豬輪狀病毒δvp8亞單位重組嵌合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及豬輪狀病毒ΔVP8亞單位重組嵌合蛋白及其應(yīng)用，所述重組嵌合蛋白是由破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2以及豬輪狀病毒Gottfried株VP8亞單位的截短形式（Gottfried-ΔVP8）和豬輪狀病毒OSU株VP8亞單位的截短形式（OSU-ΔVP8）嵌合而成，且在破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2、Gottfried-ΔVP8和OSU-ΔVP8之間通過(guò)柔性L(fǎng)inker連接，有助于重組嵌合蛋白的正確折疊，提高可溶性蛋白產(chǎn)量。本發(fā)明提供的豬輪狀病毒ΔVP8亞單位重組嵌合蛋白可誘導(dǎo)高滴度的抗類(lèi)Gottfried型(G4P[6])或類(lèi)OSU型(G5P[7]基因型特異的輪狀病毒中和抗體，表明該重組嵌合蛋白具有優(yōu)良的免疫原性，且該可溶性重組嵌合蛋白的產(chǎn)量高（實(shí)驗(yàn)室常規(guī)制備可達(dá)20mg/L以上），適合于工業(yè)化生產(chǎn)以及大批量新型豬輪狀病毒疫苗的制備。
【專(zhuān)利說(shuō)明】豬輪狀病毒ΔνΡ8亞單位重組嵌合蛋白及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)，具體地說(shuō)，涉及豬輪狀病毒AVP8亞單位重組嵌合蛋白及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]輪狀病毒性胃腸炎也稱(chēng)輪狀病毒性腹瀉，是全世界范圍內(nèi)嬰幼兒及多種幼齡動(dòng)物腹瀉的最主要的急性腸道傳染病，以腹瀉和脫水為特征，死亡率高，給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成巨大危害。
[0003]仔豬輪狀病毒腹瀉是由豬輪狀病毒(Procine Rotavirus，PRV)引起的一種以腹瀉、厭食、嘔吐、脫水為特征的急性傳染病，多發(fā)生于寒冷季節(jié)即晚秋、冬季和早春，各種年齡的豬皆可感染，感染率最高可達(dá)90%~100%。并且本病易繼發(fā)細(xì)菌性感染，令仔豬死亡率升高，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1975年Woode和Bridge在英國(guó)首次報(bào)道PRV，隨后PRV在豬群中的傳播引起了許多國(guó)家的重視，美國(guó)、法國(guó)、澳大利亞、北愛(ài)爾蘭等均有RV引起仔豬腹瀉的相關(guān)報(bào)道。數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)斷奶仔豬感染陽(yáng)性率為80%，病死率為15%;當(dāng)有混合感染時(shí)，病死率更高。英國(guó)報(bào)道I~4周齡仔豬的發(fā)病率超過(guò)80%，病死率10%~30%，發(fā)病豬體重急劇下降10%~20%，需半個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能回復(fù)到正常生長(zhǎng)速度，由此可見(jiàn)仔豬輪狀病毒腹瀉可給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。RV在豬群中普遍存在，波蘭人Markowska-Daniel等在11個(gè)大型豬場(chǎng)里，從2~10周齡的腹瀉仔豬群中(斷乳前發(fā)病率為8%~15%)采集了 1230份血清和531份糞樣，進(jìn)行RV抗體檢測(cè)及病毒分離，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示有1214份血清為RV抗體陽(yáng)性，169個(gè)糞樣為抗原陽(yáng)性；Barman等對(duì)采自印度Assam地區(qū)的528份豬血清樣品進(jìn)行了間接ELISA檢測(cè)，其中RV陽(yáng)性率占51.1%，明顯高于TGEV (豬傳染性胃腸炎病毒，39.4%)和PEDV (豬流行性腹瀉病毒，21.2%)。加拿大人Dewey等研究了豬A群輪狀病毒感染比率與飼養(yǎng)規(guī)模管理之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)規(guī)模大且斷奶較早的仔豬群易感染A群RV ;集約化生產(chǎn)模式下飼養(yǎng)的仔豬A群RV陽(yáng)性感染率比持續(xù)流動(dòng)設(shè)施條件下大約高3.4倍。
[0004]我國(guó)在1982年首次從腹瀉豬糞便中分離到輪狀病毒。1990年王玉春等對(duì)國(guó)內(nèi)19個(gè)省共計(jì)121個(gè)豬場(chǎng)做血清學(xué)調(diào)查，未發(fā)現(xiàn)RV陰性豬群。1999年李國(guó)平等在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)I~10日齡仔豬RV陽(yáng)性率在42.4%~66%之間，10日齡到斷奶仔豬RV陽(yáng)性率則高達(dá)83.2%~91.7%，斷奶后仔豬RV陽(yáng)性率為63.2%~72%。程健頻等在2002年10月對(duì)甘肅省莊浪縣7個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)90戶(hù)飼養(yǎng)的2100頭仔豬進(jìn)行了初步調(diào)查，感染RV并發(fā)病的仔豬有1460頭，發(fā)病率達(dá)69.5%，其中因環(huán)境溫度下降，繼發(fā)大腸埃希菌病死亡690頭，死亡率47.8%。2003年冬季至2004年春季，在上海的一些規(guī)模化豬場(chǎng)中，生產(chǎn)母豬雖然已按程序進(jìn)行了豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)苗免疫，但其產(chǎn)下的仔豬仍發(fā)生病毒性腹瀉，經(jīng)診斷為豬RV感染，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2011年12月16至17日，湖南省平江縣三陽(yáng)鄉(xiāng)的四個(gè)中等規(guī)模豬場(chǎng)的仔豬相繼發(fā)生一種以厭食、嘔吐、腹瀉為主要癥狀的疾病，經(jīng)診斷亦為RV感染，發(fā)病率為100%，因采取措施及時(shí)得當(dāng)，死亡率為10.3%。目前，我國(guó)規(guī)?；?、集約化養(yǎng)豬已占相當(dāng)大的比重，2012年生豬存欄47492萬(wàn)頭，而大部分豬群都未進(jìn)行RV免疫接種，處于免疫空白狀態(tài)，造成易感豬群廣泛存在，為輪狀病毒感染留下了極大隱患。
[0005]PRV經(jīng)糞-口途徑在豬群中傳播，病豬、隱性感染豬以及帶毒豬是主要的傳染源，病毒粒子主要存在于它們的消化道中，隨糞便排到體外，污染飼料、飲水、墊草及土壤等，經(jīng)消化道途徑使易感豬感染。排毒時(shí)間可持續(xù)數(shù)天，加之病毒對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，使輪狀病毒在成年豬、中豬、仔豬之間反復(fù)循環(huán)感染，長(zhǎng)期扎根豬場(chǎng)。另外，人和其他動(dòng)物也可散播傳染。在流行地區(qū)，由于大多數(shù)成年豬呈隱性感染而獲得對(duì)病毒的免疫力，因此，發(fā)病豬多是8周齡以下的仔豬，日齡越小的仔豬，發(fā)病率越高，I~4周齡仔豬發(fā)病率超過(guò)80%。該病主要表現(xiàn)為腹瀉癥狀，發(fā)病仔豬糞便為水樣或糊狀，嚴(yán)重者帶有粘液和血液。若繼發(fā)或并發(fā)其他細(xì)菌性或病毒性疾病，極易導(dǎo)致高死亡率。中豬和大豬呈隱性感染，無(wú)臨床癥狀。
[0006]RV主要入侵小腸絨毛上皮細(xì)胞，其次是盲腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞。幼畜感染RV后，很快便會(huì)發(fā)生胃壁遲緩，小腸絨毛萎縮、上皮細(xì)胞脫落，腸道分泌和吸收功能失調(diào)，致使腸內(nèi)容物滲透壓增高，正常的離子和水分即向腸腔分泌，最終導(dǎo)致滲透性腹瀉。眼觀(guān)病變主要局限于消化道，小腸黏膜呈條狀或彌散性出血，腸壁變薄且腸粘膜易脫落。
[0007]目前我國(guó)較大規(guī)模臨床應(yīng)用的包括福建省生物藥品廠(chǎng)與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合開(kāi)發(fā)的TGEV-PEDV-RV三聯(lián)弱毒苗，以及中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的RV-TGEV 二聯(lián)弱毒苗等。弱毒疫苗雖然克服了滅活疫苗固有的一些缺陷，但由于致弱毒株毒力不穩(wěn)定，存在著病毒污染、毒力返強(qiáng)、疫苗株與流行株共存可能產(chǎn)生強(qiáng)毒株，疫苗基因重配后可能擴(kuò)大感染宿主等不安全因素，給養(yǎng)豬業(yè)的安全生產(chǎn)帶來(lái)了極高風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)豬群的RV陽(yáng)性率非常高，至今還沒(méi)有治療豬輪狀病毒腹瀉的特效藥物，疫苗接種是預(yù)防該病的主要措施。國(guó)內(nèi)豬RV疫苗的研究一直是薄弱環(huán)節(jié)，而現(xiàn)有疫苗對(duì)于控制該病的發(fā)生和流行并不十分理想，因此開(kāi)發(fā)廉價(jià)、安全、有效的輪狀病毒新型疫苗是具有十分重要的意義。
[0008]輪狀病毒(Rotavirus, RV)為呼腸弧病毒屬(Reoviridae)成員，病毒基因組由11節(jié)段dsRNA組成，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VPl~4，VP6~7)和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1~6)。成熟的病毒粒子為三層衣殼結(jié)構(gòu)，最外層由纖突蛋白VP4 (經(jīng)蛋白酶裂解形成VP8和VP5)和糖蛋白VP7組成。VP7與病毒在富含蛋白酶的成熟的小腸上皮細(xì)胞中復(fù)制直接相關(guān)。VP4蛋白不僅涉及RV的粘附、侵入，而且與RV血凝性、中和活性、毒力以及蛋白酶裂解后感染性增強(qiáng)等理化特性相關(guān)。VP7和VP4都可獨(dú)立的誘導(dǎo)病毒中和抗體，抗VP7和VP4的抗體都可阻止病毒的侵入。因此，VP7和VP4成為疫苗開(kāi)發(fā)的首選目標(biāo)分子。
[0009]輪狀病毒基因型別組合眾多，不同基因型間的交叉免疫甚少，這給疫苗研制帶來(lái)了困難。然而，研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)P基因型可能覆蓋數(shù)個(gè)G基因型，即某個(gè)P型可以與不同的G型組合，理論上同一 P型可以誘導(dǎo)抗不同G型的異型免疫。而決定P型的VP4蛋白含有多個(gè)線(xiàn)性化抗原表位，且該蛋白無(wú)需翻譯后修飾，其經(jīng)胰酶裂解后形成的VP8片段，包含了 VP4型特異性主要抗原表位，皆為線(xiàn)性且較為保守，可以利用VP8蛋白來(lái)開(kāi)發(fā)新型的PRV亞單位疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種豬輪狀病毒AVP8亞單位重組嵌合蛋白及其應(yīng)用。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種豬輪狀病毒Λ VP8亞單位重組嵌合蛋白，其是由破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2以及豬輪狀病毒Gottfried株VP8亞單位的截短形式(以Gottfried- Λ VP8表示)和豬輪狀病毒OSU株VP8亞單位的截短形式(以O(shè)SU- Δ VP8表示)嵌合而成的重組蛋白，且在破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2、Gottfried- Δ VP8和OSU- Δ VP8之間通過(guò)柔性L(fǎng)inker連接，有助于重組嵌合蛋白的正確折疊，提高可溶性蛋白產(chǎn)量。
[0012]其中，所述破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2、豬輪狀病毒Gottfried株VP8亞單位的截短形式以及所述豬輪狀病毒OSU株VP8亞單位的截短形式的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.7-9所示。破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2和Gottfried-Λ VP8之間用柔性L(fǎng)inker “GGGGS”連接，形成的 P2-Gottfried_ Λ VP8 與 OSU-Λ VP8 之間用柔性 Linker “GS”連接。
[0013]具體地，本發(fā)明的一種豬輪狀病毒AVP8亞單位重組嵌合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0014]本發(fā)明還提供編碼上述重組嵌合蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。
[0015]本發(fā)明還提供含有上述基因的表達(dá)載體及宿主細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明還提供制備上述重組嵌合蛋白的方法，將含有編碼所述豬輪狀病毒AVP8亞單位重組嵌合蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆并接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組嵌合蛋白。
[0017]根據(jù)可溶性蛋白表達(dá)的需要，向所述LB液體培養(yǎng)基中額外添加0.02g/mL葡萄糖和I~5% (v/v)乙醇。
[0018]優(yōu)選地，將陽(yáng)性克隆并接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_約0.5，加入IPTG至終濃度為ImM，在16°C下誘導(dǎo)表達(dá)重組嵌合蛋白。
[0019]本發(fā)明進(jìn)一步提供所述豬輪狀病毒AVP8亞單位重組嵌合蛋白在制備豬輪狀病毒疫苗或藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明提供的豬輪狀病毒AVP8亞單位重組嵌合蛋白可誘導(dǎo)高滴度的抗類(lèi)Gottfried型(G4P[6])或類(lèi)OSU型(G5P[7]基因型特異的輪狀病毒中和抗體，表明該重組嵌合蛋白具有優(yōu)良的免疫原性，且該可溶性重組嵌合蛋白的產(chǎn)量高(實(shí)驗(yàn)室常規(guī)制備可達(dá)20mg/L以上)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)以及大批量新型豬輪狀病毒疫苗的制備。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021 ] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中P2-Gottfried_ Δ VP8PCR電泳圖；其中，I為MarkerDL2000，2 為 P2-Gottfried-AVP8。
[0022]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中0SU-AVP8PCR電泳圖；其中，I為Marker，2為OSU-ΛVP8。
[0023]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中pET28a-P2-Gottfried_AVP8重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖；其中，M 為 Marker DL7000，1、2、3、4 均為 pET28a-P2_Gottfried-Λ VP8 質(zhì)粒單酶切，經(jīng)鑒定2、3號(hào)樣品為含有P2-Gottfried-AVP8的重組質(zhì)粒。
[0024]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中pET28a-P2_Gottfried- Δ VP8-0SU- Δ VP8重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖；其中，I 為 Marker DL7000，2 為 pET28a-P2_Gottfried-Λ VP8-0SU-Λ VP8 重組質(zhì)粒雙酶切。
[0025]圖5 為本發(fā)明實(shí)施例 2 中重組 P2-Gottfried_ Δ VP8-0SU- Λ VP8 蛋白 SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖；其中，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas, unstained protein Molecularweight Marker,#SM0431 )1為誘導(dǎo)前全菌體；2為誘導(dǎo)后菌體裂解液上清(37°C誘導(dǎo)2.5h)；3為誘導(dǎo)后菌體裂解液沉淀(37°C誘導(dǎo)2.5h) ；4為誘導(dǎo)后菌體裂解液上清(16°C誘導(dǎo)16h)；5為誘導(dǎo)后菌體裂解液沉淀(16°C誘導(dǎo)16h) ；6為空載體誘導(dǎo)后全菌體(37°C誘導(dǎo)2.5h)。
[0026]圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中P2-Gottfried-AVP8-0SU_AVP8重組嵌合蛋白的Western blot檢測(cè)圖；其中，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Crystalgen, ProteinIadderl0-170KD)；1為誘導(dǎo)前全菌體；2為誘導(dǎo)后菌體裂解液上清(37°C誘導(dǎo)2.5h)；3為誘導(dǎo)后菌體裂解液沉淀(37°C誘導(dǎo)2.5h) ；4為空載體誘導(dǎo)后全菌體(37°C誘導(dǎo)2.5h)。

【具體實(shí)施方式】
[0027]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0028]以下實(shí)施例中使用的豬輪狀病毒OSU株、Gottfried株VP8基因來(lái)自于重組質(zhì)粒 pCR4-0SU-VP4 (GenBank 登錄號(hào):X13190)和 pCR4-Gottfried_VP4 (GenBank 登錄號(hào):M33516)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)參考序列通過(guò)基因合成的方法獲得相應(yīng)基因；原核表達(dá)載體pET-28a及工程菌E.coli BL21 (DE3)購(gòu)自Novagen公司；所用引物為自行設(shè)計(jì)并委托蘇州金維智生物科技有限公司合成。
[0029]實(shí)施例1含有目的片段的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0030]本實(shí)施例中使用豬輪狀病毒的經(jīng)典毒株OSU株和Gottfried株(從各大洲仔豬分離到的豬輪狀病毒毒株大多數(shù)屬于這兩種P基因型之一，即類(lèi)Gottfried型(G4P[6])或類(lèi)OSU型(G5P[7]))，其中所用的引物是根據(jù)豬輪狀病毒Gottfried株VP4的基因序列(GenBank登錄號(hào):M33516)或OSU株VP4的基因序列(GenBank登錄號(hào):X13190)而設(shè)計(jì)的，其中在Gottfried-Λ VP8兩端分別引入Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)，并在其上游引入破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位Ρ2序列，Ρ2序列與Gottfried-Λ VP8之間引入“GGGGS”柔性L(fǎng)inker。在OSU- Δ VP8上游引物中引入BamH I酶切位點(diǎn)，在P2-Gottfried_ Δ VP8和OSU- Δ VP8重組蛋白之間引入另一柔性L(fǎng)inker “GS”，在OSU-Λ VP8下游引物中引入Hind III酶切位點(diǎn)。
[0031]擴(kuò)增P2-Gottfried-AVP8 (即在Gottfried-Λ VP8的5’端連有編碼破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽Ρ2的核苷酸序列)、OSU-AVPS的引物序列如下:
[0032]P2-Gottfried-AVP8-UP 5’ -AATTCCATATGCAGTACATCAAAGCAAATTCTAAGTTTATTGGTATCACGGAGCTCGGAGGTGGCGGATCTGTACTTGACGGTCCATATCAGCC-3’ (Nde I)
[0033]P2-Gottfried-Δ VP8-L0W 5’-CGGGATCCTAAC CCAGTATTAATATACTCATTGC-3’(BamH I)
[0034]OSU-ΔVP8-UP 5’-CGGGATCCTTATTAGATGGCCCATACCAACCAA-3’ (BamH I)
[0035]OSU-ΔVP8-L0W 5’-ATAGAAAGCTTTCCATGATTGATATACTCAGTAC-3’ (Hind III)
[0036]反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下:
[0037]以重組質(zhì)粒pCR4-Gottfried_VP4 或 pCR4-0SU_VP4 為模板(根據(jù) GenBank 公布的Gottfried-VP4和0SU-VP4基因序列，通過(guò)人工合成的方法獲得Gottfried_VP4和0SU-VP4基因片段，并分別插入到克隆載體pCR4 (Invitrogen公司)中，即構(gòu)建得到重組質(zhì)粒 pCR4-Gottfried-VP4 和 pCR4-0SU_VP4),通過(guò) pfu 高保真 DNA 聚合酶擴(kuò)增 GottfriedP[6]特異性P2-AVP8融合片段或OSU P[7]特異性ΛVP8片段。擴(kuò)增參數(shù)見(jiàn)表1。P2-Gottfried-AVP8PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，OSU-Λ VP8片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。通過(guò)Qiagen快速膠回收試劑盒回收各PCR產(chǎn)物。
[0038]將回收的P2-Gottfried_AVP8片段和0SU-AVP8片段通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶依次定向克隆到含6 XHis-tag標(biāo)簽(用于重組蛋白的親和柱層析)的pET28a載體中，從而獲得pET28a-P2-Gottfried- Δ VP8-0SU- Δ VP8 重組質(zhì)粒。pET28a-P2-Gottfried- Δ VP8 重組質(zhì)粒的單酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3，所述重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，鑒定所構(gòu)建質(zhì)粒的完整性和正確性。
[0039]具體如下:
[0040](1) PCR 擴(kuò)增 P2-Gottfried_ Δ VP8 片段[0041 ] PCR反應(yīng)體系(表1)及反應(yīng)條件如下:
[0042]表1PCR 反應(yīng)體系(25 μ L)
[0043]

【權(quán)利要求】
1.豬輪狀病毒AVP8亞單位重組嵌合蛋白，其特征在于，其是由破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2以及豬輪狀病毒Gottfried株VP8亞單位的截短形式和豬輪狀病毒OSU株VP8亞單位的截短形式嵌合而成的重組蛋白，且在破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2、豬輪狀病毒Gottfried株VP8亞單位的截短形式和豬輪狀病毒OSU株VP8亞單位的截短形式之間通過(guò)柔性L(fǎng)inker連接； 其中，所述破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位多肽P2、豬輪狀病毒Gottfried株VP8亞單位的截短形式以及所述豬輪狀病毒OSU株VP8亞單位的截短形式的氨基酸序列分別如SEQ IDN0.7-9 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組嵌合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述重組嵌合蛋白的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求3或4所述基因的宿主細(xì)胞。
7.制備權(quán)利要求1或2所述重組嵌合蛋白的方法，其特征在于，將權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆并接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組嵌合蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基中還添加0.02g/mL葡萄糖和I~5v/v%乙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，將陽(yáng)性克隆并接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl約0.5，加入IPTG至終濃度為ImM，在16°C下誘導(dǎo)表達(dá)重組嵌合蛋白。
10.權(quán)利要求1或2所述的重組嵌合蛋白在制備豬輪狀病毒疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/15GK104072617SQ201310289361
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】聞曉波, 張艷, 冉旭華, 魏曉曼, 崔玉東, 朱戰(zhàn)波, 張春山 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)