一種小分子抗體親和肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種抗體高選擇性小分子抗體親和肽及應(yīng)用。本發(fā)明的小分子抗體親和肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1-54中的任一項所示。根據(jù)本發(fā)明的小分子抗體親和肽，其與人免疫球蛋白IgG的Fc片段結(jié)合，并且不與人血清白蛋白HAS結(jié)合。采用本發(fā)明的小分子抗體親和肽作為親和配體，可以實現(xiàn)高效、安全、經(jīng)濟(jì)的IgG分離純化。
【專利說明】一種小分子抗體親和肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種抗體高選擇性小分子抗體親和肽及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]免疫球蛋白IgG，即抗體是一種特殊的蛋白質(zhì)分子，被作為體外診斷的試劑、治療疾病的藥物、免疫親和層析的配基等，在生命科學(xué)研究、生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。
[0003]目前,IgG的分離純化多采用抗體的天然親和配體Protein A/G,由于Protein A/G存在與抗體Fe片段專一性識別的能力，使用Protein A/G親和色譜純化抗體，獲得的產(chǎn)品的純度較高。但是由于Protein A/G也屬于具有活性的生物物質(zhì)，因此Protein A/G分離也存在一些問題:
[0004]I)價格昂貴:因為蛋白A配基需要通過基因工程的方法生產(chǎn)純化，因此生產(chǎn)成本高，其價格達(dá)到$10000/升親和介質(zhì)；
[0005]2)缺乏有效的清洗方法，由于蛋白A在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定，因此不能使用一般的氫氧化鈉原位清洗法；
[0006]3)由于配基也屬于蛋白質(zhì)，易被存在原料液中的蛋白酶水解，從而降低分離效果;
[0007]4)與一般的化學(xué)配基相比，蛋白A色譜的使用生命周期較短；
[0008]5)配基易脫落，脫落的蛋白A會引起人的免疫反應(yīng)且在臨床上已經(jīng)證實對人體有毒害;
[0009]6)洗脫pH較低(pH2-3)，易引起一些抗體失活或者出現(xiàn)聚集，常常需要邊收集產(chǎn)品，邊中和，增加操作的復(fù)雜度。
[0010]對于抗體的分離純化，也有很多研究者嘗試使用小分子化合物作為配體，也取得的了一定的效果，但是目前的小分子化合物配體也存在一些問題:
[0011]I)生理毒性:目前的小分子化合物配體多含有雜環(huán)，具有一定毒性。例如，4-巰基-乙基吡啶(MEP)，其對小鼠50%致死量為178mg/kg。
[0012]2)親和性差:目前的小分子化合物配體親和力通常較Protein A/G低。
[0013]3)選擇性差:目前的小分子化合物配體在結(jié)合IgG的同時也會與主要分離雜質(zhì)HAS (人血清白蛋白)結(jié)合。
[0014]所以，目前IgG的分離純化缺乏一種高效安全經(jīng)濟(jì)的親和配體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的在于針對上述問題，提供一種小分子抗體親和肽作為親和配體，實現(xiàn)高效安全經(jīng)濟(jì)的IgG分離純化。
[0016] 本發(fā)明的另一目的是提供上述小分子抗體親和肽的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的小分子抗體親和肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1-54中的任一項所示。
[0018]進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的小分子抗體親和肽，其結(jié)構(gòu)特征，自N端至C端如下:
[0019]NH2-R1-R2-R3-R4-COOH,
[0020]其中，R1為蘇氨酸(Thr)或谷氨酸(Glu)或門冬氨酸(Asp)，R2為蘇氨酸(Thr)或谷氨酸(Glu)或門冬氨酸(Asp)，R3為谷氨酸(Glu)或門冬氨酸(Asp)或脯氨酸(Pro)，R4為半胱氨酸(Cys)或甘氨酸(Gly)。也可以理解為R1和R2為酸性氨基酸及其衍生物，R3為酸性氨基酸或脯氨酸，R4為半胱氨酸(Cys)或甘氨酸(Gly)。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的小分子抗體親和肽，所述小分子抗體親和肽與人免疫球蛋白IgG的Fe片段結(jié)合，并且其不與人血清白蛋白HSA結(jié)合。
[0022]進(jìn)一步的，本發(fā)明通過將所述的小分子肽偶聯(lián)于載體以分離純化免疫球蛋白IgG。
[0023]本發(fā)明提供了一種小分子抗體親和肽，用于分離純化免疫球蛋白IgG，通過將所述的小分子肽偶聯(lián)于不同的載體可以實現(xiàn)不同條件下免疫球蛋白IgG的分離或純化，例如將該小分子肽偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠，可以制備親和層析柱純化免疫球蛋白IgG ;而將該小分子肽偶聯(lián)于透析器的中空纖維膜，則可應(yīng)用于自身免疫性疾病的血液凈化治療，選擇性的清除致病IgG。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和有益效果:
[0025]I)高效:該小分子抗體親和肽的結(jié)合力與人免疫球蛋白天然配體Protein A/G相當(dāng)，同時不與人血清白蛋白結(jié)合。
[0026]2)安全:該小分子抗體親和肽分子量小(小于6肽)，無免疫原性；其殘基序列取自20種必需氨基酸,安全無毒。
[0027]3)經(jīng)濟(jì):該小分子抗體親和肽由固相合成而得，成本較低且便于質(zhì)量管控。
[0028]因而采用該小分子抗體親和肽作為親和配體，可以實現(xiàn)高效、安全、經(jīng)濟(jì)的IgG分離純化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明中小分子抗體親和肽I與免疫球蛋白IgG的SPR動力學(xué)測定曲線；
[0030]圖2為天然配體(ProG)與免疫球蛋白IgG的SPR動力學(xué)測定曲線。

【具體實施方式】
[0031]實施例1多肽合成
[0032]I)活化樹脂:稱取 100mg FMOC Cys-wang Resin，加入 10_15mL DMF 浸泡 30min
(浸沒全部樹脂)，使其充分溶脹。
[0033]2)脫保護(hù):壓濾除去浸泡樹脂的DMF，加入用20%哌啶的DMF溶液10mL，氮氣吹沸反應(yīng)15min，然后壓濾除去用20%哌啶的DMF溶液，脫除氨基的FMOC基團(tuán)，用1mL異丙醇洗滌樹脂三次，1mL DMF洗三次，而后用茚三酮法檢測樹脂應(yīng)成黑色或紫色。
[0034]3)縮合反應(yīng):連接下一個氨基酸，稱取FMOC-氨基酸(Glu、Asp或Pro)的用量是1.4mmol/g 樹脂，910mg TBTU，加入 1mL DMF 和 0.45g HOBt 混和均勻后，加入 0.52mL DIEA配成反應(yīng)液，室溫下氮氣吹沸反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢后，用異丙醇洗滌樹脂三次，然后用DMF洗滌樹脂三次。檢測氨基。
[0035]4)重復(fù)步驟2)-3):按多肽的順序自C端向N端延伸多肽。重復(fù)脫保護(hù)、洗滌、縮合的過程至剩余的氨基酸連接完畢，完成多肽的連接。
[0036]首位(R1)氨基酸為Thr或Glu或Asp，第二位(R2)氨基酸為Thr或Glu或Asp，第三位氨基酸(R3)為Glu或Asp或Pro,末位氨基酸(R4)為Cys。
[0037]5)多肽切割:用氮氣將多肽-樹脂復(fù)合物吹干，按TFA/phenol/ff1/th1anisole/EDT/TIS (80/5/5/5/3/2)的比例配成混和切割試劑。將肽樹脂置于圓底燒瓶中，加入切割液磁力攪拌2小時，用200目砂芯過濾器除去樹脂，濾液直接抽入冷凍乙醚中，3000r / min離心使粗肽沉淀，凍干至恒重即得粗肽，干燥稱重。
[0038]6)粗肽用HPLC純化至95%以上，質(zhì)譜鑒定。
[0039]末位氨基酸(R4)為Gly時，同上述步驟。
[0040]實施例2IgG親和特性測定
[0041]I)配制 10mmol /T, Hepes 緩沖液，pH7.4, NaCl 含量 1 SOmmoI /I,η
[0042]2)以I)中配制液體為流動相，運行BiaCoreT200分析儀。
[0043]3 )插入檢測芯片CM5，設(shè)定流速30 μ L/min。
[0044]4)依次注入EDC和NHS各100 μ L，活化芯片。
[0045]5)將IgG溶解于醋酸鈉緩沖液，ρΗ4.5，IgGlOO μ g/mL。
[0046]6)注入5)中IgG溶液100 μ L，固定IgG于芯片表面。
[0047]7)分別將小分子抗體親和肽I (氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示)，小分子抗體親和肽2 (氨基酸序列如SEQ ID N0.34所示)和天然配體(ProG與ProA),溶解于I)中配制液體，含量100 U g/mL。
[0048]8)依次注入不同濃度的多肽和天然配體(濃度由高到低依次為500 μ m，250 μ m，125 μ m，62.5 μ m和31.25 μ m),記錄其與IgG的吸附曲線。求得其相關(guān)參數(shù)，具體結(jié)果見圖1、圖2及其表1 (小分子親和肽2與免疫球蛋白IgG的SPR動力學(xué)測定曲線圖的繪制同小分子親和肽1，ProA與免疫球蛋白IgG的SPR動力學(xué)測定曲線圖的繪制同ProG，本實施例不再累述給出相關(guān)附圖)。
[0049]表1為本發(fā)明中小分子抗體親和肽，Protein A/G與免疫球蛋白IgG結(jié)合常數(shù)比較表

【權(quán)利要求】
1.一種小分子抗體親和肽，其特征在于，所述小分子抗體親和肽的氨基酸序列如SEQID N0.1-54中的任一項所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子抗體親和肽，其特征在于，所述小分子抗體親和肽與人免疫球蛋白IgG的Fe片段結(jié)合，并且不與人血清白蛋白HAS結(jié)合。
3.權(quán)利要求1所述小分子抗體親和肽的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子抗體親和肽的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用為在分離、純化或清除 人免疫球蛋白IgG中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61M1/34GK104163850SQ201310300695
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月15日
【發(fā)明者】徐霞, 韋宇平, 徐建棟 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所