合成，以致不能完成正常細(xì)胞周期，從而抑制真菌生 長(zhǎng)甚至導(dǎo)致死亡。Pfyffer 等（Pfyffer GE，Towers GH. Photochemical interaction of dictamnine,a furoquinoline alkaloid, with fungal DNA[J]. Can J Microbiol,1982, 28 (5) :468-73)報(bào)道了白鮮堿對(duì)真菌DNA的作用，在近紫外光下引起絲狀真菌的致死性損 傷，結(jié)果支持了以前其基于小牛胸腺DNA的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為DNA是生物堿的體內(nèi)光毒性 的主要作用靶點(diǎn)。而白鮮堿對(duì)白色念珠菌抑制作用的機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究加以探索。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應(yīng)用。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中 的應(yīng)用。
[0009] 作為一個(gè)優(yōu)選方案，白鮮堿對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度為312. 5 μ g/ml。
[0010] 作為又一個(gè)優(yōu)選方案，使用體積分?jǐn)?shù)蘭4%Tween-80作為増溶劑。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了白鮮堿抑制體外懸浮白色念珠菌的活性， 且證實(shí)白鮮堿具有抗白色念珠菌生物膜潛能，是一味值得研究開(kāi)發(fā)的抗真菌藥物。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為Tween-80溶液對(duì)白色念珠菌菌懸液吸光度的影響。
[0013] 圖2為Tween-80與DMS0的混合溶液對(duì)白色念珠菌菌懸液吸光度的影響。
[0014] 圖3為白鮮堿以及氟康唑?qū)Π咨钪榫锬さ挠绊憽?br> [0015] 圖4為白鮮堿對(duì)白色念珠菌生物膜吸光度的影響。 t〇〇16] 圖5為氟康唑?qū)Π咨钪榫锬の舛鹊挠绊憽?br>
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú) 特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途 徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 實(shí)施例1. Tween-80對(duì)白色念珠菌體外生長(zhǎng)的影響
[0019] 1材料與方法
[0020] 1. 1 材料
[0021] 1. 1. 1藥物及試劑
[0022] Tween-80購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20080324。
[0023] DMS0購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，Sigma分裝，批號(hào)86C00150。
[0024] 氟康唑購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100314-200503。
[0025] 1. 1. 2試驗(yàn)菌株
[0026]國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC76615,由上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所口腔微生物實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)酵 母菌生化卡（Vitek,批號(hào)E23K)鑒定為白色念珠菌（Bionumber555017411)，見(jiàn)附錄1。
[0027] 1. 1. 3 培養(yǎng)基
[0028] ①沙保勞氏瓊脂(上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司，批號(hào)20080303) 63g，加氯霉素 50mg，蒸饋水1000ml，高壓滅菌。
[0029] ②RPMI1640液體培養(yǎng)基：RPMI1640粉劑（GIBC0,批號(hào)1381654)(含谷氨酰胺， 不含碳酸氫鈉）10. 4g，三氮嗎啡啉丙磺酸34. 53g (SIGMA，批號(hào)018K0724)，蒸餾水900ml， 以lmol/1的NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0,加蒸餾水定容至1000ml，用Millipore濾過(guò)滅菌（濾膜 0. 22μπι)，置4°C冰箱備用。
[0030] 1. 1. 4主要儀器
[0031] 超凈工作臺(tái)（蘇州YJ_875DA)、麥?zhǔn)媳葷峁埽╞iomerieux806814701)、紫外分光光 度儀（日本島津UV-1601)。
[0032] 1. 2 方法
[0033] 參照NCCLS MW _ A2[8]推薦的肉湯常量稀釋法酵母菌藥敏性試驗(yàn)進(jìn)行。
[0034] 1. 2. 1藥物及標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0035] Tween-8〇經(jīng)RPMI1Μ0液體培養(yǎng)基稀釋后，配制成體積分?jǐn)?shù)為8%的貯存液。 Tween-80與DMS0按體積4 :1的比例混合，經(jīng)RPMI1M0液體培養(yǎng)基稀釋后，配制成Tween-80 體積分?jǐn)?shù)為8%，DMS0體積分?jǐn)?shù)為2%的混合溶液貯存液。上述兩種貯存液分別用Millipore 濾過(guò)滅菌（濾膜〇· 22 μ m)，分裝后置-80°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?br> [0036] 氟康唑用無(wú)菌蒸餾水配制成1280 μ g/ml的貯存液，用Millipore濾過(guò)滅菌(濾膜 0. 22 μ m)，分裝后置-80°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?br> [0037] 1. 2. 2菌懸液制備
[0038] 將白色念珠菌(ATCC76615)接種在沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基上，置35°C，傳代培養(yǎng)。挑取 生長(zhǎng)24小時(shí)的菌落，用0. 85%的無(wú)菌氯化鈉水溶液制成菌懸液，經(jīng)麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整其濁度 達(dá)到〇· 5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，相當(dāng)于每毫升含1?5 X 106菌落形成單位（CFU/ml)，用RPMI1640液體 培養(yǎng)基1 :5〇稀釋后再1 :20稀釋（共稀釋1000倍）至菌含量為1?5X103，CFU/ml (2倍 于終濃度)。
[0039] 1. 2· 3藥物稀釋及接種物接種
[0040] 取無(wú)菌試管（100mm)12支。排成一排，第2至12管內(nèi)分別加入lmlRPMI1640液體 培養(yǎng)基。在第1管加入受試藥物原液2ml，然后從第一管內(nèi)吸取lml至第2管。混勻后再吸 取lml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第10管。并從第1〇管中吸取lml棄去。第η管為 不含受試藥物的生長(zhǎng)對(duì)照，第12管為陰性對(duì)照。此時(shí)各管受試藥物濃度依次為1倍、1/2倍、 1/4倍、1/8倍、1/16倍、1/32倍、1/64倍、1/128倍、1/256倍、1/512倍的受試藥物原濃度。 然后在每管內(nèi)加入制備好的菌懸液接種物各lml。使每管最終菌液濃度約為〇. 5X 103? 2. 5X103CFU/ml。第1管至第10管受試藥物達(dá)到終濃度，此時(shí)各管受試藥物濃度依次為 1/2 倍、1/4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍、1/128 倍、1/256 倍、1/512、1/1024 倍受試 藥物原濃度。Tween-8〇溶液的體積分?jǐn)?shù)為4%?0· 0〇78丨25%。Tween-80與DMS0的混合溶 液中Tween-80的體積分?jǐn)?shù)為4%?〇. 0078125%，DMS0的體積分?jǐn)?shù)為1%?〇. 001953125%， Tween_8〇與DMS0保持4 :1的比例不變。
[0041] 1.2. 4培養(yǎng)及結(jié)果判定
[0042]將上述試驗(yàn)管置35°C培養(yǎng)48小時(shí)，觀察白色念珠菌生長(zhǎng)情況，讀取結(jié)果。結(jié)果判 斷的前提是生長(zhǎng)對(duì)照良好，空白對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)清晰。判讀標(biāo)準(zhǔn)如下：與生長(zhǎng)對(duì)照管比較，對(duì) 試管內(nèi)菌株生長(zhǎng)情況進(jìn)行評(píng)分，0分為肉眼觀察清晰；1分為輕度模糊；2分為濁度顯著降低 (約抑制 5〇%受試菌生長(zhǎng));3分為濁度輕度降低；4分為濁度不減低。并在紫外分光光度儀， 波長(zhǎng) 55〇nm條件下測(cè)管內(nèi)液體的吸光度。每種受試藥物均重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，吸光度取平均值。 本實(shí)驗(yàn)以氟康唑作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，參照NCCLS M27-A2[8]推薦的肉湯微量稀釋法酵母菌藥 敏性試驗(yàn)進(jìn)行，其MIC值位于M2 7-A2規(guī)定的范圍，則認(rèn)為該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。
[0043] 2 結(jié)果
[0044] 35°C培養(yǎng)48小時(shí)后，肉眼觀察各試管白色念珠菌（ATCC76615)生長(zhǎng)情況。生長(zhǎng)對(duì) 照管均生長(zhǎng)良好，空白對(duì)照管無(wú)菌落生長(zhǎng)清晰且陽(yáng)性對(duì)照藥物氟康唑MIC值位于M27-A2規(guī) 定的范圍。分別加入Tween-80溶液及Tween-80與DMS0的混合溶液的試管與生長(zhǎng)對(duì)照管 比較，其濁度不減低，均判定為4分。
[0045] 35 °C培養(yǎng)48小時(shí)后，紫外分光光度儀550nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定每一試管內(nèi)液體吸光 度的均值見(jiàn)表1，吸光度的均值均為去除RPMI-1640液體培養(yǎng)基對(duì)吸光度影響后的數(shù)值。
[0046] 表lTween-80溶液及Tween-8〇與DMS0混合溶液處理后各試管內(nèi)液體吸光度均值
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，白 鮮堿對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度為312. 5 μ g/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白鮮堿在制備抗白色念珠菌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，使 用體積分?jǐn)?shù)=4%TWeen-80作為增溶劑。
【文檔編號(hào)】A61P1/02GK104248637SQ201310261421
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】周曾同, 施琳俊 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院