靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，包括納米膠束、納米脂質(zhì)體、納米粒等，其以暴露于載體表面的蜂毒明肽或肽鏈C端未酰胺化的蜂毒明肽衍生物為靶向配基，可攜帶小分子化學(xué)藥物跨越血腦屏障和血脊髓屏障，實(shí)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向給藥。
【專利說明】靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種具有靶向性的納米藥物載體。

【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重威脅人類健康，盡管基于化療為主的常規(guī)治療手段在過去幾十年間取得了階段性的成果，但仍然存在療效有限、毒副作用較嚴(yán)重等問題。為此，多年來，針對神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)理、相關(guān)靶點(diǎn)以及特異性治療藥物的研究一刻也未停止。由于血腦屏障和血脊髓屏障是阻礙藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要障礙，因此，研究和開發(fā)可以攜帶藥物穿透血腦屏障和血脊髓屏障的靶向遞藥系統(tǒng)具有重大意義。
[0003]蜂毒明肽(Apamin)是蜂毒中一種主要的多肽，占蜂毒干量的3%，系高度堿性的十八肽酰胺，含有兩個鏈內(nèi)二硫鍵，可透過血腦屏障，阻斷鈣離子激活的鉀離子通道，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)。1975年，Jean-Pierre Vincent等人首次通過實(shí)驗(yàn)證明蜂毒明肽的作用位點(diǎn)主要位于腰椎脊椎背側(cè)，在神經(jīng)中樞系統(tǒng)其他部位也有一定分布，而在其他組織器官只有痕量分布。
[0004]納米藥物載體是指粒徑大小在10?100nm的一類新型載體,通常由天然或合成高分子材料制成。它是以納米顆粒作為藥物載體，將藥物分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，通過靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的祀向藥物輸送。依照制備工藝和材料的不同，納米藥物載體可分為納米粒、納米膠束、納米脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒、納米乳、納米混懸液等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，可以攜帶藥物穿透血腦屏障和血脊髓屏障，實(shí)現(xiàn)靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞藥。
[0006]經(jīng)過研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0007]1.靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，以蜂毒明肽(氨基酸序列為cnckapetalca-rrcqqh-nh2，肽鏈C端酰胺化)或其衍生物為靶向配基，所述蜂毒明肽衍生物為肽鏈C端未酰胺化的蜂毒明肽(氨基酸序列為CNCKAPETALCARRCQQH-OH)，蜂毒明肽或其衍生物暴露于納米藥物載體的表面。
[0008]優(yōu)選的,所述納米藥物載體為納米膠束、納米脂質(zhì)體或納米粒，由祀向材料和組裝材料組成，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物與兩親性聚合物偶聯(lián)而得，所述組裝材料包括兩親性聚合物。
[0009]作為一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述納米藥物載體為納米膠束或納米脂質(zhì)體，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物與聚乙二醇修飾磷脂偶聯(lián)而得，所述組裝材料包括單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂。
[0010]優(yōu)選的，納米膠束的組裝材料為單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂；納米脂質(zhì)體的組裝材料由磷脂(如氫化大豆磷脂等)、膽固醇和單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂組成。
[0011]聚乙二醇修飾磷脂中所述聚乙二醇的重均分子量優(yōu)選在2000?1000Da范圍內(nèi)；所述磷脂的兩條脂肪酸鏈可以相同或不同，每條脂肪酸鏈所含碳原子數(shù)優(yōu)選在12?20范圍內(nèi)。優(yōu)選的，所述聚乙二醇修飾磷脂為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰膽堿(PEG-DSPC)和聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(PEG-DPPC)中的任一種或多種混合物。
[0012]單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂中所述單甲氧基聚乙二醇的重均分子量優(yōu)選在2000?1000Da范圍內(nèi)；所述磷脂的兩條脂肪酸鏈可以相同或不同，每條脂肪酸鏈所含碳原子數(shù)優(yōu)選在12?20范圍內(nèi)。優(yōu)選的，所述單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂為單甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、單甲氧基聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DPPE)、單甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰膽堿(mPEG_DSPC)和單甲氧基聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(mPEG-DPPC)中的任一種或多種混合物。
[0013]蜂毒明肽或其衍生物與聚乙二醇修飾磷脂的偶聯(lián)發(fā)生在蜂毒明肽或其衍生物與聚乙二醇之間，文獻(xiàn)報(bào)道的多肽的聚乙二醇化修飾方法均適用于本發(fā)明。聚乙二醇分子的末端醇羥基不活潑，為了實(shí)現(xiàn)多肽與聚乙二醇的有效穩(wěn)定連接，需要先對聚乙二醇分子進(jìn)行活化，即采用不同的化學(xué)反應(yīng)使聚乙二醇分子的末端羥基連接上不同的活化官能團(tuán)。聚乙二醇分子活化的常用方法是在末端羥基上引入氨基、羧基、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基等?；罨木垡叶挤肿涌膳c多肽分子主鏈或側(cè)鏈上的各種化學(xué)官能團(tuán)反應(yīng)而與多肽相連接。其中，親核性官能團(tuán)為主要反應(yīng)位點(diǎn)，包括巰基、氨基、羧基等。
[0014]蜂毒明肽分子中含有2個游離氨基，分別為肽鏈N端的α-氨基和4位賴氨酸殘基中的ε-氨基。因此，優(yōu)選的，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物通過肽鏈N端的α-氨基和/或4位賴氨酸殘基中的ε-氨基與琥珀酰亞胺基功能化的聚乙二醇修飾磷脂偶聯(lián)而得。具體的，所述靶向材料可由氨基未保護(hù)的蜂毒明肽或其衍生物與琥珀酰亞胺-聚乙二醇-磷脂反應(yīng)制得；或者，由肽鏈N端α-氨基被保護(hù)或4位賴氨酸殘基中ε-氨基被保護(hù)的蜂毒明肽或其衍生物與琥珀酰亞胺-聚乙二醇-磷脂反應(yīng)，再脫去氨基保護(hù)基制得。
[0015]更優(yōu)選的，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物通過N端的α -氨基和/或4位賴氨酸殘基中的ε -氨基與琥珀酰亞胺-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(NHS-PEG-DSPE)反應(yīng)制得，其中PEG的重均分子量為3400 ;所述組裝材料包括mPEG-DSPE，其中mPEG的重均分子量為2000。采用PEG分子量大于mPEG分子量的方式，可以確保作為靶向配基的蜂毒明肽或其衍生物暴露于納米藥物載體的表面，便于其發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向作用。
[0016]所述靶向材料與組裝材料的摩爾比優(yōu)選為不小于0.1:99.9，更優(yōu)選為0.1:99.9 ?10:90。
[0017]所述納米膠束和納米脂質(zhì)體的平均粒徑優(yōu)選為不大于200nm，更優(yōu)選為50?200nmo
[0018]作為另一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述納米藥物載體為納米粒，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物與聚乙二醇-聚丙交酯(PEG-PLA)偶聯(lián)而得，所述組裝材料為單甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯(mPEG-PLA)。
[0019]蜂毒明肽或其衍生物與聚乙二醇-聚丙交酯的偶聯(lián)發(fā)生在蜂毒明肽或其衍生物與聚乙二醇之間，文獻(xiàn)報(bào)道的多肽的聚乙二醇化修飾方法均適用于本發(fā)明。如前所述，聚乙二醇分子的末端醇羥基不活潑，為了實(shí)現(xiàn)多肽與聚乙二醇的有效穩(wěn)定連接，需要先對聚乙二醇分子進(jìn)行活化，即采用不同的化學(xué)反應(yīng)使聚乙二醇分子的末端羥基連接上不同的活化官能團(tuán)。聚乙二醇分子活化的常用方法是在末端羥基上引入氨基、羧基、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基等。活化的聚乙二醇分子可與多肽分子主鏈或側(cè)鏈上的各種化學(xué)官能團(tuán)反應(yīng)而與多肽相連接。其中，親核性官能團(tuán)為主要反應(yīng)位點(diǎn)，包括巰基、氨基、羧基等。
[0020]優(yōu)選的，所述靶向材料由N端添加I個半胱氨酸的蜂毒明肽(氨基酸序列為sh-c-cnckapetalcarrcqqh-nh2)或其衍生物(氨基酸序列為SH-C-CNCKAPETALCARR-CQQH-OH )通過肽鏈N端的巰基與馬來酰亞胺基功能化的聚乙二醇修飾磷脂偶聯(lián)而得。具體的，所述靶向材料可由N端添加I個半胱氨酸、肽鏈中4個半胱氨酸殘基的巰基均被保護(hù)的蜂毒明肽或其衍生物與馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚丙交酯(Mal-PEG-PLA)反應(yīng)，再脫去全部巰基保護(hù)基制得。
[0021]所述靶向材料與組裝材料的摩爾比優(yōu)選為不小于0.1:99.9，更優(yōu)選為0.1:99.9 ?10:90。
[0022]所述納米粒的平均粒徑優(yōu)選為不大于200nm,更優(yōu)選為50?200nm。
[0023]本發(fā)明的納米藥物載體可用于攜帶小分子化學(xué)藥物。包括但不限于:姜黃素、紫杉醇、阿霉素和人參皂苷等促進(jìn)中樞神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)及再生的藥物，銀杏內(nèi)酯等治療神經(jīng)退行性疾病的藥物，以及 DiR(l, l，-d1ctadecyl_3, 3, 3’，3J-tetramethyIindotricarbocyanine 1dide)、異硫氰酸熒光素(FITC)等可作為體內(nèi)示蹤劑的熒光染料。
[0024]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體包括納米膠束、納米脂質(zhì)體、納米粒等，其以暴露于載體表面的蜂毒明肽或肽鏈C端未酰胺化的蜂毒明肽衍生物為靶向配基，可攜帶小分子化學(xué)藥物跨越血腦屏障和血脊髓屏障，實(shí)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向給藥。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明:
[0026]圖1為以不同修飾位點(diǎn)的蜂毒明肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺為靶向材料的載藥納米膠束在小鼠體內(nèi)的分布情況，A為給藥后2h活體熒光成像結(jié)果，B為給藥后12h活體熒光成像結(jié)果，C為腦相對肝臟中熒光強(qiáng)度-時(shí)間分布曲線，D為脊髓相對肝臟中熒光強(qiáng)度-時(shí)間分布曲線；a、b、c 分別為 Apamin-PEG-DSPE-DiR 組、Apaminl-PEG-DSPE-DiR組、Apamin4-PEG-DSPE-DiR 組。
[0027]圖2為不同粒徑大小的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR在小鼠體內(nèi)的分布情況，A、B分別為給藥后4h、12h活體熒光成像結(jié)果，C、D分別為給藥后4h、12h各器官的熒光半定量結(jié)果。
[0028]圖3為不同靶向材料比例的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR在小鼠體內(nèi)的分布情況，A為給藥后4h活體熒光成像結(jié)果，B為腦相對肝臟中熒光強(qiáng)度-時(shí)間分布曲線，C為脊髓相對肝臟中熒光強(qiáng)度-時(shí)間分布曲線；a、b、C、d、e分別為受體飽和對照組、無靶頭對照組、靶向材料比例0.1%組、1%組、10%組。
[0029]圖4為不同給藥方式的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR在小鼠體內(nèi)的分布情況，A為給藥后8h活體熒光成像結(jié)果，B為腦相對肝臟中熒光強(qiáng)度-時(shí)間分布曲線，C為脊髓相對肝臟中熒光強(qiáng)度-時(shí)間分布曲線；a、b、c、d、e分別為靜脈注射組、肌肉注射組、灌胃組、腹腔注射組、皮下注射組。

【具體實(shí)施方式】
[0030]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0031]實(shí)施例1、不同修飾位點(diǎn)的蜂毒明肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的制備
[0032]取Apamin (CNCKAPETALCARRCQQH-NH2 ) 0.2 μ mo I，與琥珀酰亞胺-聚乙二醇3400- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(NHS-PEG3400-DSPE)按照摩爾比為1: 1.2溶于新蒸二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫孵化48h，所得反應(yīng)混合液置分子量為3500Da的透析袋中，以去離子水為介質(zhì)透析48h，凍干，制得Apamin-PEG3400-DSPE。
[0033]取肽鏈N端α -氨基被Fmoc (荷甲氧羰基)保護(hù)的Apamin(Fmoc-CNCKAPETALCA-RRCQQH-NH2) 0.2 μ mo I,用 DMF 溶解，再與 NHS-PEG3400-DSPE 按照摩爾比為1: 1.2溶于新蒸DMF中，室溫孵化48h，反應(yīng)混合液置分子量為3500Da的透析袋中，以去離子水為介質(zhì)透析48h,凍干，制得Fmoc-Apaminl-PEG3400-DSPE。將Fmoc-Apaminl-PEG3400-DSPE 用 20%(v/v)哌啶的 DMF 溶液溶解，室溫?cái)嚢?0.5h 脫去 Fmoc保護(hù)基，所得反應(yīng)液置分子量為3500Da的透析袋中，以去離子水為介質(zhì)透析48h，凍干，制得 Apaminl-PEG3400-DSPE。
[0034]取肽鏈4位賴氨酸ε -氨基被Dde (1_ (4，4_ 二甲基_2，6_ 二氧代環(huán)己亞基)乙基)保護(hù)的 Apamin (CNCK(Dde)APETALCARRCQQH-NH2) 0.2ymol，用 DMF 溶解，與NHS-PEG3400-DSPE按照摩爾比為1: 1.2溶于新蒸DMF中，室溫孵化48h，反應(yīng)混合液置分子量為3500Da的透析袋中，以去離子水為介質(zhì)透析48h，凍干，制得Dde-Apamin4-PEG3400-DSPE。將 Dde-Apamin4-PEG3400_DSPE 用 10%(v/v)水合肼的二氯甲烷溶液溶解，室溫?cái)嚢?.5h脫去Dde保護(hù)基，所得反應(yīng)液置分子量為3500Da的透析袋中，以去離子水為介質(zhì)透析48h，凍干，制得Apamin4-PEG3400-DSPE。
[0035]實(shí)施例2、以不同修飾位點(diǎn)的蜂毒明肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺為靶向材料的載藥納米膠束的制備及體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0036]1、載藥納米膠束的制備
[0037]以近紅外熒光染料DiR為模型藥物。將Apamin-PEG3400_DSPE、Apaminl-PEG3400-DSPE、Apamin4-PEG3400-DSPE 分別與 mPEG2000_DSPE 按照摩爾比為10:90混合，用氯仿0.5mL溶解，再加入DiR的甲醇溶液，混合均勻，37 °C減壓蒸發(fā)成薄膜，真空干燥1.5h，再加入PBS (pH7.4)0.2mL，渦旋10min，37°C振蕩1.5h，用孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾，濾液再經(jīng)微型勻質(zhì)機(jī)乳勻，分別制得平均粒徑為50nm的載藥納米膠束 Apamin-PEG-DSPE-DiR、Apaminl-PEG-DSPE-DiR,Apamin4-PEG-DSPE_DiR。
[0038]2、體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0039]將SPD級昆明種小鼠隨機(jī)分為3組，分別尾靜脈注射載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR、Apaminl-PEG-DSPE-DiR, Apamin4-PEG-DSPE_DiR，在給藥后 0.5、1、2、4、8、12、24h分別取I只小鼠，異氟燒氣體麻醉，用活體成像儀(in-vivolmaging System,FX Pro，Burker，USA)檢測樣品在小鼠體內(nèi)的分布；然后尾靜脈注射空氣致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦和脊髓，用活體成像儀檢測不同臟器的納米膠束分布量。
[0040]結(jié)果如圖1 所示，載藥納米膠束 Apamin-PEG-DSPE-DiR、Apaminl-PEG-DSPE-DiR和Apamin4-PEG-DSPE-DiR均可以穿過血腦屏障和血脊髓屏障到達(dá)腦和脊髓，其中Apaminl-PEG-DSPE-DiR在體內(nèi)可迅速分布到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而Apamin4-PEG-DSPE_DiR在給藥4h后中樞神經(jīng)系統(tǒng)有大量分布且持續(xù)時(shí)間長，表現(xiàn)出一定的緩釋作用。
[0041]實(shí)施例3、不同粒徑大小的載藥納米膠束的制備及體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0042]1、載藥納米膠束的制備
[0043]將Apamin-PEG3400-DSPE 與 mPEG2000_DSPE 按照摩爾比為 10:90 混合，用氯仿0.5mL溶解，再加入DiR的甲醇溶液，混合均勻，37 °C減壓蒸發(fā)成膜，真空干燥1.5h，再加入PBS (pH7.4) 0.2mL,渦旋10min，37°C振蕩1.5h，用孔徑0.45 μ m的濾膜過濾，濾液經(jīng)微型勻質(zhì)機(jī)乳勻，制得平均粒徑分別為50、100、200、400nm的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR。
[0044]2、體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0045]將SPD級昆明種小鼠隨機(jī)分為4組，分別尾靜脈注射平均粒徑為50、100、200、400nm的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DIR，在給藥后4、12h分別取I只小鼠，異氟烷氣體麻醉，用活體成像儀檢測樣品在小鼠體內(nèi)的分布；然后尾靜脈注射空氣致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦和脊髓，用活體成像儀檢測不同臟器的納米膠束分布量。
[0046]結(jié)果如圖2所示，當(dāng)平均粒徑不大于200nm時(shí)，載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR表現(xiàn)出較好的腦和脊髓靶向性。
[0047]實(shí)施例4、不同靶向材料比例的載藥納米膠束的制備及體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0048]1、載藥納米膠束的制備
[0049]將Apamin-PEG3400-DSPE 與 mPEG2000_DSPE 分別按照摩爾比為 0.1:99.9、1:99、10:90混合，用氯仿0.5mL溶解，再加入DiR的甲醇溶液，混合均勻，37°C減壓蒸發(fā)成薄膜，真空干燥1.5h，再加入PBS (ρΗ7.4) 0.2mL，渦旋10min，37°C振蕩1.5h，用孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾，濾液經(jīng)微型勻質(zhì)機(jī)乳勻，控制膠束平均粒徑為50nm，制得靶向材料比例分別為0.1%、1%、10% 的載藥納米膠束 Apamin-PEG-DSPE-DiR。
[0050]同時(shí)，以NHS-PEG3400-DSPE替代Apamin-PEG3400_DSPE，按照上述相同方法，制得無靶頭對照。
[0051]2、體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0052]將sro級昆明種小鼠隨機(jī)分為5組，分別尾靜脈注射無靶頭對照，靶向材料比例為0.1%、1%、10%的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR，剩余I組(受體飽和對照組)提前2h尾靜脈注射蜂毒明肽使小鼠體內(nèi)的蜂毒明肽受體飽和，再尾靜脈注射靶向材料比例為10%的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR。各組在給藥后0.5、1、2、4、8、12、24h分別取I只小鼠，異氟烷氣體麻醉，用活體成像儀檢測樣品在小鼠體內(nèi)的分布；然后尾靜脈注射空氣致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦和脊髓，用活體成像儀檢測不同臟器的納米膠束分布量。
[0053]結(jié)果如圖3所示，當(dāng)祀向材料比例不小于1%時(shí)，載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR表現(xiàn)出較好的腦和脊髓靶向性。
[0054]實(shí)施例5、不同給藥方式的載藥納米膠束的體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0055]將sro級昆明種小鼠隨機(jī)分為5組，分別以尾靜脈注射、肌肉注射、灌胃、腹腔注射、背部皮下注射5種方式給予實(shí)施例2制得的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR，在給藥后0.5、l、2、4、8、12、24h分別取I只小鼠，異氟烷氣體麻醉，用活體成像儀檢測樣品在小鼠體內(nèi)的分布；然后尾靜脈注射空氣致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦和脊髓，用活體成像儀檢測不同臟器的納米膠束分布量。
[0056]結(jié)果如圖4所示，不同給藥方式的載藥納米膠束Apamin-PEG-DSPE-DiR在小鼠體內(nèi)的分布有明顯差異，以尾靜脈注射、背部皮下注射、灌胃方式給藥的載藥納米膠束在小鼠腦和脊髓中有較大量分布，尤以尾靜脈注射的效果最佳，且該載藥納米膠束對脊髓的靶向性較腦部更強(qiáng)；而以肌肉注射和腹腔注射方式給藥的載藥納米膠束主要潴留在注射部位。
[0057]實(shí)施例6、以Apamin-PEG3400-DSPE為靶向材料的載藥納米脂質(zhì)體的制備及其體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0058]1、載藥納米脂質(zhì)體的制備
[0059]以近紅外熒光染料DiR為模型藥物。將氫化大豆磷脂、膽固醇、mPEG2000_DSPE、Apamin-PEG3400-DSPE按照摩爾比為52:45:2:1溶于氯仿，再加入DiR的甲醇溶液，混合均勻，減壓蒸餾除去氯仿，得均勻脂質(zhì)膜，真空干燥24h，再加入0.155mol/L硫酸銨溶液適量，60°C水浴震蕩2h，得脂質(zhì)體混懸液，再在60°C水浴中經(jīng)微型勻質(zhì)機(jī)乳勻，制得平均粒徑為50nm的載藥納米脂質(zhì)體Apamin-PEG-DSPE-DiR。
[0060]同時(shí)，以NHS-PEG3400-DSPE替代Apamin-PEG3400_DSPE，按照上述相同方法，制得無靶頭對照。
[0061]2、體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0062]將SPD級昆明種小鼠隨機(jī)分為2組，分別尾靜脈注射無靶頭對照和載藥納米脂質(zhì)體Apamin-PEG-DSPE-DiR，兩組在給藥后0.5、1、2、4、8、12、24h分別取I只小鼠，異氟烷氣體麻醉，用活體成像儀檢測樣品在小鼠體內(nèi)的分布；然后尾靜脈注射空氣致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦和脊髓，用活體成像儀檢測不同臟器的納米脂質(zhì)體分布量。
[0063]結(jié)果顯示,載藥納米脂質(zhì)體Apamin-PEG-DSPE-DiR可以穿過血腦屏障和血脊髓屏障到達(dá)腦和脊髓，而無靶頭對照不能穿過血腦屏障和血脊髓屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
[0064]實(shí)施例7、蜂毒明肽-聚乙二醇-聚丙交酯(Apamin-PEG-PLA)的制備
[0065]取肽鏈N端添加I個半胱氨酸、肽鏈中4個半胱氨酸殘基的巰基全部被Acm (乙酰氨基甲基)保護(hù)的 Apamin (SH-C-C (Acm) NC (Acm) KAPETALC (Acm) ARRC (Acm) QQH-NH2)0.2 μ mol,與馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚丙交酯(Mal-PEG-PLA、Mw6000Da)按照摩爾比為1: 1.5溶于新蒸DMF中，調(diào)節(jié)pH8.0,室溫孵化48h，所得反應(yīng)混合液置分子量為3500Da的透析袋中，以去離子水為介質(zhì)透析48h,凍干，制得Apamin(4Acm)-PEG-PLA。將Apamin (4Acm) -PEG-PLA溶于甲醇，加入適量檸檬酸溶液和lmol/L鹽酸溶液，再逐滴加入碘甲醇溶液使混合液保持微黃色持續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入適量抗壞血酸溶液使混合液褪去微黃色，再將反應(yīng)液透析除去鹽類，冷凍干燥，制得Apamin-PEG-PLA。
[0066]實(shí)施例8、以Apamin-PEG-PLA為祀向材料的載藥納米粒的制備及其體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0067]1、載藥納米粒的制備
[0068]以近紅外熒光染料DiR為模型藥物。將Apamin-PEG-PLA與mPEG_PLA(Mw4300Da)按照摩爾比為10:90溶于氯仿，再加入DiR的甲醇溶液，混合均勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜后加入PBS (pH7.4)水化，再通過高壓乳勻機(jī)乳化成乳劑，控制平均粒徑為50nm，制得載藥納米粒Apamin-PEG-PLA-DiR。
[0069]同時(shí)，以Mal-PEG-PLA替代Apamin-PEG-PLA，按照上述相同方法，制得無靶頭對照。
[0070]2、體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0071]將sro級昆明種小鼠隨機(jī)分為2組，分別尾靜脈注射無靶頭對照和載藥納米粒Apamin-PEG-PLA-DiR，兩組在給藥后0.5、1、2、4、8、12、24h分別取I只小鼠，異氟烷氣體麻醉，用活體成像儀檢測樣品在小鼠體內(nèi)的分布；然后尾靜脈注射空氣致死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦和脊髓，用活體成像儀檢測不同臟器的納米粒分布量。
[0072]結(jié)果顯示,載藥納米粒Apamin-PEG-PLA-DiR可以穿過血腦屏障和血脊髓屏障到達(dá)腦和脊髓并且在給藥后6h達(dá)到最大分布量，而無靶頭對照給藥后在腦和脊髓沒有明顯分布。
[0073]最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，以蜂毒明肽或其衍生物為靶向配基，所述蜂毒明肽衍生物為肽鏈C端未酰胺化的蜂毒明肽，蜂毒明肽或其衍生物暴露于納米藥物載體的表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，所述納米藥物載體為納米膠束、納米脂質(zhì)體或納米粒，由祀向材料和組裝材料組成，所述祀向材料由蜂毒明肽或其衍生物與兩親性聚合物偶聯(lián)而得，所述組裝材料包括兩親性聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，所述納米藥物載體為納米膠束或納米脂質(zhì)體，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物與聚乙二醇修飾磷脂偶聯(lián)而得，所述組裝材料包括單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，所述靶向材料由蜂毒明肽或其衍生物通過N端的α-氨基和/或4位賴氨酸殘基中的ε-氨基與琥珀酰亞胺基功能化的聚乙二醇修飾磷脂反應(yīng)制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，所述聚乙二醇修飾磷脂為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺即PEG-DSPE、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺即PEG-DPPE、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰膽堿即PEG-DSPC和聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿即PEG-DPPC中的任一種或多種混合物；所述單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂為單甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺即mPEG-DSPE、單甲氧基聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺即mPEG-DPPE、單甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰膽堿即mPEG_DSPC和單甲氧基聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿即mPEG-DPPC中的任一種或多種混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，所述聚乙二醇修飾磷脂為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，其中聚乙二醇的重均分子量為3400 ；所述單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂為單甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，其中單甲氧基聚乙二醇的重均分子量為2000。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，納米膠束的組裝材料為單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂，納米脂質(zhì)體的組裝材料為磷脂、膽固醇和單甲氧基聚乙二醇修飾磷脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，所述納米藥物載體為納米粒，所述靶向材料為蜂毒明肽或其衍生物與聚乙二醇-聚丙交酯偶聯(lián)而得，所述組裝材料為單甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，所述靶向材料由N端添加1個半胱氨酸的蜂毒明肽或其衍生物通過N端的巰基與馬來酰亞胺基功能化的聚乙二醇-聚丙交酯反應(yīng)制得。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)所述的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的納米藥物載體，其特征在于，所述靶向材料與組裝材料的摩爾比不小于0.1:99.9 ;所述納米藥物載體的平均粒徑不大于200nm。
【文檔編號】A61K47/34GK104248768SQ201310263598
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月27日
【發(fā)明者】李翀, 吳瑾, 陳章寶 申請人:西南大學(xué)