包含非天然編碼的氨基酸的人生長激素配方的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種聚乙二醇化的人生長激素（hGH）多肽的醫(yī)藥制劑，所述多肽為具有對乙酰苯丙氨酸的人生長激素，其中所述對乙酰苯丙氨酸于選自由下列所組成群組中的位置處對hGH進行取代：SEQ?ID?NO:2的第35、92、131、134、143以及145位；其中所述對乙酰苯丙氨酸通過一個肟鍵與一個線性聚乙二醇相連，且所述聚乙二醇的分子量為20kDa～40kDa；其中，所述制劑為冷凍液體；其中，所述經(jīng)聚乙二醇化的hGH多肽的血清半衰期為天然未經(jīng)聚乙二醇化的hGH多肽的至少兩倍。
【專利說明】包含非天然編碼的氨基酸的人生長激素配方
[0001]分案說明
[0002]本申請案是申請日為2005年12月22日，申請?zhí)枮?00580044435.5 (國際申請?zhí)枮镻CT/US2005/047001)，發(fā)明名稱為包含非天然編碼的氨基酸的人生長激素配方的專利申請的分案申請。
[0003]相關申請案的交叉參考
[0004]本申請案主張2004年12月22日申請的美國臨時專利申請案第60/638，616號、2005年5月13日申請的美國臨時專利申請案第60/680，617號和2005年10月17日申請的美國臨時專利申請案第60/728，035號的優(yōu)先權，所述說明書都是以其全文引用的方式并入本文中。
【技術領域】
[0005]本發(fā)明涉及具有hGH多肽的穩(wěn)定人生長激素(hGH)配方，所述多肽包含與聚(乙二醇)(PEG)共價連接的非天然氨基酸。
【背景技術】
[0006]人生長激素參與許多有關正常人類生長和發(fā)育的調(diào)控。這一天然產(chǎn)生的單鏈垂體激素是由191個氨基酸殘基組成，并且具有約22kDa的分子量。hGH展現(xiàn)出多種生物作用，包括線性生長(體質(zhì)形成)、泌乳、巨噬細胞活化和類胰島素作用與致糖尿病作用等(Chawla’R.等人,Ann.Rev.Med.34:519-547 (1983) ；Isaksson, 0.等人,Ann.Rev.Physiol, 47:483-499 (1985) ；Hughes, J.和 Friesen, H., Ann.Rev.Physiol.，47:469-482(1985))。
[0007]眾所周知hGH 的結構(GoeddeI，D.等人，Nature281:544-548 (1979))，并且 hGH 的三維結構已通過X射線晶體學解釋(de Vos, A.等人，Science255:306-312(1992))。所述蛋白質(zhì)具有致密的球狀結構，包含通過環(huán)連接的四個兩親α螺旋束,從N末端起始稱為A-D。關于hGH (包括其受體和變異體)和其他GH總科成員的進一步論述提供于標題為“ModifedHuman Growth Hormone Polypeptides and Their Uses”的美國專利申請案第 11/046, 432號和標題為 “Modified Human Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses” 的PCT國際專利申請案第PCT/US05/03537號中，所述專利都是以其全文引用的方式并入本文中。
[0008]重組體hGH可作治療用，并且已批準用于治療多種適應癥。舉例而言，hGH缺乏將引起侏儒癥，十多年來，已通過外部投與所述激素成功地治療所述病癥。除hGH缺乏外，也已批準將hGH用于治療腎衰竭(兒童腎衰竭)、特納氏綜合癥(Turner’s Syndrome)和AIDS患者的惡病質(zhì)。近來，美國食品和藥品監(jiān)督局(Food and Drug Administration, FDA)已批準將hGH用于治療非GH依賴性身材矮小。目前，也正在對hGH治療衰老、老年人虛弱、短腸綜合癥和充血性心力衰竭進行研究。hGH治療的目標群體包括患有特發(fā)性身材矮小(ISS)的兒童和具有類GHD癥狀的成年人。[0009]目前，重組hGH當今是作為可每日注射的產(chǎn)品銷售，且當今市場上的五種主要產(chǎn)品為:Humatrope? (Eli Lilly&C0.)、Nutropin? (Genentech)、Norditropin?(Novo-Nordisk)、Genotropin? (Pfizer)和 Saizen/Serostim? (Serono)0 然而，使用生長激素作為治療劑的主要問題在于，所述蛋白質(zhì)在活體內(nèi)具有短半衰期，且因此必須通過每日皮下注射投藥來使其發(fā)揮最大效用(MacGillivray等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.81:1806-1809(1996))。相當多的成就集中在通過降低制造成本、使得更易于向患者投藥、改良功效和安全性概況和引起將提供競爭優(yōu)勢的其他特性來改良投與hGH激動劑和拮抗劑的方式。舉例而言，Genentech和AlkermesNutropin曾在市場上銷售Depot?,即一種適用于兒科生長激素缺乏的儲槽式hGH配方。盡管所述儲槽允許較不頻繁地投藥(每2-3周一次而非每日一次)，但也伴有不合需要的副作用，諸如降低的生物利用度和注射部位疼痛，且因此已于2004年退出市場。另一種產(chǎn)品Pegvisomant?(Pfizer)也已于近期獲FDA批準。Pegvisomant?是一種經(jīng)基因工程設計的hGH類似物，其對于治療肢端肥大癥起到高選擇性生長激素受體拮抗劑的作用(van der Lely等人，The Lancet358:1754-1759 (2001))。盡管Pegvisomant?中的若干氨基酸側鏈殘基都已經(jīng)聚乙二醇(PEG)聚合物衍生化，但仍需每日一次投與所述產(chǎn)品，此表明醫(yī)藥特性未達到最佳。除PEG化和儲槽式配方外，包括hGH吸入劑型和口服劑型的其它投藥途徑也正處于早期前臨床和臨床研究中，并且都尚未獲得FDA的批準。因此，需要一種展現(xiàn)生長激素活性而且也提供較長血清半衰期且因此具有更優(yōu)的hGH治療水平和增加的治療半衰期的多肽。
[0010]與親水性聚合物聚(乙二醇)(縮寫為PEG)共價連接是一種增加包括蛋白質(zhì)、肽和尤其疏水性分子的多個生物活性分子的水溶性、生物利用度；增加其血清半衰期；增加其治療半衰期；調(diào)節(jié)其免疫原性；調(diào)節(jié)其生物活性；或延長其循環(huán)時間的方法。已將PEG廣泛用于醫(yī)藥、人工移植物以及生物可相容性、無毒性和無免疫原性具有重要性的其它應用中。為使PEG的所需特性最大化，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態(tài)必須足夠高，從而賦予通常與PEG聚合物連接相關的有利特性，諸如增加的水溶性和循環(huán)半衰期，同時也不會對母體分子的生物活性造成不利影響。
[0011] 近來，已對蛋白質(zhì)科學中的整個新技術進行報導，其將有望克服與蛋白質(zhì)位點特異性修飾有關的許多缺點。具體說來，已將新組份加入原核生物大腸桿菌(Escherichia coli, E.coli)(例如，L.Wang 等人,(2001), Science292:498-500)和真核生物釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae, S cerevisiae)(例如，J.Chin 等人，Science301:964_7 (2003))的蛋白質(zhì)生物合成機器中，其已使得能夠于活體內(nèi)將非基因編碼的氨基酸并入到蛋白質(zhì)中。使用這一方法，已對琥珀密碼子TAG起反應以高保真度將大量具有新穎化學、物理或生物學特性的新氨基酸有效地并入E.coli和酵母中的蛋白質(zhì)中，所述氨基酸包括光親和性標記和光敏異構化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸(例如參看 Chin, J.W.等人(2002) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.99:11020-11024 ；和 Chin, J.W.等人，(2002) T.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮某氡某酸、含有重原子的氡某酸和糖基化氨基酸。例如參看 J.W.Chin 等人,(2002), Tournal of the American ChemicalSocietvl24:9026-9027 ；J.ff.Chin, &P.G.Schultz, (2002).ChemBioChem3(11):1135-1137 ；J.ff.Chin 等人，(2002)，PNAS United States of America99:11020-11024 ;和 L.Wang, &P.G.Schultz, (2002).Chem.Comm., 1:1-11。所有參考文獻都是以其全文引用的方式并入本文。這些研究已證實，可能選擇性地且常規(guī)地引入未見于蛋白質(zhì)中、對見于20種常見、基因編碼的氨基酸中的所有官能團具化學惰性且可用于有效且選擇性反應形成穩(wěn)定共價鍵的化學官能團，諸如酮基、炔基和疊氮基部分。
[0012]將非基因編碼的氨基酸并入蛋白質(zhì)的能力允許引入可向天然存在的官能團(諸如賴氨酸的ε -NH2、半胱氨酸的硫氫基-SH、組氨酸的亞氨基等)提供有價值的替代選擇的化學官能團。
[0013]人生長激素配方可為需要復水的凍干制劑或水性配方。每小瓶Protix)pinTMhGH是由復水成ρΗ7.8的5mg hGH、40mg甘露糖醇、0.1mg磷酸二氫鈉、1.6mg磷酸二氫鈉組成(Physician’s Desk Reference, Medical Economics C0., OrawelI, N.J.,第 1049頁，1992)。每小瓶Humatrope?hGH是由復水成ρΗ7.5的5mg hGH、25mg甘露糖醇、5mg甘氨酸、1.13mg 磷酸二氫鈉組成(Physician，s Desk Reference,第 1266 頁，1992)。水性人生長激素配方的實例描述于美國專利第5, 763, 394號;第5, 981, 485號;第6, 448, 225號；和美國專利公開案第2003/0013653號中，所述專利的每一者都是以引用的方式并入本文中。 [0014]有關生長激素配方的基本綜述,參看Pearlman等人，Current Communicationsin Molecular Biology, D.Marshak 和 D.Liu 編輯，第 23-30 頁,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，1989,所述文獻是以引用的方式并入本文中。有關蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的其它引人關注的公開案如下。
[0015]美國專利第4，297，344號(其是以引用的方式并入本文)揭示通過加入所選擇的氨基酸(諸如甘氨酸、丙氨酸、羥脯氨酸、谷氨酰胺和氨基丁酸)和碳水化合物(諸如單醣、寡醣或糖醇)來使凝血因子II和VII1、抗凝血酶III和纖溶酶原耐熱穩(wěn)定。
[0016]美國專利第4，783，441號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種通過加入多達500ppm包含在pH6.8-8.0下具有交替弱親水性和弱疏水性區(qū)域的鏈的表面活性物質(zhì)來防止蛋白質(zhì)(諸如胰島素)在水溶液界面處變性的方法。
[0017]美國專利第4，812，557號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種使用人血清白蛋白使白細胞介素-2穩(wěn)定的方法。
[0018]歐洲專利申請公開案第0303746號(其是以引用的方式并入本文)揭示用由非還原性糖、糖醇、糖酸、季戊四醇、乳糖、水溶性葡聚糖和Ficoll組成的多元醇、氨基酸、在生理PH值下具有帶電側基的氨基酸聚合物和膽堿鹽使生長促進激素穩(wěn)定。
[0019]歐洲專利申請公開案第0211601號(其是以引用的方式并入本文)揭示使生長促進激素在由含有聚氧乙烯-聚氧丙烯單元且具有約1，100到約40，000的平均分子量的嵌段共聚物所形成的凝膠基質(zhì)中穩(wěn)定。
[0020]歐洲專利申請公開案第0193917號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種以蛋白質(zhì)與碳水化合物的復合物的水溶液為特征用于減緩釋放的生物活性組合物。
[0021]國際專利公開案第89/09614號和澳大利亞專利申請案第30771/89號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種含有人生長激素、甘氨酸和甘露糖醇的穩(wěn)定醫(yī)藥配方。這類制劑在正常加工和以凍干狀態(tài)儲存以及復水后使用期間都展示出經(jīng)改良的穩(wěn)定性。
[0022]美國專利第5，096，885號(其是以引用的方式并入本文)揭示一種含有甘氨酸、甘露糖醇、非離子表面活性劑和緩沖劑的凍干hGH配方。
[0023]美國專利第4，876，568號(其是以引用的方式并入本文)揭示:可以各種穩(wěn)定劑使動物生長激素穩(wěn)定以減少水性環(huán)境中不溶物質(zhì)的形成和可溶物質(zhì)活性的保持。所述穩(wěn)定劑包括某些多元醇、氨基酸、在生理PH值下具有帶電側基的氨基酸聚合物和膽堿鹽。多元醇是選自由非還原性糖、糖醇、糖酸、季戊四醇、乳糖、水溶性葡聚糖和Ficoll組成的群組；氨基酸是選自由甘氨酸、肌氨酸、賴氨酸或其鹽、絲氨酸、精氨酸或其鹽、甜菜堿、N，N，- 二甲基-甘氨酸、天冬氨酸或其鹽、谷氨酸或其鹽組成的群組；在生理PH值下具有帶電側基的氨基酸聚合物可選自聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、聚鳥氨酸和其鹽；且膽堿衍生物是選自由氯化膽堿、檸檬酸二氫膽堿、酒石酸氫膽堿、碳酸氫膽堿、檸檬酸三膽堿、抗壞血酸膽堿、硼酸膽堿、葡萄糖酸膽堿、磷酸膽堿、硫酸二(膽堿)和粘液酸二膽堿組成的群組。美國專利第4，876，568號(其是以引用的方式并入本文)指出:可將聚組氨酸用作動物生長激素的潛在穩(wěn)定劑，但尚未指出其使動物生長激素還是人生長激素穩(wěn)定。此外，美國專利第4，876，568號指出優(yōu)選聚-DL-賴氨酸HBr。
[0024]EP374120 (其是以引用的方式并入本文)揭示一種包含包括具有三個羥基的多元醇和緩沖劑的經(jīng)緩沖多元醇賦形劑的穩(wěn)定生長激素制劑，用以達成使生長激素能夠在一段足夠的時間內(nèi)保持其生物活性的PH值范圍。組氨酸被認為是具有三個羥基的多元醇的緩沖劑。具體說來，EP374120教示:可將組氨酸鹽酸鹽用作緩沖劑，以使具有三個羥基的多元醇緩沖，從而改良包含高濃度生長激素和作為穩(wěn)定劑的多元醇的溶液形式的生長激素制劑的穩(wěn)定性。此外,組氨酸鹽酸鹽必須以約3溶液重量％(對應于約0.15M的組氨酸鹽酸鹽溶液濃度)的量加入。EP374120也教示單獨組氨酸將不賦予生長激素制劑以化學和物理穩(wěn)定性。
[0025]Sorensen等人的W093/12812 (其是以引用的方式并入本文)中教示可通過組氨酸或組氨酸衍生物的存在使生長激素穩(wěn)定。如果生長激素經(jīng)凍干，那么所述組合物也可包含膨脹劑，意即糖醇、二醣和其混合物。Sorensen等人的美國專利第5，849，704號(其是以引用的方式并入本文)中揭示一種醫(yī)藥配方，其包含生長激素和作為添加劑或緩沖物質(zhì)加入以于生長激素中提供抗脫酰胺化、抗氧化或抗肽鍵裂解的穩(wěn)定性的組氨酸或組氨酸衍生物。還揭示，在組氨酸或其衍生物存在下使生長激素結晶將產(chǎn)生比已知方法制造的結晶具有更高純度的更高產(chǎn)量結晶 。人生長激素變異體的配方已描述于美國專利第6，136，563號和第5，849，535號中，其是以引用的方式并入本文中。
[0026]hGH通過若干降解路徑經(jīng)歷分解，包括脫酰胺、聚集、肽主鏈剪短和甲硫氨酸殘基氧化。其它產(chǎn)物是由與水溶性聚合物(諸如PEG)共價連接的hGH接合物降解產(chǎn)生。提供可接受的降解產(chǎn)物對照、已使hGH保持穩(wěn)定性一段較長時間段且對于劇烈攪動(其誘導聚集)穩(wěn)定的hGH醫(yī)藥配方將特別有益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027]本發(fā)明提供包含一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的hGH多肽配方。
[0028]在一些實施例中，hGH多肽包含一種或一種以上翻譯后修飾。在一些實施例中，hGH多肽與連接子、聚合物或生物活性分子相連。在一些實施例中，hGH多肽與雙官能聚合物、雙功能連接子或至少一種額外的hGH多肽相連。
[0029]在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸與水溶性聚合物相連。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸以連接子與水溶性聚合物相連或與水溶性聚合物鍵接。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，本發(fā)明為hGH多肽的單劑量凍干配方。在一些實施例中，本發(fā)明為hGH多肽的液體配方。
[0030]在一些實施例中，聚(乙二醇)分子具有介于約0.1kDa與約IOOkDa之間的分子量。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子具有介于約0.1kDa與約50kDa之間的分子量。
[0031]在一些實施例中，聚(乙二醇)分子為分枝狀聚合物。在一些實施例中，聚(乙二醇)分枝狀聚合物的各個分枝具有介于約IkDa與約IOOkDa之間或介于IkDa與50kDa之間的
分子量。
[0032]在一實施例中，包含一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的醫(yī)藥配方包含緩沖劑、至少一種載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑和醫(yī)藥量的人生長激素(hGH)。
[0033]在另一實施例中，所述至少一種載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑是選自由抗氧化劑、氨基酸、碳水化合物、螯合劑、糖醇、成鹽反離子和非離子表面活性劑組成的群組。本發(fā)明還提供以有效量的本發(fā)明的hGH分子配方治療患有由hGH介導的病癥的患者的方法。
[0034]在本發(fā)明的一個實施例中，提供包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽配方，其使不合需要的聚集物質(zhì)的形成減到最少或引起降低生物活性或改變受體識別的化學變化。所述配方能夠保持活性一段適當?shù)膬Υ鏁r間、易于調(diào)配，并且為向患者投與可接受。
[0035]在一實施例中，包括(但不限于)PEG化hGH、包含一種或一種以上非天然編碼的氨基酸的hGH多肽配方為皮下注射使用前復水的凍干配方。本發(fā)明的配方可為醫(yī)藥配方，尤其用于皮下投與的配方。
[0036]在另一實施例中，本發(fā) 明提供一種治療(預防性治療或治療性治療)可通過使用本文所揭示的配方調(diào)配的蛋白質(zhì)(包括但不限于經(jīng)PEG化的hGH)治療的病癥的方法。所述配方尤其可用于皮下投與。
[0037]還提供一種制造物件，其包含密封本文所揭示的配方的容器以及預充式注射器。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1繪示4°C下6周后配方緩沖液的pH值穩(wěn)定性分析。
[0039]圖2繪示Met Y35pAF hGH的SDS-PAGE還原性凝膠(圖2C和圖2D)和非還原性凝膠(圖2A和圖2B)。圖2A和圖2B中的凝膠裝載如下:第I道:MW ;第2道:WH0 hGH ;第3 道:WH0 hGHl% ;第 4 道:A1 ;第 5 道:A2 ;第 6 道:A3 ;第 7 道:A4 ;第 8 道:A5 ;第 9 道-M ；第10道:A7 ;第11道:A8 ;第12道:MW。圖2C和圖2D中的凝膠裝載如下:第I道:MW ;第2道:WH0 hGH ;第 3 道:WH0 hGHl% ;第 4 道:B1 ;第 5 道:B2 ;第 6 道:B3 ;第 7 道:B4 ;第 8 道:B5 ;第9道:B6 ?’第10道:B7 ;第11道:B8 ;第12道:麗。
[0040]圖3A-F繪示配方組A-F的差示掃描量熱法(DSC)的熱概況。
[0041]圖4繪示第B7組(圖4A)和第F2組(圖4B)的基質(zhì)的DSC熱概況。
[0042]圖5提供概括全部基質(zhì)的DSC熔解溫度和Tm改變的表格。
[0043]圖6繪示全部基質(zhì)的DSC熔解溫度的概要。
[0044]圖7繪示對于配方組Λ Hv/ Λ H比率的分析。
[0045]圖8繪示對于各樣本焓(AUC)改變的分析。
[0046]圖9A-D繪示與WHO hGH標準品相比第B組、第C組、第E組和第F組中樣本的RP-HPLC數(shù)據(jù)集。
[0047]圖1OA繪示對于第E5組中不同Y35pAF峰的分析(繪制各時間點處所有峰值的相對百分比以觀察主要MetY35pAF hGH峰的任何改變和所有改變)，且圖1OB繪示初級脫酰胺/氧化峰的急劇上升(放大的脫酰胺峰一脫酰胺作用隨時間變化(t=0至4周)而增加)。RP-HPLC分析是使用Agilent Chemstation軟件執(zhí)行。
[0048]圖11繪示對于橫過基質(zhì)的初級脫酰胺/氧化峰的分析。(對于4°C下4周后MetY35pAF hGH 的分析)
[0049]圖12繪示對于經(jīng)配方組次級脫酰胺/氧化的峰的分析。(對于4°C下4周后MetY35pAF hGH 的分析)
[0050]圖13繪示對于配方組主要GH峰的分析。(對于4°C下4周后Met Y35pAF hGH的分析)
[0051]圖14繪示對于配方組B和C中已經(jīng)歷冷凍-解凍循環(huán)的樣本的初級脫酰胺/氧化的峰的RP-HPLC分析(對于經(jīng)5個冷凍/解凍循環(huán)后Met Y35pAF hGH峰的分析)。
[0052]圖15繪示對于配方組B和C中已經(jīng)歷冷凍-解凍循環(huán)的樣本的次級脫酰胺的峰的RP-HPLC分析(對于經(jīng)5個冷凍/解凍循環(huán)后Met Y35pAF hGH的分析)。
[0053]圖16繪示對于配方組B和C中已經(jīng)歷冷凍-解凍循環(huán)的樣本的主要GH峰的RP-HPLC分析(對于經(jīng)5個冷凍/解凍循環(huán)后Met Y35pAF hGH的分析)。
[0054]圖17繪示RP-HPLC分析的結果。
[0055]圖18繪示SEC-HPLC分析的結果。
[0056]圖19繪示cIEX-HPLC分析的結果。
[0057]圖20繪示SEC-HPLC積分的實例。
[0058]圖21繪示RP-HPLC積分的實例。
[0059]圖22繪示對配方研究(t=0)中對照樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:標記 12 ;第 2 道:Ref.Std ;第 3 道:P6MT ;第 4 道:S4MT ;第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。
[0060]圖23繪示對配方研究(t=0)中對照樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:標記 12 ;第 2 道:Ref.Std ;第 3 道:P6MTMet ;第 4 道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ?’第7道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0061]圖24繪示對配方研究(t=0)中對照樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖24而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖24而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0062]圖25繪示對于在4°C下儲存I周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖25而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ?’第 10 道:P6MS。對于圖25而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ?’第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0063]圖26繪示對于在4°C下儲存I周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖26而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ?’第 10 道:P6MS。對于圖26而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0064]圖27繪示對于在4°C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖27而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ?’第 10 道:P6MS。對于圖27而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。[0065]圖28繪示對于在4°C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖28而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ?’第 10 道:P6MS。對于圖28而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0066]圖29繪示對于在4°C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖29而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖29而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0067]圖30繪示對于在4°C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖30而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ?’第 10 道:P6MS。對于圖30而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ?’第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0068]圖31繪示對于在4°C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MT ;第 4 道:S5MT ;第 5 道:S5GT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ；第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ;第 14 道:P6MT-P ;第 15 道:P6GT_P。
[0069]圖32繪示對于在4°C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MT ;第 4 道:S5MT ;第 5 道:S5GT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ；第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ;第 14 道:P6MT-P ;第 15 道:P6GT_P。
[0070]圖33繪示對于在4°C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ?’第 15 道:P6GT-P0
[0071]圖34繪示對于在4°C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ;第 15 道:P6GT-P0
[0072]圖35繪示對于在4°C下儲存3個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ?’第 15 道:P6GT-P0
[0073]圖36繪示對于在4°C下儲存3個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet* (污染);第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ;第 14 道:P6MT-P ;第 15 道:P6GT_P。
[0074]圖37繪示對于在25°C下儲存I周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖37而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖37而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0075]圖38繪示對于在25°C下儲存I周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖38而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖38而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0076]圖39繪示對于在25°C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖39而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5G`T ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖39而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0077]圖40繪示對于在25°C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖40而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖40而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0078]圖41繪示對于在25°C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖41而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖41而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0079]圖42繪示對于在25°C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖42而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖42而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。[0080]圖43繪示對于在25°C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MT ;第 4 道:S5MT ;第 5 道:S5GT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ；第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ;第 14 道:P6MT-P ;第 15 道:P6GT_P。
[0081]圖44繪示對于在25°C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MT ;第 4 道:S5MT ;第 5 道:S5GT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ；第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ;第 14 道:P6MT-P ;第 15 道:P6GT_P。
[0082]圖45繪示對于在25°C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ?’第 15 道:P6GT-P0
[0083]圖46繪示對于在25°C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ?’第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ?’第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ?’第 15 道:P6GT-P0
[0084]圖47繪示對于在25°C下儲存3個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ?’第 15 道:P6GT-P0
[0085]圖48繪示對于在25°C下儲存3個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ?’第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ?’第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ?’第 15 道:P6GT-P0
[0086]圖49繪示對于在40°C下儲存I周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖49而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖49而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0087]圖50繪示對于在40°C下儲存I周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖50而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖50而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0088]圖51繪示對于在40°C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖51而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖51而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。[0089]圖52繪示對于在40°C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖52而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖52而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0090]圖53繪示對于在40°C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖53而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖53而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0091]圖54繪示對于在40°C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖54而言，圖A第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ；第 5 道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖54而言，圖B第I道:標記12標準品；第2道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT_P ;第 8 道:P6MT_P ;第 9 道:P6GT_P。
[0092]圖55繪示對于在40°C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MT ;第 4 道:S5MT ;第 5 道:S5GT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ；第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ;第 14 道:P6MT-P ;第 15 道:P6GT_P。
[0093]圖56繪示對于在40°C下儲存6周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MT ;第 4 道:S5MT ;第 5 道:S5GT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ；第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ;第 14 道:P6MT-P ;第 15 道:P6GT_P。
[0094]圖57繪示對于在40°C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ;第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ;第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ?’第 15 道:P6GT-P0
[0095]圖58繪示對于在40°C下儲存2個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:hGH (I μ g);第 5 道:P6MT ;第 6 道:H6MT ;第 7 道:P6GT ;第 8 道:P6MS ;第 9 道:P6MTMet ?’第 10 道:P6MT ;第 11 道:P7GT ?’第 12 道:P6MGT ;第 13 道:P6MGT-P ；第 14 道:P6MT-P ?’第 15 道:P6GT-P0
[0096]圖59繪示對于在4°C下儲存I周的復水樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖59而言，圖A第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5道:S5MT ?’第6道:S5GT ;第7道:H6MT ;第8道:P6GT ;第9道:P6MA ;第10道:P6MS。對于圖59而言，圖B第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第5道:P7GT ;第6道:P6MGT ;第7 道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0097]圖60繪示對于在4°C下儲存I周的復水樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖60而言，圖A第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5道:S5MT ?’第6道:S5GT ;第7道:H6MT ;第8道:P6GT ;第9道:P6MA ;第10道:P6MS。對于圖60而言，圖B第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第5道:P7GT ;第6道:P6MGT ;第7 道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0098]圖61繪示對配方研究(攪動/UV對照)中對照樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖61而言，圖A第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5道:S5MT ;第6道:S5GT ;第7道:H6MT ;第8道:P6GT ;第9道:P6MA ;第10道:P6MS。對于圖61而言，圖B 第 I 道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MTMet ;第 4 道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ；第 7 道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0099]圖62繪示對配方研究(攪動/UV對照)中對照樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖62而言，圖A第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5道:S5MT ;第6道:S5GT ;第7道:H6MT ;第8道:P6GT ;第9道:P6MA ;第10道:P6MS。對于圖62而言，圖B 第 I 道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MTMet ;第 4 道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ；第 7 道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0100]圖63繪示對于在環(huán)境溫度下攪動4小時的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖63而言，圖A第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5道:S5MT ;第6道:S5GT ;第7道:H6MT ;第8道:P6GT ;第9道:P6MA ;第10道:P6MS。對于圖63而言，圖B 第 I 道:PEG-hGH 標準品；第 3 道:P6MTMet ;第 4 道:P7MT ;第 5 道:P7GT ;第 6 道:P6MGT ；第 7 道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0101]圖64繪示對于在環(huán)境溫度下攪動4小時的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖64而言，圖A第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5道:S5MT ?’第6道:S5GT ;第7道:H6MT ;第8道:P6GT ;第9道:P6MA ;第10道:P6MS。對于圖64而言，圖B第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第5道:P7GT ;第6道:P6MGT ;第7 道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0102]圖65繪示對于在環(huán)境溫 度下曝露至UV光4小時的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。對于圖65而言，圖A第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ?’第 10 道:P6MS。對于圖 65而言，圖B第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第5道:P7GT ;第6道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0103]圖66繪不對于在環(huán)境溫度下曝露至UV光4小時的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。對于圖66而言，圖A第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MT ;第4道:S4MT ;第5道:S5MT ;第 6 道:S5GT ;第 7 道:H6MT ;第 8 道:P6GT ;第 9 道:P6MA ;第 10 道:P6MS。對于圖 66而言，圖B第I道:PEG-hGH標準品；第3道:P6MTMet ;第4道:P7MT ;第5道:P7GT ;第6道:P6MGT ;第 7 道:P6MGT-P ;第 8 道:P6MT-P ;第 9 道:P6GT_P。
[0104]圖67繪示對于經(jīng)歷冷凍/解凍條件的樣本(H7MT-P)的SDS-PAGE分析(非還原性)。第 I 道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 3 道:H7MT_P8mg/mL t=0 ;第 4 道:H7MT-P8mg/mL F/Tl ;第 5 道:H7MT-P8mg/mL F/T2 ;第 6 道:H7MT-P8mg/mL F/T3 ;第 7 道:H7MT-P8mg/mL F/T4 ;第 8 道:H7MT-P8mg/mL F/T5 ?’第 10 道:H7MT-P14mg/mL t=0 ;第 11 道:H7MT-P14mg/mL F/Tl ;第 12 道:H7MT-P14mg/mL F/T2 ;第 13 道:H7MT-P14mg/mL F/T3 ;第 14道:H7MT-P14mg/mL F/T4 ;第 15 道:H7MT-P14mg/mL F/T5。
[0105]圖68繪示對于經(jīng)歷冷凍/解凍條件的樣本(H7MT-P )的SDS-PAGE分析(還原性)。第 I 道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 3 道:H7MT_P8mg/mL t=0 ;第 4 道:H7MT-P8mg/mL F/Tl ;第 5 道:H7MT-P8mg/mL F/T2 ;第 6 道:H7MT-P8mg/mL F/T3 ;第 7 道:H7MT-P8mg/mL F/T4 ;第 8 道:H7MT-P8mg/mL F/T5 ?’第 10 道:H7MT-P14mg/mL t=0 ;第 11 道:H7MT-P14mg/mL F/Tl ;第 12 道:H7MT-P14mg/mL F/T2 ;第 13 道:H7MT-P14mg/mL F/T3 ;第 14道:H7MT-P14mg/mL F/T4 ;第 15 道:H7MT-P14mg/mL F/T5。
[0106]圖69繪示對于經(jīng)歷冷凍/解凍條件的樣本(H7MGT-P)的SDS-PAGE分析(非還原性)。第 I 道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 3 道:H7MGT_P8mg/mL t=0 ;第 4 道:H7MGT-P8mg/mL F/T1 ;第5 道:H7MGT-P8mg/mL F/T2 ;第6道:H7MGT-P8mg/mL F/T3 ;第7道:H7MGT-P8mg/mL F/T4 ;第 8 道:H7MGT-P8mg/mL F/T5 ;第 10 道:H7MGT-P14mg/mL t=0 ;第 11道:H7MGT-P14mg/mL F/T1 ;第 12 道:H7MGT-P14mg/mL F/T2 ;第 13 道:H7MGT-P14mg/mL F/T3 ;第 14 道:H7MGT-P14mg/mL F/T4 ;第 15 道:H7MGT-P14mg/mL F/T5。
[0107]圖70繪示對于經(jīng)歷冷凍/解凍條件的樣本(H7MGT-P )的SDS-PAGE分析(還原性)。第 I 道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 3 道:H7MGT_P8mg/mL t=0 ;第 4 道:H7MGT-P8mg/mL F/T1 ;第5 道:H7MGT-P8mg/mL F/T2 ;第6道:H7MGT-P8mg/mL F/T3 ;第7道:H7MGT-P8mg/mL F/T4 ;第 8 道:H7MGT-P8mg/mL F/T5 ;第 10 道:H7MGT-P14mg/mL t=0 ;第 11道:H7MGT-P14mg/mL F/T1 ;第 12 道:H7MGT-P14mg/mL F/T2 ;第 13 道:H7MGT-P14mg/mL F/T3 ;第 14 道:H7MGT-P14mg/mL F/T4 ;第 15 道:H7MGT-P14mg/mL F/T5。
[0108]圖71繪示對于對照樣本和經(jīng)歷攪動6小時和UV光4小時的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH標準品；第2道:hGH(l μ g);第4道:渦旋/UV對照H7MT_P8mg/mL ;第 5 道:渦旋 /UV 對照 H7MT-P14mg/mL ;第 6 道:渦旋 /UV 對照 H7MGT_P8mg/mL ;第 7 道:渦旋 /UV 對照 H7MGT-P14mg/mL ;第 8 道:渦旋 H7MT_P8mg/mL ;第 9 道:渦旋 H7MT_P14mg/mL ；第 10 道:渦旋 H7MGT-P8mg/mL ;第 11 道:渦旋 H7MGT_P14mg/mL ;第 12 道:UV H7MT_P8mg/mL ;第 13 道:UV H7MT-P14mg/mL ;第 14 道:UV H7MGT_P8mg/mL ;第 15 道:UV H7MGT_P14mg/mL0`[0109]圖72繪示對于對照樣本和經(jīng)歷攪動6小時和UV光4小時的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH標準品；第2道:hGH( I μ g);第4道:渦旋/UV對照H7MT_P8mg/mL ;第 5 道:渦旋 /UV 對照 H7MT-P14mg/mL ;第 6 道:渦旋 /UV 對照 H7MGT_P8mg/mL ;第 7 道:渦旋 /UV 對照 H7MGT-P14mg/mL ;第 8 道:渦旋 H7MT_P8mg/mL ;第 9 道:渦旋 H7MT_P14mg/mL ;第 10 道:渦旋 H7MGT-P8mg/mL* (已污染)；第 11 道:渦旋 H7MGT_P14mg/mL ;第 12 道:UV H7MT-P8mg/mL ;第 13 道:UV H7MT-P14mg/mL ;第 14 道:UV H7MGT-P8mg/mL ;第 15 道:UVH7MGT-P14mg/mL。
[0110]圖73繪示對于在4°C或40°C下儲存I周的樣本和暴露至熱伸展條件的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH標準品；第2道:hGH (I μ g);第4道:H7MT-P8mg/mL4 °C ;第 5 道:H7MT-P14mg/mL4 °C ;第 6 道:H7MGT-P8mg/mL4 °C ;第 7 道:H7MGT-P14mg/mL4°C ;第 8 道:H7MT-P8mg/mL4(TC ;第 9 道:H7MT-P14mg/mL4(TC ;第 10 道:H7MGT-P8mg/mL40 °C ;第 11 道:H7MGT-P14mg/mL40 °C ;第 12 道:H7MT-P8mg/mL 熱伸展條件?’第13道:H7MT-P14mg/mL熱伸展條件；第14道:H7MGT-P8mg/mL熱伸展條件；第15道:H7MGT-P14mg/mL熱伸展條件。
[0111]圖74繪示對于在4°C或40°C下儲存I周的樣本和暴露至熱伸展條件的樣本的SDS-PAGE 分析(還原性)。第 I 道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH( I μ g);第 4 道:H7MT-P8mg/mL4°C ;第 5 道:H7MT-P14mg/mL4°C ;第 6 道:H7MGT-P8mg/mL4°C ;第 7 道:H7MGT-P14mg/mL4°C ；第 8 道:H7MT-P8mg/mL40°C ;第 9 道:H7MT-P14mg/mL40°C ;第 10 道:H7MGT-P8mg/mL40°C ?’第11 道:H7MGT-P14mg/mL40°C;第 12 道:H7MT-P8mg/mL 熱伸展條件?’第 13 道:H7MT-P14mg/mL熱伸展條件；第14道:H7MGT-P8mg/mL熱伸展條件；第15道:H7MGT_P14mg/mL熱伸展條件。
[0112]圖75繪示對于在4°C或40°C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品;第 2 道:hGH (I μ g);第 3 道:H7MT-P8mg/mL4°C ;第 4 道:H7MT-P14mg/mL4°C ;第 5 道:H7MGT-P8mg/mL4°C ;第 6 道:H7MGT-P14mg/mL4°C ;第 7 道:H7MT-P8mg/mL40°C ；第 8 道:H7MT-P14mg/mL40°C ;第 9 道:H7MGT-P8mg/mL40°C ;第 10 道:H7MGT-P14mg/mL40°C。
[0113]圖76繪示對于在4°C或40°C下儲存2周的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 3 道:H7MT-P8mg/mL4°C ;第 4 道:H7MT-P14mg/mL4°C ;第 5 道:H7MGT-P8mg/mL4°C ;第 6 道:H7MGT-P14mg/mL4°C ;第 7 道:H7MT-P8mg/mL40°C ；第 8 道:H7MT-P14mg/mL40°C ;第 9 道:H7MGT-P8mg/mL40°C ;第 10 道:H7MGT-P14mg/mL40°C。
[0114]圖77繪示對于在4°C下儲存4個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 4 道:P6MT ;第 5 道:H6MT ;第 6 道:P6GT ;第 7 道:P6MS ;第 8 道:P6MTMet ;第 9 道:P6MT ;第 10 道:P7GT ;第 11 道:P6MGT ;第 12 道:P6MGT_P ；第 13 道:P6MT-P ?’第 14 道:P6GT-P0
[0115]圖78繪示對于在4°C下儲存4個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 4 道:P6MT ;第 5 道:H6MT ;第 6 道:P6GT ;第 7 道:P6MS ;第 8 道:P6MTMet ;第 9 道:P6MT ;第 10 道:P7GT ;第 11 道:P6MGT ;第 12 道:P6MGT_P ；第 13 道:P6MT-P ;第 14 道:P6GT-P0
[0116]圖79繪示對于在 25°C下儲存4個月的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 3 道:P6MT ;第 4 道:H6MT ;第 5 道:P6GT ;第 6 道:P6MS ;第 7 道:P6MTMet ;第 8 道:P6MT ;第 9 道:P7GT ;第 10 道:P6MGT ;第 11 道:P6MGT_P ；第 12 道:P6MT-P ;第 13 道:P6GT-P0
[0117]圖80繪示對于在25°C下儲存4個月的樣本的SDS-PAGE分析(還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH (I μ g);第 3 道:P6MT ;第 4 道:H6MT ;第 5 道:P6GT ;第 6 道:P6MS ;第 7 道:P6MTMet ;第 8 道:P6MT ;第 9 道:P7GT ;第 10 道:P6MGT ;第 11 道:P6MGT_P ；第 12 道:P6MT-P ;第 13 道:P6GT-P0
[0118]圖81繪示對于在4°C或40°C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH(0.5 μ g);第 3 道:H7MT-P8mg/mL4°C ;第 4 道:H7MT-P14mg/mL4°C ;第 5 道:H7MGT-P8mg/mL4°C ;第 6 道:H7MGT-P14mg/mL4°C ;第 7 道:H7MT-P8mg/mL40°C ；第 8 道:H7MT-P14mg/mL40°C ;第 9 道:H7MGT-P8mg/mL40°C ;第 10 道:H7MGT-P14mg/mL40°C。
[0119]圖82繪示對于在4°C或40°C下儲存4周的樣本的SDS-PAGE分析(非還原性)。第I道:PEG-hGH 標準品；第 2 道:hGH(0.5 μ g);第 3 道:H7MT-P8mg/mL4°C ;第 4 道:H7MT-P14mg/mL4°C ;第 5 道:H7MGT-P8mg/mL4°C ;第 6 道:H7MGT-P14mg/mL4°C ;第 7 道:H7MT-P8mg/mL40°C ；第 8 道:H7MT-P14mg/mL40°C ;第 9 道:H7MGT-P8mg/mL40°C ;第 10 道:H7MGT-P14mg/mL40°C。
[0120]圖83繪示對于樣本的SDS-PAGE分析。第I道:PEG_hGH標準品(第2批);第2道:hGH (I μ g);第 4 道:39.9mg/mL 非還原性；第 5 道:24.3mg/mL 非還原性;第 6 道:1.lmg/mL非還原性;第8道:39.9mg/mL還原性；第9道:24.3mg/mL還原性;第10道:1.lmg/mL還原性。
【具體實施方式】
[0121]定義[0122]應了解，本發(fā)明不限于本文所述的特定方法、方案、細胞系、構筑體和試劑且因此其可變化。還應了解，本文所使用的術語僅出于描述特定實施例的目的，且不意欲限制將僅受隨附權利要求書限制的本發(fā)明的范疇。
[0123]除非本文中另作清楚指示，否則如本文和隨附權利要求中所使用的單數(shù)形式“一”和“所述”包括復數(shù)個參考物。因此，例如提及一種“hGH”是對一種或一種以上所述蛋白質(zhì)的參考，且包括所屬領域技術人員已知的所述蛋白質(zhì)的等效物等。
[0124]除非另作定義，否則本文所使用的所有科技術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員通常所了解的含義相同的含義。盡管可使用與本文所述者相似或相同的任何方法、裝置和材料實施或測試本發(fā)明，但現(xiàn)描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0125]本文所提及的所有公開案和專利都是以引用的方式并入本文中以達到描述和揭示(例如)所述公開案中所述的可能與本發(fā)明結合使用的構筑體和方法的目的。本文所討論的公開案僅提供本申請案 申請日期:之前的揭示內(nèi)容。本文在任何方面都不應解釋為承認本
【發(fā)明者】無權由于現(xiàn)有發(fā)明或任何其他原因使所述揭示案的日期提前。
[0126]美國專利申請案第11/046，432號是以其全文引用的方式并入本文。因此，美國專利申請案第11/046,432號中標號為79-153的段落中所提供的揭示內(nèi)容完全適用于制造、純化、表征和使用本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸hGH多肽和經(jīng)修飾的非天然氨基酸hGH多肽的方法、組合物、技術和策略，所述適用的程度就如同這里揭示內(nèi)容完全是本發(fā)明所提供的一樣。
[0127]如本文所使用的“生長激素”或“GH”應包括那些具有人生長激素的至少一種生物活性的多肽和蛋白質(zhì)，以及GH類似物、GH同功異型物、GH模擬物、GH片段、雜交GH蛋白、融合蛋白、寡聚體和多聚體、其同源物、糖基化模式變異體、變異體、剪接變異體和突變蛋白質(zhì)，不管是否具有相同生物活性且也不管其合成或制造方法如何；所述合成或制造方法包括(但不限于)重組方法(由cDNA、基因組DNA、合成DNA或其它形式的核酸制造)、活體外方法、活體內(nèi)方法、通過微注射核酸分子方法、合成法、轉基因法和基因活化方法。術語“hGH多肽”涵蓋包含一種或一種以上氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。
[0128]有關完整的天然存在的全長GH氨基酸序列以及成熟的天然存在的GH氨基酸序列和天然存在的突變體的內(nèi)容，分別參看美國專利申請案第11/046，432號中的SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:3，所述專利是以引用的方式并入本文中。在一些實施例中，本發(fā)明的hGH多肽與生長激素多肽的這些序列或任何其它序列實質(zhì)相同。
[0129]術語“hGH多肽”還包括醫(yī)藥學上可接受的鹽和前藥，和所述鹽的前藥、天然存在的hGH的多晶型物、水合物、溶劑合物、生物活性片段、生物活性變異體和立體異構體，以及天然存在的hGH的激動劑、模擬物和拮抗劑變異體和其多肽融合物。術語“hGH多肽”涵蓋在氨基端、羧基端或二者處包含額外氨基酸的融合物。示范性融合物包括(但不限于)例如甲硫氨酰基生長激素，其中甲硫氨酸因重組表達而與hGH的N末端相連；用于純化的目的的融合物(包括但不限于，聚組氨酸或親和性表位)；具有血清白蛋白結合肽的融合物；和具有血清蛋白(諸如血清白蛋白)的融合物。美國專利第5，750，373號(以引用的方式并入本文中)描述一種用于選擇新穎蛋白質(zhì)(諸如生長激素和對于個別受體分子具有已改變的結合特性的抗體片段變異體)的方法。所述方法包含將編碼所需蛋白質(zhì)的基因與絲狀噬菌體M13的基因III外殼蛋白的羧基端結構域融合。
[0130]多個參考文獻都已揭示通過聚合物接合或糖基化來修飾多肽。術語“hGH多肽”包括與諸如PEG的聚合物接合的多肽，且可包含半胱氨酸、賴氨酸或其它殘基的一種或一種以上額外衍生作用。此外，hGH多肽可包含連接子或聚合物，其中與所述連接子或聚合物接合的氨基酸可為根據(jù)本發(fā)明的非天然氨基酸，或可利用此項技術中已知的技術(諸如與賴氨酸或半胱氨酸偶合)使其與天然編碼的氨基酸接合。
[0131]已報導hGH多肽的聚合物接合。例如參看美國專利第5，849，535號、第6，136, 563號和第6，608，183號，所述專利是以引用的方式并入本文中。美國專利第4，904，584號揭示耗盡PEG化賴氨酸的多肽,其中至少一個賴氨酸殘基已缺失或經(jīng)任何其它氨基酸殘基置換。W099/67291揭示一種用于使蛋白質(zhì)與PEG接合的工藝，其中所述蛋白質(zhì)上至少一個氨基酸殘基已缺失，并且所述蛋白質(zhì)是在足以達成與所述蛋白質(zhì)接合的條件下與PEG接觸。W099/03887揭示屬于生長激素總科的PEG化多肽變異體，其中半胱氨酸殘基已經(jīng)位于所述多肽指定區(qū)域中的非基本氨基酸殘基取代。W000/26354揭示一種制造具有降低的致過敏性的糖基化多肽變異體的方法，與相應的母體多肽相比，所述多肽變異體包含至少一個額外的糖基化位點。美國專利第5，218，092號(其是以引用的方式并入本文中)揭示對粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽進行修飾從而當與天然多肽相比時引入至少一個額外的碳水化合物鏈。
[0132]術語“hGH多肽”還包括糖基化hGH，諸如但不限于，在任何氨基酸位置處經(jīng)糖基化的多肽、N連接或O連接糖基化形式的多肽。也可將含有單核苷酸改變的變異體看作hGH多肽的生物活性變異體。此外，還包括剪接變異體。術語“hGH多肽”還包括通過化學方式連接或以融合蛋白形式表達的任一種或一種以上hGH多肽或任何其它多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、聚合物、小分子、連接子、配位體或任何類型的其它生物活性分子的hGH多肽雜二聚體、均二聚體、雜多聚體或均多聚體，以及例如含有特定缺失或其它修飾但仍保持生物活性的多肽類似物。
[0133]除非另作特定說明(意即，當聲明所述比較是基于諸如SEQ ID N0:l、3的另一hGH序列時)，否則有關本文所述的hGH中氨基酸位置的所有相關內(nèi)容都是基于如標題為“Modifed Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses” 的美國專利申請案第11/046,432號中所列的SEQ ID NO:2中的位置，所述專利是以引用的方式并入本文中。所屬領域技術人員將了解，與美國專利申請案第11/046，432號(其是以引用的方式并入本文中)中所列的SEQ ID NO: 1、2、3或任何其它GH序列中的位置對應的氨基酸位置可易于以諸如hGH融合物、變異體、片段等的任何其它hGH分子鑒別。舉例而言，可使用諸如BLAST的序列比對程序比對并鑒別蛋白質(zhì)中與美國專利申請案第11/046，432號(其是以引用的方式并入本文中)的SEQ ID NO: 1、2、3或其它GH序列中的位置對應的特定位置。預期本文所述的關于美國專利申請案第11/046，432號(其是以引用的方式并入本文中)中的SEQ IDNO: 1、2、3或其它GH序列中的氨基酸的取代、缺失或添加還指在本文所述或此項技術中已知的諸如hGH融合物、變異體、片段等的任何其它hGH分子中的相應位置處進行的取代、缺失或添加，且都明顯地涵蓋于本發(fā)明中。
[0134]術語“hGH多肽”或“hGH”涵蓋包含一種或一種以上氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。本發(fā)明的hGH多肽可包含一種或一種以上天然氨基酸的修飾與一種或一種以上非天然氨基酸修飾的組合。已對天然存在的hGH多肽中多個氨基酸位置中的示范性取代進行描述，包括(但不限于)調(diào)節(jié)hGH多肽的一種或一種以上生物活性的取代，所述活性的調(diào)節(jié)諸如(但不限于)增加激動劑活性、增加多肽溶解性、降低蛋白酶易感性、將所述多肽轉化成拮抗劑等，且其都涵蓋于術語“hGH多肽”中。
[0135]在一些實施例中，hGH多肽另外包含調(diào)節(jié)hGH多肽的生物活性的添加、取代或缺失。舉例而言，所述添加、取代或缺失可調(diào)節(jié)hGH的一種或一種以上特性或活性。舉例而言，所述添加、取代或缺失可調(diào)節(jié)對hGH多肽受體的親和性、調(diào)節(jié)(包括但不限于，增加或降低)受體二聚作用、使受體二聚體穩(wěn)定、調(diào)節(jié)循環(huán)半衰期、調(diào)節(jié)治療半衰期、調(diào)節(jié)多肽穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)蛋白酶的裂解、調(diào)節(jié)劑量、調(diào)節(jié)釋放或生物利用度、便利純化或改良或改變特定投藥路徑。類似地，hGH多肽可包含蛋白酶裂解序列、分泌信號序列、反應性基團、抗體結合域(包括但不限于，F(xiàn)LAG或聚His)或其它基于親和性的序列(包括但不限于，F(xiàn)LAG、聚His、GST等)或改良對于多肽的檢測(包括但不限于，GFP)、純化或其它特質(zhì)的連接分子(包括但不限于，生物素)。
[0136]術語“hGH多肽”還涵蓋均二聚體、雜二聚體、均多聚體和雜多聚體，其與相同或不同非天然編碼的氨基酸側鏈、天然編碼的氨基酸側鏈連接，包括(但不限于)通過非天然編碼的氨基酸側鏈直接連接或通過連接子間接連接。示范性連接子包括(但不限于)小有機化合物；各種長度的水溶性聚合物，諸如聚(乙二醇)或葡聚糖；或各種長度的多肽。
[0137]“非天然編碼的氨基酸”是指不為20種常見氨基酸中的任一種或吡咯賴氨酸或硒半胱氨酸的氨基酸?？梢耘c術語 “非天然編碼的氨基酸”相同意義使用的其它術語為“非天然氨基酸(“non-natural amino acid”、“unnatural amino acid”)”、“非天然存在的氨基酸”和其各種以連字符連接和不以連字符連接的型式。術語“非天然編碼的氨基酸”還包括(但不限于)通過對天然編碼的氨基酸(包括但不限于，20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸)進行修飾(例如，翻譯后修飾)而產(chǎn)生但其本身未通過翻譯復合物天然并入到生長多肽鏈中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的實例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-蘇氨酸和O-磷酸酪氨酸。
[0138]“氨基端的修飾基團”是指可連接到多肽氨基端的任何分子。類似地，“羧基端的修飾基團”是指可連接到多肽羧基端的任何分子。末端修飾基團包括(但不限于)各種水溶性聚合物、肽或蛋白質(zhì)(諸如血清白蛋白)或增加肽的血清半衰期的其它部分。
[0139]此項技術中和本文中使用術語“官能團”、“活性部分”、“活化基團”、“離去基團”、“反應位點”、“化學反應性基團”和“化學反應性部分”是指分子中截然不同、可定義的部分或單元。所述術語在某種程度上與化學技術中的含義同義，且用于在本文中表明分子中執(zhí)行某種功能或活性并與其它分子反應的部分。
[0140]本文中使用術語“鍵”或“連接子”是指通常由化學反應形成且通常為共價鍵的基團或鍵結。水解穩(wěn)定的鍵意思是在水中實質(zhì)穩(wěn)定且在有用PH值下(包括但不限于，在生理學條件下)于一段較長時間段內(nèi) 、可能甚至無限期不與水反應的鍵。水解不穩(wěn)定或可降解的鍵意思是在水中或水溶液(例如包括血液)中可降解的鍵。酶解不穩(wěn)定或可降解鍵意思是可經(jīng)一種或一種以上酶降解的鍵。如此項技術中所了解，PEG和相關聚合物可在聚合物主鏈中或聚合物主鏈與聚合物分子的一個或一個以上末端官能團之間的連接基團中包括可降解鍵。舉例而言，由PEG羧酸或活性PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應所形成的酯鍵一般在生理學條件下水解釋放所述試劑。其它水解可降解鍵包括(但不限于)碳酸酯鍵；由胺與醛反應產(chǎn)生的亞胺鍵；由醇與磷酸基反應形成的磷酸酯鍵；作為酰肼與醛的反應產(chǎn)物的腙鍵；作為醛與醇的反應產(chǎn)物的縮醛鍵；作為甲酸與醇的反應產(chǎn)物的原酸酯鍵；由包括(但不限于)聚合物(諸如PEG)末端處的胺基與肽的羧基形成的肽鍵；和由包括(但不限于)聚合物末端的亞磷酰胺基與寡核苷酸的5’羥基所形成的寡核苷酸鍵。
[0141]當用于本文中時，術語“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性劑”意思是可影響與有機體相關的生物系統(tǒng)、路徑、分子或相互作用的任何物理或生化特性的任何物質(zhì)，所述有機體包括(但不限于)病毒、細菌、噬菌體、轉座子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物和人類。具體說來，如本文所使用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于診斷、治愈、減輕、治療或預防人類或其他動物的疾病或另外增強人類或動物的身體或精神的良好狀態(tài)的任何物質(zhì)。生物活性分子的實例包括(但不限于)肽、蛋白質(zhì)、酶、小分子藥物、硬性藥物(hard drug)、軟性藥物、碳水化合物、無機原子或分子、染料、脂質(zhì)、核苷、放射性核、寡核苷酸、毒素、細胞、病毒、脂質(zhì)體、微粒和膠粒。適用于本發(fā)明中的生物活性劑的種類包括(但不限于)藥物、前藥、放射性核、顯影劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎劑、抗腫瘤劑、心血管藥、抗焦慮劑、激素、生長因子、類固醇藥、微生物來源的毒素和其類似物。
[0142]“雙官能聚合物”是指包含兩種離散官能團的聚合物，其能夠與其它部分(包括但不限于，氨基酸側基)特異性反應形成共價或非共價鍵?？墒褂靡粋€官能團與特定生物活性組份上的基團反應且另一基團與第二生物組份上的基團反應的雙功能連接子形成一種接合物，其包括第一生物活性組份、雙功能連接子和第二生物活性組份。已知用于使各種化合物與肽連接的多種程序和連接子分子。例如參看歐洲專利申請案第188，256號；美國專利第 4，671，958 號、第 4，659，839 號、第 4，414，148 號、第 4，699，784 號、第 4，680，338 號和第4，569，789號，所述專利是`以引用的方式并入本文中?！岸喙倌芫酆衔铩笔侵赴瑑煞N或兩種以上離散官能團的聚合物，其能夠與其它部分(包括但不限于，氨基酸側基)特異性反應形成共價或非共價鍵。雙官能聚合物或多官能聚合物可為任何所需長度或分子量，且可經(jīng)選擇以于一種或一種以上與GH連接的分子(例如，hGH分子)之間提供特定所需間隔或構象。
[0143]如本文所使用的術語“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶劑中的任何聚合物。水溶性聚合物與hGH多肽的鍵可相對于未經(jīng)修飾形式導致以下改變:包括(但不限于)血清半衰期增加或經(jīng)調(diào)節(jié)；或治療半衰期增加或經(jīng)調(diào)節(jié)；免疫原性經(jīng)調(diào)節(jié)；實體相關特性經(jīng)調(diào)節(jié)，諸如聚集和多聚體形成；受體結合改變；和受體二聚化或多聚化改變。水溶性聚合物可或可不具有其自身的生物活性。適當聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(美國專利第5，252，714號中描述，其是以引用的方式并入本文中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚順丁烯二酸酐、N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多醣、寡醣、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包括但不限于甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇共聚物和其衍生物、聚乙烯基乙醚和α-β-聚[(2-羥乙基)]_DL-天冬酰胺和其類似物，或其混合物。所述水溶性聚合物的實例包括(但不限于)聚
乙二醇和血清白蛋白。
[0144]如本文所使用的術語“聚烷二醇”或“聚(烷二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。術語“聚烷二醇”涵蓋線性與分枝聚合物且平均分子量介于0.1kDa與IOOkDa之間。舉例而言，其它示范性實施例列于商業(yè)供應商目錄中，諸如Shearwater Corporation 目錄“Polyethylene Glycol and Derivatives for BiomedicalApplications，，(2001)中。
[0145]如本文所使用的術語“經(jīng)調(diào)節(jié)的血清半衰期”意思是經(jīng)修飾hGH的循環(huán)半衰期相對于其未經(jīng)修飾形式的正或負改變。血清半衰期是通過在投與hGH后于各種時間點時取得血液樣本且測定各樣本中所述分子的濃度來進行測量。血清濃度與時間的相關性使得能夠計算血清半衰期。血清半衰期合意地增加至少約兩倍，但較小增加可例如在其允許令人滿意的給藥方案或避免有毒作用的情況下有益。在一些實施例中，所述增加為至少約三倍、至少約五倍或至少約十倍。
[0146]如本文所使用的術語“經(jīng)調(diào)節(jié)的治療半衰期”意思是治療有效量的hGH的半衰期相對于其未經(jīng)修飾形式的正或負改變。治療半衰期是通過投藥后在各種時間點時測量所述分子的藥代動力學和/或藥效特性來進行測量。治療半衰期增加合意地允許特別有益的給藥方案、特別有益的總劑量或避免不合需要的作用。在一些實施例中，治療半衰期增加是由效力增加、經(jīng)修飾分子與其目標的結合增加或減少、酶(諸如蛋白酶)對所述分子分解的增加或減少或未經(jīng)修飾分子的另一參數(shù)或作用機制的增加或減少引起。
[0147]術語“實質(zhì)純”是 指可實質(zhì)或基本無通常伴有見于天然存在的環(huán)境(意即，天然細胞或在重組產(chǎn)生hGH多肽的情況下的宿主細胞)中的蛋白質(zhì)或與其相互作用的組份的hGH多肽?？蓪嵸|(zhì)無細胞材料的hGH多肽包括(以干重計)具有小于約30%、小于約25%、小于約20%、小于約15%、小于約10%、小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%或小于約1%污染蛋白的蛋白質(zhì)制劑。當通過宿主細胞重組產(chǎn)生hGH多肽或其變異體時，所述蛋白質(zhì)可以占細胞干重約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%或更低的量存在。當通過宿主細胞重組產(chǎn)生hGH多肽或其變異體時，所述蛋白質(zhì)可以約5g/L、約4g/L、約 3g/L、約 2g/L、約 lg/L、約 750mg/L、約 500mg/L、約 250mg/L、約 100mg/L、約 50mg/L、約10mg/L或約lmg/L或更低細胞干重存在于培養(yǎng)基中。因此，當通過諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細管電泳的適當方法測定時，如通過本發(fā)明的方法所制造的“實質(zhì)純"hGH多肽可具有至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度水平，尤其至少約75%、80%、85%的純度水平且更尤其至少約90%的純度水平、至少約95%的純度水平、至少約99%或更高的純度水平。
[0148]當用于核酸或蛋白質(zhì)時，術語“經(jīng)分離”表示所述核酸或蛋白質(zhì)無至少某些與其天然狀態(tài)相關的細胞組份，或已將所述核酸或蛋白質(zhì)濃縮到大于其在活體內(nèi)或活體外制造時的濃度的程度。其可為均質(zhì)態(tài)。經(jīng)分離的物質(zhì)可為干燥或半干燥狀態(tài)；或在溶液中，包括(但不限于)水溶液。其可為包含其它醫(yī)藥學上可接受的載劑和/或賦形劑的醫(yī)藥組合物的組份。純度和均質(zhì)性通常是使用分析化學技術(諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜)測定。作為制劑中存在的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)實質(zhì)經(jīng)純化。特別說來，使經(jīng)分離基因與側接到所述基因且編碼除所需基因外的蛋白質(zhì)的開放式閱讀框分離。術語“經(jīng)純化”表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中實質(zhì)產(chǎn)生出一條譜帶。具體說來，意思可為所述核酸或蛋白質(zhì)為至少85%純、至少90%純、至少95%純、至少99%純或更高純度。
[0149]如本文所使用的術語“受檢者”是指作為治療、觀察或?qū)嶒災繕说膭游铮谝恍嵤├袨椴溉閯游?，且在其它實施例中為人類?br> [0150]如本文所使用的術語“有效量”是指所投與的經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的量，其將在一定程度上緩解所治療的疾病、病況或病癥的一種或一種以上癥狀?？赏杜c含有本文所述的經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物以達到預防、增強和/或治療性治療的目的。
[0151]術語“增強”意思是增加或延長所需作用的效力或持續(xù)時間。因此，就增強治療劑的作用而言，術語“增強”是指增加或延長其它治療劑對系統(tǒng)的作用的效力或持續(xù)時間的能力。如本文所使用的“增強有效性的量”是指適于增強所需系統(tǒng)中另一治療劑的作用的量。當用于患者時，有效用于此用途的量將視疾病、病癥或病況的嚴重程度和病程、先前療法、患者的健康狀況和對藥物的反應和治療醫(yī)師的判斷而定。 [0152]如本文所使用的術語“經(jīng)修飾”是指對指定多肽所作的任何改變，諸如對多肽長度、多肽的氨基酸序列、化學結構、共翻譯修飾或翻譯后修飾的改變?！?經(jīng)修飾)”形式的術語意思是所討論的多肽視情況經(jīng)修飾，也就是說，所討論的多肽可經(jīng)修飾或不經(jīng)修飾。
[0153]術語“翻譯后經(jīng)修飾”是指已并入多肽鏈后對天然氨基酸或非天然氨基酸進行的可發(fā)生于所述氨基酸的任何修飾。舉例而言，所述術語涵蓋共翻譯活體內(nèi)修飾、共翻譯活體外修飾(諸如無細胞翻譯系統(tǒng))、翻譯后活體內(nèi)修飾和翻譯后活體外修飾。
[0154]在預防性應用中，將含有經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物投與易受特定疾病、病癥或病況影響或另外有患特定疾病、病癥或病況風險的患者。所述量定義為“預防有效量”。在此使用中，確切量也視患者的健康狀態(tài)、體重和其類似情況而定。認為所屬領域技術人員將能夠通過常規(guī)實驗(例如，劑量遞增臨床實驗)確定所述預防有效量。
[0155]在預防性應用中，將含有經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物以足以治愈或至少部分抑制所述疾病、病癥或病況的癥狀的量投與已摧患疾病、病癥或病況的患者。所述量定義為“治療有效量”，且將視疾病、病癥或病況的嚴重程度和病程、先前療法、患者的健康狀況和對藥物的反應和治療醫(yī)師的判斷而定。認為所屬領域技術人員將能夠通過常規(guī)實驗(例如，劑量遞增臨床實驗)確定所述治療有效量。
[0156]術語“治療”用于指預防和/或治療性治療。
[0157]當投與需要產(chǎn)生代謝物的有機體時，可代謝非天然編碼的氨基酸多肽，隨后用于產(chǎn)生所需作用，包括所需治療作用。除非另作說明，否則使用此項技術中眾所周知的常規(guī)方法:質(zhì)譜法、NMR、HPLC、蛋白質(zhì)化學、生物化學、重組DNA技術和藥理學。
[0158]實施方式
[0159]1.引言
[0160]本發(fā)明提供包含至少一個非天然氨基酸的hGH分子。在本發(fā)明的某些實施例中，具有至少一個非天然氨基酸的hGH多肽包括至少一種翻譯后修飾。在一實施例中，所述至少一種翻譯后修飾包含利用所屬領域技術人員已知的適于特定反應性基團的化學方法使包含第二反應性基團的分子與至少一個包含第一反應性基團的非天然氨基酸連接，所述分子包括(但不限于)標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯(lián)劑、放射性核、細胞毒性化合物、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、糖類、水溶性樹枝狀高分子、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米顆粒、自旋標記、熒光團、含金屬部分、放射性部分、新穎官能團、與其它分子共價或非共價相互作用的基團、光籠鎖部分(photocaged moiety)、光化福射可激發(fā)部分、光致異構化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、并入重原子的部分、化學可裂解基團、光可裂解基團、延長的側鏈、經(jīng)碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經(jīng)同位素標記部分、生物物理學探針、發(fā)磷光基團、化學發(fā)光基團、電子致密基團、磁性基團、插入基團、發(fā)色團、能量轉移劑、生物活性劑、可檢測標記、小分子、量子點、納米傳導物、放射性核苷酸、無線電傳導物、中子俘獲劑或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需化合物或物質(zhì)。
[0161]所需蛋白質(zhì)或多肽可含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或十個或十個以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，蛋白質(zhì)中可存在包含I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上不同非天然氨基酸的I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上不同位點。在某些實施例中，天然存在型式的蛋白質(zhì)中存在的至少一個(但少于全部)特定氨基酸經(jīng)非天然氨基酸取代。
[0162]本發(fā)明提供基于包含至少一種非天然編碼的氨基酸的GH超基因家族成員、尤其hGH的方法和組 合物。將至少一個非天然編碼的氨基酸引入GH超基因家族成員(諸如hGH)中可允許應用涉及特定化學反應(包括但不限于，與一個或一個以上非天然編碼的氨基酸反應而不與20種常見氨基酸反應)的接合化學方法。在一些實施例中，通過非天然編碼的氨基酸的側鏈使包含非天然編碼的氨基酸的GH超基因家族成員與水溶性聚合物(諸如，聚乙二醇(PEG))連接。本發(fā)明提供一種以PEG衍生物選擇性修飾蛋白質(zhì)的高效方法，其涉及將非基因編碼的氨基酸(包括(但不限于)含有未見于20種天然并入的氨基酸中的官能團或取代基的氨基酸，所述官能團或取代基包括(但不限于)酮、疊氮基或乙炔部分)選擇性并入對選擇性密碼子起反應的蛋白質(zhì)，且隨后以適當?shù)姆磻訮EG衍生物對那些氨基酸進行修飾。并入后，可接著通過利用所屬領域技術人員已知的適于非天然編碼的氨基酸中所存在的特定官能團或取代基的化學方法對氨基酸側鏈進行修飾。已知的多種化學方法都適用于本發(fā)明中以將水溶性聚合物并入蛋白質(zhì)中。
[0163]此項技術中已良好確立可使用PEG修飾生物材料的表面(例如，參看美國專利第6，610，281 號；Mehvar, R.，J.Pharmaceut.Sc1.,3(1):125-136(2000)，所述專利是以引用的方式并入本文中)。
[0164]標題為“ModifiedHuman Growth Hormone Polypeptides and Their Uses，，的美國專利申請案第11/046，432號(其是以其全文引用的方式并入本文中)中提供有關重組核酸方法、選擇性密碼子、正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和具有各種反應性基團的非天然編碼的氨基酸，所述反應性基團包括但不限于羰基、肼、酰肼、氨基氧基、疊氮基和炔基。此申請案中也討論非天然編碼的氨基酸的細胞攝入和生物合成。本申請案也詳細描述用于將一個或一個以上非天然編碼的氨基酸并入hGH且表達hGH多肽的位點。Zhang，Z.等人，Biochemistry42:6735-6746 (2003)(其是以引用的方式并入本文中)中描述含有羰基的非天然氨基酸(諸如對乙酰基-(+/_)-苯丙氨酸和間乙?；?(+/_)-苯丙氨酸)。[0165]I1.具有非天然氨基酸的多肽
[0166] 可并入非天然氨基酸以達成各種目的，包括(但不限于)修整蛋白質(zhì)結構和/或功能的改變、改變尺寸、酸度、親核性、氫鍵、疏水性、蛋白酶目標位點的可接取性、靶向部分(包括但不限于用于蛋白質(zhì)陣列)、加入生物活性分子、連接聚合物、連接放射性核、調(diào)節(jié)血清半衰期、調(diào)節(jié)組織滲透性(例如腫瘤)、調(diào)節(jié)活性轉運體、調(diào)節(jié)組織、細胞或器官特異性或分布、調(diào)節(jié)免疫原性、調(diào)節(jié)蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白質(zhì)可具有增強的或甚至完全新穎的催化或生物物理特性。舉例而言，可通過將非天然氨基酸包涵于蛋白質(zhì)中視情況改變以下特性:毒性、生物分布、結構特性、光譜特性、化學和/或光化學特性、催化能力、半衰期(包括但不限于，血清半衰期)、與其它分子反應(包括但不限于共價或非共價反應)的能力和其類似特性。包括包含至少一種非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的組合物可用于包括(但不限于)新穎的治療、診斷、催化酶、工業(yè)酶、結合蛋白(包括但不限于抗體)和包括(但不限于)有關蛋白質(zhì)結構和功能的研究。例如，參看Dougherty, (2000)Unnatural AminoAcids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in ChemicalBiology.4:645-652。
[0167]在本發(fā)明的一個方面中，組合物包括至少一種具有至少一個(包括但不限于至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或十個以上)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。非天然氨基酸可相同或不同，包括但不限于，包含I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上不同非天然氨基酸的蛋白質(zhì)中可存在I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上不同位點。另一方面，組合物包括具有至少一種(但小于全部)蛋白質(zhì)中所存在的特定氨基酸的蛋白質(zhì)經(jīng)非天然氨基酸取代。對于具有一個以上非天然氨基酸的指定蛋白質(zhì)而言，非天然氨基酸可相同或不同(包括但不限于，所述蛋白質(zhì)可包括兩種或兩種以上不同類型的非天然氨基酸，或可包括相同非天然氨基酸中的兩種)。對于具有兩種以上非天然氨基酸的指定蛋白質(zhì)而言，非天然氨基酸可相同、不同或為多種相同種類的非天然氨基酸與至少一種不同非天然氨基酸的組合。
[0168]本發(fā)明的特征為具有至少一個非天然氨基酸的引人關注的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組合物和方法制造的具有至少一種非天然氨基酸的多肽或蛋白質(zhì)。賦形劑(包括但不限于醫(yī)藥學上可接受的賦形劑)也可存在于蛋白質(zhì)中。
[0169]通過在真核細胞中制造所需的具有至少一種非天然氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽，蛋白質(zhì)或多肽通常將包括真核翻譯后修飾。在某些實施例中，蛋白質(zhì)包括至少一個非天然氨基酸和至少一種于活體內(nèi)由真核細胞所作的翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾不是通過原核細胞進行。舉例而言，翻譯后修飾包括(但不限于)乙?；?、酰基化、脂質(zhì)修飾、棕櫚酰化、棕櫚酸鹽添加、磷酸化、醣酯鍵修飾、糖基化和其類似修飾。一方面，翻譯后修飾包括通過GlcNAc-天冬氨酸鍵使寡醣(包括但不限于，(GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc))與天冬氨酸連接。參看標題為“Modifed Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses”的美國專利申請案第11/046,432號表1，所述專利是以引用的方式并入本文中，其列出有關真核蛋白的N連接的寡醣的一些實例(也可以存在未展示的額外殘基)。另一方面，翻譯后修飾包括通過GalNAc-絲氨酸或GalNAc-甲硫氨酸鍵或GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-甲硫胺酸鍵使寡醣(包括但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或甲硫氨酸連接。[0170]另一方面，翻譯后修飾包括前體(包括但不限于，降鈣素前體、降鈣素基因相關的肽前體、前甲狀旁腺激素原、前胰島素原、胰島素原、前阿皮黑素原、阿黑皮素原和其類似物)的蛋白水解加工；組裝成多亞基蛋白質(zhì)或大分子組裝；翻譯到細胞(包括但不限于，細胞器，諸如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體(GoIgi apparatus )、核、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體、葉綠體、液泡等，或通過分泌路徑)中的另一位點。在某些實施例中，蛋白質(zhì)包含分泌或定位序列、表位標簽、FLAG標簽、聚組氨酸標簽、GST融合物或其類似物。美國專利第4，963，495號和第6，436，674號(其是以引用的方式并入本文)中詳細描述經(jīng)設計以改良hGH多肽的分泌的構筑體。
[0171]非天然氨基酸的一個優(yōu)勢在于其存在可用于加入額外分子的額外化學部分。這些修飾可在真核或非真核細胞中于活體內(nèi)或活體外進行。因此，在某些實施例中，翻譯后修飾是通過非天然氨基酸進行。舉例而言，翻譯后修飾可通過親核-親電反應進行。目前用于選擇性修飾蛋白質(zhì)的大部分反應都涉及于親核與親電反應搭配物之間形成共價鍵，包括(但不限于)α-鹵酮與組氨酸或半胱氨酸側鏈的反應。在這些情況下，選擇性是通過蛋白質(zhì)中親核殘基的數(shù)量和可接取性測定。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，可使用其它更多的選擇性反應，諸如非天然酮基氨基酸與酰肼或氨基氧基化合物于活體外和活體內(nèi)進行的反應。例如參看 Cornish 等人，(1996) J.Am.Chem.Soc, 118:8150—8151 ；Mahal 等人，(1997)Science.276:1125-1128 ；ffang 等人，(2001)Science292:498-500 ；Chin 等人，(2002) T.Am.Chem.Soc.124:9026-9027 ；Chin 等人，(2002) Proc.Natl.Acad.Sc1..99:11020-11024 ；ffang 等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sc1.，100:56-61 ；Zhang 等人，(2003)Biochemistry.42:6735-6746:和 Chin 等人，(2003) Science.301:964-7，所有參考文獻都是以引用的方式并入本文中。這使得能夠用大量包括熒光團、交聯(lián)劑、糖衍生物和細胞毒性分子的試劑選擇性標記實際上任何蛋白質(zhì)。也參看標題為“Glycoproteinsynthesis”的美國專利第6，927，042號，其是以引用的方式并入本文中?？膳chGH連接的分子包括(但不限于)染料、熒光團、交聯(lián)劑、糖衍生物、聚合物(包括但不限于，聚乙二醇衍生物)、光交聯(lián)劑、細胞毒性化合物、親和標記、生物素衍生物、樹脂、珠粒、第二蛋白質(zhì)或多肽(或更多)、聚核苷酸(`包括但不限于，DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物和其類似物。
[0172]本發(fā)明提供通過選擇性修飾蛋白質(zhì)產(chǎn)生的非天然氨基酸多肽配方，其涉及遺傳并入非天然氨基酸。
[0173]II1.活體內(nèi)產(chǎn)生包含非基因編碼的氨基酸的hGH多肽
[0174]可使用經(jīng)修飾的tRNA和tRNA合成酶加入或取代并非天然存在的系統(tǒng)中編碼的氨基酸于活體內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的hGH多肽。
[0175]使用并非天然存在的系統(tǒng)中編碼的氨基酸產(chǎn)生tRNA和tRNA合成酶的方法描述于例如美國專利申請公開案2003/0082575 (第10/126，927號)和2003/0108885 (第10/126,931號)中，其是以引用的方式并入本文中。這些方法涉及產(chǎn)生獨立于相對于翻譯系統(tǒng)為內(nèi)源性的合成酶和tRNA起作用(且因此有時稱為“正交”)的翻譯機器。通常，翻譯系統(tǒng)包含正交tRNA (Ο-tRNA)和正交氨?；鵷RNA合成酶(0-RS)。通常，O-RS優(yōu)先以翻譯系統(tǒng)中的至少一種非天然存在的氨基酸使Ο-tRNA氨基乙?；姚?tRNA識別所述系統(tǒng)中的其它tRNA不識別的至少一種選擇性密碼子。因此，翻譯系統(tǒng)對所編碼的選擇性密碼子起反應將非天然編碼的氨基酸插入所述系統(tǒng)中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中，由此將氨基酸“取代入”所編碼的多肽中的位置中。
[0176]用于將特定的合成氨基酸插入到多肽中的技術中已描述多種正交tRNA和氨?；鵷RNA合成酶，且一般適用于本發(fā)明中。舉例而言，酮基特異性Ο-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶已描述于 Wang, L.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA100:56_61 (2003)和 Zhang, Z.等人，Biochem.42 (22): 6735-6746 (2003)中。示范性O-RS或其部分是通過聚核苷酸序列編碼，且其包括美國專利申請公開案2003/0082575和2003/0108885中所揭示的氨基酸序列，所述專利各自以引用的方式并入本文。與O-RS —起使用的相應Ο-tRNA分子也描述于例如美國專利申請公開案 2003/0082575 (第 10/126，927 號)和 2003/0108885 (第 10/126, 931號)中，其是以引用的方式并入本文中。
[0177]疊氮基特異性Ο-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶系統(tǒng)的實例描述于Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)中。對疊氮基-L-Phe的示范性O-RS序列包括(但不限于)如美國專利申請公開案2003/0108885 (第10/126，931號)中所揭示的核苷酸序列SEQID NOs:14-16和29-32和氨基酸序列SEQ ID NOs: 46-48和61-64，所述專利是以引用的方式并入本文中。其它Ο-tRNA序列包括(但不限于)如美國專利申請公開案2003/0108885(第10/126,931號)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NOs: 1_3，所述專利是以引用的方式并入本文中。對特定非天然編碼的氨基酸具特異性的Ο-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶對的其它實例描述于美國專利申請公開案2003/0082575 (第10/126，927號)中，其是以引用的方式并入本文中。在釀酒酵母中并入含酮基氨基酸與含疊氮基氨基酸的O-RS和Ο-tRNA描述于Chin, J.W.等人，Science301:964-967 (2003)中。
[0178]已報導若干其它正交對。已描述潛在并入大腸桿菌中的非天然氨基酸的源自釀酒酵母tRNA和合成酶的谷氨?；?例如參看Liu, D.R.和Schultz, P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.96:4780-4785)、天冬氨釀基(例如參看 Pastrnak, Μ.等人，(2000)Helv.Chim.Acta83:2277- 2286)和酪氨?；?例如參看 Ohno, S.等人，(1998) T.Biochem.(Toky0.Tpn.) 124:1065-1068:和 Kowal, A.K.等人，(2001) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.98:2268-2273)系統(tǒng)。已描述源自大腸桿菌谷氨?；?例如參看Kowal，A.K.等人，(2001) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A..98:2268-2273)和酪氨?；?例如參看 Edwards, H.和Schi_el，P.(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶用于釀酒酵母中。已將大腸桿菌酪氨酰基系統(tǒng)用于哺乳動物細胞活體內(nèi)并入3-碘-L-酪氨酸。參看Sakamoto，K.等人，(2002) Nucleic Acids Res.30:4692-4699。
[0179]使用Ο-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶涉及選擇編碼非天然編碼的氨基酸的特定密碼子。盡管可使用任何密碼子，但一般需要選擇稀少或從未用于表達Ο-tRNA/氨?；鵷RNA合成酶的細胞中的密碼子。舉例而言，示范性密碼子包括無義密碼子，諸如終止密碼子(琥珀、赭石和蛋白石)；四個或四個以上堿基密碼子；和稀少或未經(jīng)使用的其它天然的三堿基密碼子。
[0180]可使用此項技術中已知的突變誘發(fā)方法(包括但不限于，位點特異性突變誘發(fā)、盒式突變誘發(fā)、限制性選擇性突變誘發(fā)等)將特定的選擇性密碼子引入hGH多肽編碼序列的適當位置中。
[0181]用于產(chǎn)生可用于并入非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)合成機器組份(諸如0-RS、Ο-tRNA 和正交 O-tRNA/O-RS 對)的方法描述于 Wang, L.等人，Science292:498-500 (2001)；Chin,J.ff.等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002) ;Zhang,Z 等人，Biochemistry42:6735-6746 (2003)中。用于活體內(nèi)并入非天然編碼的氨基酸的方法和組合物描述于美國專利申請公開案2003/0082575 (第10/126，927號)中，其是以引用的方式并入本文中。用于選擇有機體活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中所使用的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法也描述于美國專利申請公開案2003/0082575 (第10/126，927號)和2003/0108885 (第10/126，931號)中，其是以引用的方式并入本文中。標題為“Site Specific Incorporationof Keto Amino Acids into Proteins”的PCT 公開案第 W004/035743 號(其是以其全文引用的方式并入本文中)中描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA對。標題為“Expandingthe Eukaryotic Genetic Code”的PCT公開案第W004/094593號(其是以其全文引用的方式并入本文中)中描述用于將非天然編碼的氨基酸并入真核宿主細胞中的正交RS和tRNA對。所述方法也于標題為“Modifed Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses”的美國專利申請案第11/046，432號中進行詳細描述，所述專利是以引用的方式并入本文中。[0182]產(chǎn)生正交tRNA和RS對的方法中所使用的有機體包含各種有機體和各種組合。舉例而言，所述方法的第一和第二有機體可相同或不同。在一實施例中，有機體視情況為原核有機體，包括(但不限于)詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii )、嗜熱自養(yǎng)甲燒桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、極端嗜鹽菌(Halobacterium)> 大腸桿菌(Escherichia coli)、閃爍古生球菌(A.fulgidus)、強烈熾熱球菌(P.furiosus)、掘越氏熱球菌(P.horikoshii)、超嗜熱需氧古生菌(A.pernix)、嗜熱棲熱菌(T.thermophilus)或其類似物?；蛘撸袡C體視情況包括真核有機體，包括(但不限于)植物(包括但不限于，復雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌(包括但不限于，酵母等)、動物(包括但不限于，哺乳動物、昆蟲、節(jié)肢動物等)或其類似動物。在另一實施例中，第二有機體為原核有機體，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、極端嗜鹽菌、大腸桿菌、閃爍古生球菌、極端嗜鹽菌、強烈熾熱球菌、掘越氏熱球菌、超嗜熱需氧古生菌、嗜熱棲熱菌或其類似物?；蛘?，第二有機體可為真核有機體，包括(但不限于)酵母、動物細胞、植物細胞、菌類、哺乳動物細胞或其類似物。在各種實施例中，所述第一有機體與第二有機體不同。
[0183]V.非天然存在的氨基酸于hGH多肽中的位置
[0184]本發(fā)明預期將一個或一個以上非天然存在的氨基酸并入hGH多肽?？蓪⒁粋€或一個以上非天然存在的氨基酸并入不破壞多肽活性的特定位置處。這可通過進行“保守性”取代達成，包括(但不限于)以疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，體積大的氨基酸取代體積大的氨基酸、親水性氨基酸取代親水性氨基酸和/或?qū)⒎翘烊淮嬖诘陌被岵迦霝榛钚圆恍璧奈恢弥小?br> [0185]hGH的區(qū)域可描述于下，其中hGH中的氨基酸位置是通過中間一行(美國專利申請案第11/046，432號中的SEQ ID NO:2，所述專利是以引用的方式并入本文中)指示:
[0186]螺旋A 螺旋B 螺旋C 螺旋D
[0187][1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]N 端 A-B 環(huán) B-C 環(huán) C-D 環(huán) C 端
[0188]可使用各種生物化學方法和結構方法選擇hGH多肽內(nèi)以非天然編碼的氨基酸進行取代的所需位點。所屬領域技術人員易于顯而易見，多肽鏈的任何位置都適于選擇用于并入非天然編碼的氨基酸，且選擇可基于合理設計或出于任何或非特別需要的目的隨機選擇。選擇所需位點可用于產(chǎn)生具有任何所需特性或活性的hGH分子(包括(但不限于)激動劑、超強激動劑(sup er-agon i S t)、反相激動劑、拮抗劑、受體結合調(diào)節(jié)劑、受體活性調(diào)節(jié)劑)、形成二聚體或多聚體、與天然分子相比不改變活性或特性或操縱多肽的任何物理或化學特性(諸如溶解性、聚集或穩(wěn)定性)。舉例而言，可使用此項技術中已知的點突變分析、丙氨酸掃描或同源物掃描方法鑒別hGH多肽的生物活性所需的多肽位置。例如參看Cunningham, B.和 Wells, J.，Science, 244:1081-1085 (1989)(鑒別對于 hGH 生物活性至關重要的14個殘基)和Cunningham, B.等人Science243:1330-1336 (1989)(使用同源物掃描突變誘發(fā)鑒別抗體和抗體表位)。美國專利第5，580，723號、第5，834，250號、第6，013，478號、第6，428，954號和第6，451，561號(其是以引用的方式并入本文)中描述通過用目標物質(zhì)鑒別影響多肽活性的活性結構域系統(tǒng)性分析多肽(諸如hGH)結構和功能的方法。除那些通過丙氨酸或同源物掃描突變誘發(fā)鑒別為對生物活性至關重要的殘基外的殘基可為以非天然編碼的氨基酸進行取代的良好候選物，此視所尋求的多肽的所需活性而定?；蛘?，鑒別為對生物活性至關重要的位點也可為以非天然編碼的氨基酸進行取代的良好候選物，此也視所尋求的多肽的所需活性而定。另一替代選擇將使得能夠以非天然編碼的氨基酸于多肽鏈上各位置中進行一系列取代，并且觀察多肽活性的作用。所屬領域技術人員將易于顯而易見，用于將經(jīng)非天然氨基酸取代的位置選擇到任何多肽中的任何方式、技術或方法都適用于本發(fā)明中。
[0189]也可檢驗含有缺失的天然存在的hGH多肽突變體的結構和活性，以測定可能耐受以非天然編碼的氨基酸進行的取代的蛋白質(zhì)區(qū)域。例如參看Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta, 925:314 (1987) ；Lewis, U.等人 J.Biol.Chern.，253:2679-2687 (1978)有關hGH的內(nèi)容。以類似方式，可使用蛋白酶消化和單克隆抗體鑒別引起hGH受體結合的hGH區(qū)域。例如參看 Cunningham, B.等人 Science243:1330-1336 (1989) ；Mills, J.等人，Endocrinology, 107:391-399(1980) ；Li, C, Mol.Cell.Biochem.，46:31-41(1982)(表明可缺失殘基134與149之間的氨基酸而不會損失活性)。已去除可能不耐受以非天然編碼的氨基酸進行的取代的殘基后，可由hGH的三維晶體結構和其結合蛋白檢驗每一剩余位置處所建議的取代的影響。參看de Vos, A. 等人，Science, 255:306-312(1992)有關hGH內(nèi)容；所有晶體結構的hGH都可于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)(包括3HHR、1AXI和1HWG) (PDB,可于國際互聯(lián)網(wǎng)rcsb.0rR得到)中得到，所述蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為含有蛋白質(zhì)和核酸大分子的三維結構數(shù)據(jù)的中央數(shù)據(jù)庫。因此，所屬領域技術人員可易于鑒別可經(jīng)非天然編碼的氨基酸取代的氨基酸位。
[0190]在一些實施例中，本發(fā)明的hGH多肽包含一個或一個以上定位于不破壞多肽螺旋或β折疊二級結構的蛋白質(zhì)區(qū)域中的非天然存在的氨基酸。
[0191]并入非天然編碼的氨基酸的示范性殘基可為從潛在受體結合區(qū)域(包括但不限于，位點I和位點II)排除、可完全或部分暴露到溶劑、與鄰近殘基具有最小或無氫鍵相互作用、可在最小限度上暴露到鄰近反應性殘基并且可在如通過hGH多肽與其受體結合或未與其結合的三維晶體結構、二級、三級或四級結構所預測具高度靈活性(包括但不限于，C-D環(huán))或結構上具剛性(包括但不限于，B螺旋)的區(qū)域中的那些殘基。
[0192]在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼的氨基酸并入與hGH 二級結構對應的一個或一個以上以下區(qū)域中的任何位置處:與SEQ ID N0:2中1-5 (N端)、6_33 (A螺旋)、34-74 (A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域，即A-B環(huán))、75-96 (B螺旋)、97_105 (B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域，即B-C環(huán))、106-129 (C螺旋)、130-153 (C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域，即C-D環(huán))、154-183 (D螺旋)、184-191 (C端)對應的位置。在其它實施例中，GH多肽(例如，本發(fā)明的hGH多肽)包含至少一個經(jīng)位于GH (例如hGH)的至少一個區(qū)域中的至少一個氨基酸取代的非天然存在的氨基酸，所述至少一個區(qū)域是選自由與SEQ ID N0:2中N端(1-5)、A-B 環(huán)的 N 末端(32-46)、B-C 環(huán)(97_105)、C_D 環(huán)(132-149)和 C 端(184-191)對應的區(qū)域組成的群組。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼的氨基酸并入GH (例如hGH)以下位置的一個或一個以上位置處:SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的第I位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70 位、71 位、74 位、88 位、91 位、92 位、94 位、95 位、97 位、98 位、99 位、100 位、101 位、102位、103 位、104 位、105 位、106 位、107 位、108 位、109 位、111 位、112 位、113 位、115 位、116位、119 位、120 位、122 位、123 位、126 位、127 位、129 位、130 位、131 位、132 位、133 位、134位、135 位、136 位、137 位、138 位、139 位、140 位、141 位、142 位、143 位、144 位、145 位、146位、147 位、148 位、149 位、150 位、151 位、152 位、153 位、154 位、155 位、156 位、158 位、159位、161 位、168 位、172 位、183 位、184 位、185 位、186 位、187 位、188 位、189 位、190 位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)。
[0193]并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點包括與SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的29位、30位、33位、34位、35位、37位、39位、40位、49位、57位、59位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101 位、103 位、107 位、108 位、111 位、122 位、126 位、129 位、130 位、131 位、133 位、134位、135 位、136 位、137 位、139 位、140 位、141 位、142 位、143 位、145 位、147 位、154 位、155位、156位、159位、183位、186位和187位或其任何組合對應的位點。
[0194]并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的子集包括與SEQ IDNO:2或SEQ ID N0:1或3的相應氨基酸的29位、33位、35位、37位、39位、49位、57位、69位、70 位、71 位、74 位、88 位、91 位、92 位、94 位、95 位、98 位、99 位、101 位、103 位、107 位、108 位、111 位、129 位、130 位、131 位、133 位、134 位、135 位、136 位、137 位、139 位、140 位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、186位和187位或其任何組合對應的位點。對于GH (例如hGH)和其與GH (例如hGH)受體相互作用的晶體結構的檢驗表明，這些氨基酸殘基的側鏈完全或部分與溶劑接近且非天然編碼的氨基酸的側鏈可指向蛋白質(zhì)表面外并且指向溶劑中。
[0195]并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位置包括與SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:1或3的相應氨基酸的35位、88位、91位、92位、94位、95位、99位、101位、103位、111 位、131 位、133 位、134 位、135 位、136 位、139 位、140 位、143 位、145 位和 155 位或其任何組合對應的位點。對于GH (例如hGH)和其與GH (例如hGH)受體相互作用的晶體結構的檢驗表明，這些氨基酸殘基的側鏈完全暴露至溶劑且天然殘基的側鏈指向溶劑中。
[0196]并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的子集包括與SEQ IDN0:2或SEQ ID N0:1或3的相應氨基酸的30位、74位、103位或其任何組合對應的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的另一子集包括與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合對應的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的另一子集包括與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何組合對應的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的又一子集包括與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何組合對應的位點。并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的另一子集包括與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合對應的位點。在某些實施例中，并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的位點包括與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位對應的位點。
[0197]在一些實施例中，并入GH (例如hGH)中的非天然編碼的氨基酸中的至少一者含有羰基，例如酮基。在某些實施例中，至少一個并入GH (例如hGH)中的非天然編碼的氨基酸中的為對乙酰苯丙氨酸。在GH (例如hGH)含有多個非天然編碼的氨基酸的一些實施例中，一個以上并入GH (例如hGH)中的非天然編碼的氨基酸為對乙酰苯丙氨酸。在GH (例如hGH)含有多個非天然編碼的氨基酸的一些實施例中，實質(zhì)所有并入GH (例如hGH)中的非天然編碼的氨基酸為對乙酰苯丙氨酸。[0198]在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一個或一個以上位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:第I位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48 位、49 位、52 位、55 位、57 位、59 位、65 位、66 位、69 位、70 位、71 位、74 位、88 位、91 位、92位、94 位、95 位、97 位、98 位、99 位、100 位、101 位、102 位、103 位、104 位、105 位、106 位、107位、108 位、109 位、111 位、112 位、113 位、115 位、116 位、119 位、120 位、122 位、123 位、126位、127 位、129 位、130 位、131 位、132 位、133 位、134 位、135 位、136 位、137 位、138 位、139位、140 位、141 位、142 位、143 位、144 位、145 位、146 位、147 位、148 位、149 位、150 位、151位、152 位、153 位、154 位、155 位、156 位、158 位、159 位、161 位、168 位、172 位、183 位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)(SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于與一個或一個以上這些位置對應的位置:30 位、35 位、74 位、92 位、103 位、143 位、145 位(SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于與一個或一個以上這些位置對應的位置:35位、92位、143位、145位(SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于與一個或一個以上這些位置對應的位置:SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于與一個或一個以上這些位置對應的位置:SEQID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何組合。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在一定位置處與水溶性聚合物連接，所述位置包括但不限于一個或一個以上這些位置對應的位置:與SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸在對應于(但不限于)SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位的位置處與水溶性聚合物連接。
[0199]在一些實施例中，與GH (例如hGH)連接的水溶性聚合物包括一個或一個以上聚乙
二醇分子(PEG)。聚合物(例如PEG)可為線性或分枝聚合物。通常，本發(fā)明中所使用的線性聚合物(例如PEG)的MW可為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa,或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。通常，本發(fā)明中所使用的分枝聚合物(例如PEG)的MW可為約IkDa到約IOOkDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。聚合物(諸如PEG)將于本文中進一步進行描述。在某些實施例中，GH (例如hGH)與水溶性聚合物(例如PEG)之間的鍵為肟鍵。
[0200]本發(fā)明的某些實施例涵蓋包括通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物連接的GH(例如hGH)的組合物，其中所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，水溶性聚合物為PEG，例如線性PEG。在涵蓋至少一個通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的線性PEG的一些實施例中，PEG的MW可為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的麗為約30kDa。在涵蓋至少一個通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的一些實施例中，PEG的MW可為約IkDa到約IOOkDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的為約40kDa。在一些實施例中，所述GH為GH，例如hGH ;且在部分這些實施例中，所述GH (例如，hGH)具有至少約80%與SEQ IDNO: 2相同的序列；在一些實施例中，所述GH (例如，hGH)具有為SEQ ID NO: 2序列的序列。在一些實施例中，所述GH (例如，hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸；在部分這些實施例中，至少一個肟鍵是介于非天然編碼的氨基酸與至少一個水溶性聚合物之間。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸含有羰基，諸如酮基；在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸為對乙酰苯丙氨酸。在一些實施例中，對乙酰苯丙氨酸在與SEQ ID N0:2的35位對應的位置處經(jīng)取代。
[0201]因此，在一些實施例中，本發(fā)明提供通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物連接的GH (例如hGH)，其中所述共價鍵為肟鍵。在某些實施例中，水溶性聚合物為PEG，且所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的MW為約30kDa。在某些實施例中，水溶性聚合物為作為分枝PEG的PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約IkDa到約IOOkDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG 的 MW 為約 40kDa。
[0202]在一些實施例中，本發(fā)明提供GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)含有非天然編碼的氨基酸，其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如PEG)連接，且其中所述共價鍵為介于非天然編碼的氨基酸與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，將非天然編碼的氨基酸并入GH (例如hGH)中與SEQ ID NO:2中35位對應的位置處。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的MW為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa,或約20kDa到約40kDa,或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的麗為約30kDa。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約IkDa到約IOOkDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。
[0203]在一些實施例中，本發(fā)明提供GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)含有非天然編碼的氨基酸，其為含羰基的非天然編碼的氨基酸；其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如PEG)連接，且其中所述共價鍵為介于非天然編碼的含羰基氨基酸與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，將非天然編碼的含羰基氨基酸并入GH (例如hGH)中與SEQ ID NO:2中35位對應的位置處。2.在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的麗為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的為約30kDa。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG的麗為約IkDa到約IOOkDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。 [0204]在一些實施例中，本發(fā)明提供含有包括酮基的非天然編碼的氨基酸的GH (例如hGH),其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如PEG)連接，且其中所述共價鍵為介于含有酮基的非天然編碼的氨基酸與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，將含有酮基的非天然編碼的氨基酸并入GH(例如hGH)中與SEQ ID N0:2中35位對應的位置處。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的MW為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的MW為約30kDa。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約IkDa到約IOOkDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的為約40kDa。
[0205]在一些實施例中，本發(fā)明提供含有非天然編碼的氨基酸(其為對乙酰苯丙氨酸)的GH (例如hGH)，其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如PEG)連接，且其中所述共價鍵為介于對乙酰苯丙氨酸與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，將對乙酰苯丙氨酸并入GH (例如hGH)中與SEQ ID NO:2中35位對應的位置處。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG的MW為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa,或約20kDa到約40kDa,或為約30kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH (例如hGH)連接的線性PEG的某些實施例中，PEG的為約30kDa。在水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG的MW為約IkDa到約IOOkDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如hGH)連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG的MW為約40kDa。
[0206]在某些實施例中，本發(fā)明提供包括SEQ ID N0:2的GH (例如hGH)，且其中所述GH(例如hGH)在與SEQ ID NO: 2中35位對應的位置處經(jīng)通過肟鍵與麗為約30kDa的線性PEG連接的對乙酰苯丙氨酸取代。[0207] 在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:第I位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91 位、92 位、94 位、95 位、97 位、98 位、99 位、100 位、101 位、102 位、103 位、104 位、105位、106 位、107 位、108 位、109 位、111 位、112 位、113 位、115 位、116 位、119 位、120 位、122位、123 位、126 位、127 位、129 位、130 位、131 位、132 位、133 位、134 位、135 位、136 位、137位、138 位、139 位、140 位、141 位、142 位、143 位、144 位、145 位、146 位、147 位、148 位、149位、150 位、151 位、152 位、153 位、154 位、155 位、156 位、158 位、159 位、161 位、168 位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)(SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:30位、35位、74位、92位、103位、143位、145位(SEQ IDN0:2或SEQ ID N0:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:35位、92位、143位、145位(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的非天然編碼的氨基酸，所述位置包括(但不限于)與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位對應的位置。在PEG為線性PEG的實施例中，所述PEG的麗可為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。
[0208] 在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:第I位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70 位、71 位、74 位、88 位、91 位、92 位、94 位、95 位、97 位、98 位、99 位、100 位、101 位、102位、103 位、104 位、105 位、106 位、107 位、108 位、109 位、111 位、112 位、113 位、115 位、116位、119 位、120 位、122 位、123 位、126 位、127 位、129 位、130 位、131 位、132 位、133 位、134位、135 位、136 位、137 位、138 位、139 位、140 位、141 位、142 位、143 位、144 位、145 位、146位、147 位、148 位、149 位、150 位、151 位、152 位、153 位、154 位、155 位、156 位、158 位、159位、161 位、168 位、172 位、183 位、184 位、185 位、186 位、187 位、188 位、189 位、190 位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所 述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:30位、35位、74位、92位、103位、143位、145位(SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:35位、92位、143位、145位(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸)。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:1或3的相應氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與以下位置對應的位置:SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:1或3的相應氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何組合。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種激素組合物，其包括通過肟鍵與至少一個PEG (例如線性PEG)連接的GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且其中所述GH (例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其為在一個或一個以上位置處經(jīng)取代的對乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的相應氨基酸的35位對應的位置。在PEG為線性PEG的實施例中，所述PEG的麗可為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa，或約20kDa到約40kDa，或為約30kDa。
[0209] 在一些實施例中，本發(fā)明提供GH (例如hGH)，其中所述GH (例如hGH)含有至少一個非天然編碼的氨基酸，其中所述GH是通過共價鍵與多個水溶性聚合物(例如多個PEG)連接，其中一個或一個以上所述共價鍵為介于非天然編碼的氨基酸的至少一者與水溶性聚合物(例如PEG)之間的肟鍵。所述GH (例如hGH)可與約2-100個水溶性聚合物(例如PEG)，或約2-50個水溶性聚合物(例如PEG)，約2-25個水溶性聚合物(例如PEG)，或約2_10個水溶性聚合物(例如PEG)，或約2-5個水溶性聚合物(例如PEG)，或約5-100個水溶性聚合物(例如PEG)，或約5-50個水溶性聚合物(例如PEG)，或約5_25個水溶性聚合物(例如PEG)，或約5-10個水溶性聚合物(例如PEG)，或約10-100個水溶性聚合物(例如PEG)，或約10-50個水溶性聚合物(例如PEG)，或約10-20個水溶性聚合物(例如PEG)，或約20-100個水溶性聚合物(例如PEG)，或約20-50個水溶性聚合物(例如PEG)，或約50-100個水溶性聚合物(例如PEG)連接?？蓪⑺鲆粋€或一個以上非天然編碼的氨基酸并入GH (例如hGH)中本文所述的任何位置處。在一些實施例中，將至少一個非天然編碼的氨基酸并入GH (例如hGH)中與SEQ ID NO:2中35位對應的位置處。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸包括至少一個非天然編碼的氨基酸，其為含羰基的非天然編碼的氨基酸，例如含酮基的非天然編碼的氨基酸，諸如對乙酰苯丙氨酸。在一些實施例中，GH (例如hGH)包括對乙酰苯丙氨酸。在一些實施例中，將`對乙酰苯丙氨酸并入GH (例如hGH)中與SEQ ID NO:2中35位對應的位置處，其中所述對乙酰苯丙氨酸是通過肟鍵與所述聚合物中的一者(例如所述PEG中的一者)連接。在一些實施例中,水溶性聚合物(例如PEG)中的至少一者是通過與非天然編碼的氨基酸中至少一者的共價鍵與GH(hGH)連接。在一些實施例中，所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，多個水溶性聚合物(例如PEG)是通過與多個非天然編碼的氨基酸的共價鍵與GH (hGH)連接。在一些實施例中，至少一個共價鍵為肟鍵；在一些實施例中，多個共價鍵為肟鍵；在一些實施例中，實質(zhì)所有所述鍵為肟鍵。所述多個水溶性聚合物(例如PEG)可為線性聚合物、分枝聚合物或其任何組合。在并入一個或一個以上線性PEG的實施例中，所述線性PEG的MW為約0.1kDa到約IOOkDa,或約IkDa到約60kDa,或約20kDa到約40kDa,或為約30kDa。在并入一個或一個以上分枝PEG的實施例中，所述分枝PEG的MW為約IkDa到約IOOkDa,或約30kDa到約50kDa，或為約40kDa。應了解，使用多個水溶性聚合物(例如PEG)的實施例大體上將使用MW比使用單一 PEG的實施例中PEG的MW低的聚合物。因此，在一些實施例中，多個PEG的總MW為約0.l-500kDa,或約0.l_200kDa，或約0.1-1OOkDa,或約 1-1OOOkDa,或約 l_500kDa，或約 l_200kDa，或約 1-1OOkDa,或約 IO-1OOOkDa,或約 10-500kDa,或約 10_200kDa，或約 lO-lOOkDa,或約 10_50kDa,或約 20_1000kDa，或約20-500kDa,或約 20_200kDa，或約 20_100kDa，或約 20_80kDa，約 20_60kDa，約 5-100kDa，約5-50kDa 或約 5_20kDa。
[0210]人GH拮抗劑包括(但不限于)在I位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15 位、16 位、19 位、22 位、103 位、109 位、112 位、113 位、115 位、116 位、119 位、120 位、123
位和127位具有取代或在I位(意即，N端)具有添加或其任何組合(SEQ ID N0:2或SEQ IDNO:1或3中的相應氨基酸，或任何其它GH序列)的拮抗劑。
[0211]多種非天然編碼的氨基酸可在hGH多肽的指定位置經(jīng)取代或并入hGH多肽的指定位置中?？偟恼f來，選擇特定非天然編碼的氨基酸用于基于對hGH多肽與其受體的三維晶體結構的檢查進行的并入，優(yōu)先用于保守性取代(意即，取代Phe、Tyr或Trp的含芳基非天然編碼的氨基酸，諸如對乙酰苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)和需要引入hGH多肽中的特定接合化學(例如，當需要實現(xiàn)Huisgen[3+2]與具有炔部分的水溶性聚合物的環(huán)加成或與具有芳基酯的水溶性聚合物形成酰胺鍵隨后并入膦部分時，引入4-疊氮基苯丙氨酸)。
[0212]在一實施例中，所述方法另外包括:將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中，其中所述非天然氨基酸包含第一反應性基團；及使所述蛋白質(zhì)與包含第二反應性基團的分子(包括但不限于，標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯(lián)劑、放射性核、細胞毒性化合物、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、糖類、水溶性樹枝狀高分子、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米顆粒、自旋標記、熒光團、含金屬部分、放射性部分、新穎官能團、與其它分子共價或非共價相互作用的基團、光籠鎖部分、光化輻射可激發(fā)部分、光致異構化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、并入重原子的部分、化學可裂解基團、光可裂解基團、延長的側鏈、經(jīng)碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經(jīng)同位素標記部分、生物物理學探針、發(fā)磷光基團、化學發(fā)光基團、電子致密基團、磁性基團、插入基團、發(fā)色團、能量轉移劑、生物活性劑、可檢測標記、小分子、量子點、納米傳導物、放射性核苷酸、無線電傳導物、中子俘獲劑或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需化合物或物質(zhì))接觸。 [0213]在一些情況下，將使非天然編碼的氨基酸取代與hGH多肽內(nèi)的其它添加、取代或缺失組合以影響hGH多肽的其它生物特質(zhì)。在一些情況下，所述其它添加、取代或缺失可增加hGH多肽的穩(wěn)定性(包括但不限于，對蛋白水解降解的抗性)或增加hGH多肽對其受體的親和性。在一些情況下，所述其它添加、取代或缺失可增加hGH多肽的溶解性(包括但不限于，當在大腸桿菌或其它宿主細胞中表達時)。在一些實施例中，添加、取代或缺失可在大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表達后增加多肽的溶解性。在一些實施例中，除對并入在大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表達后導致多肽溶解性增加的非天然氨基酸的另一位點進行選擇外，還選擇經(jīng)天然編碼或非天然編碼的氨基酸取代的位點。在一些實施例中，hGH多肽包含調(diào)節(jié)對hGH多肽受體的親和性、調(diào)節(jié)(包括但不限于，增加或降低)受體二聚化、使受體二聚體穩(wěn)定、調(diào)節(jié)循環(huán)半衰期、調(diào)節(jié)釋放或生物利用度、便利純化或改良或改變特定投藥途徑的另一添加、取代或缺失。多種所述改變已于標題為“Modifed Human Growth HormonePolypeptides and Their Uses”的美國專利申請案第11/046，432號中得以描述,所述專利是以其全文引用的方式并入本文中。類似地，hGH多肽可包含蛋白酶裂解序列、反應性基團、抗體結合域(包括但不限于，F(xiàn)LAG或聚His)或其它基于親和性的序列(包括但不限于，F(xiàn)LAG、聚His、GST等)或改良對于多肽的檢測(包括但不限于，GFP)、純化或其它特質(zhì)的連接分子(包括但不限于，生物素)。
[0214]在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸的取代產(chǎn)生GH (例如hGH)拮抗劑。用于并入一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的示范性位點的子集包括:1位、2位、3位、4位、5位、8 位、9 位、11 位、12 位、15 位、16 位、19 位、22 位、103 位、109 位、112 位、113 位、115 位、116位、119位、120位、123位、127位或I位前(SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:l、3的相應氨基酸或任何其它GH序列)添加。在一些實施例中，GH (例如hGH)拮抗劑包含至少一個在使GH充當拮抗劑的區(qū)域1-5 (N端)、6-33 (A螺旋)、34_74 (A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域，SPA-B環(huán))、75-96 (B螺旋)、97-105 (B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域，即B-C環(huán))、106-129 (C螺旋)、130-153 (C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域，即C-D環(huán))、154-183 (D螺旋)、184-191 (C端)中進行的取代。在其它實施例中，并入非天然編碼的氨基酸的示范性位點包括螺旋A的氨基末端區(qū)與一部分C螺旋內(nèi)的殘基。在另一實施例中，以非天然編碼的氨基酸(諸如對-疊氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸)取代G120。在其它實施例中，使上文所列的取代與使GH (例如hGH多肽)成為GH (例如hGH)拮抗劑的額外取代組合。舉例而言，非天然編碼的氨基酸是在本文所鑒別的一個位置處經(jīng)取代，且同時在G120 (例如G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)處引入取代。在一些實施例中，GH (例如hGH)拮抗劑包含與存在于GH (例如hGH)分子的受體結合區(qū)中的水溶性聚合物連接的非天然編碼的氨基酸。
[0215]在一些情況下，I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上氨基酸經(jīng)一個或一個以上非天然編碼的氨基酸取代。在一些情況下，GH (例如hGH)多肽另外包括以一個或一個以上非天然編碼的氨基酸對天然存在的氨基酸進行I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上取代。舉例而言，在一些實施例中，GH (例如hGH)的以下區(qū)域中的一個或一個殘基經(jīng)一個或一個以上非天然編碼的氨基酸取代:1-5(N 端)、32-46 (A-B 環(huán)的 N 末端)、97-105 (B-C 環(huán))和 132-149 (C-D 環(huán))和 184-191 (C 端)。在一些實施例中，GH (例如hGH)的 以下區(qū)域中的一個或一個以上殘基經(jīng)一個或一個以上非天然編碼的氨基酸取代:1-5 (N端)、6-33 (A螺旋)、34-74 (A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域，即A-B環(huán))、75-96 (B螺旋)、97-105 (B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域，即B-C環(huán))、106-129 (C螺旋)、130-153 (C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域，即C-D環(huán))、154-183 (D螺旋)、184-191 (C端)。在一些情況下，所述一個或一個以上非天然編碼的殘基與一個或一個以上具有較低分子量的線性或分枝PEG(質(zhì)量為約5-20kDa或更低)連接，從而相對于連接到單一較高分子量PEG的物質(zhì)使結合親和性得以增強且具有可比較的血清半衰期。
[0216]在一些實施例中，以下位置處的GH (例如hGH)殘基中至多兩個經(jīng)一個或一個以上非天然編碼的氨基酸取代:29位、30位、33位、34位、35位、37位、39位、40位、49位、57位、59 位、66 位、69 位、70 位、71 位、74 位、88 位、91 位、92 位、94 位、95 位、98 位、99 位、101 位、103 位、107 位、108 位、111 位、122 位、126 位、129 位、130 位、131 位、133 位、134 位、135 位、136 位、137 位、139 位、140 位、141 位、142 位、143 位、145 位、147 位、154 位、155 位、156 位、159位、183位、186位和187位。在一些情況下，進行以下取代對的任一者:K38X*與Κ140Χ* ；Κ41Χ* 與 Κ145Χ* ;Υ35Χ* 與 Ε88Χ* ;Υ35Χ* 與 F92X* ;Υ35Χ* 與 Υ143Χ* ;F92X* 與 Y143X*，其中X*表示非天然編碼的氨基酸。并入兩個或兩個以上非天然編碼的氨基酸的優(yōu)選位點包括以下殘基的組合:29位、33位、35位、37位、39位、49位、57位、69位、70位、71位、74位、88位、91 位、92 位、94 位、95 位、98 位、99 位、101 位、103 位、107 位、108 位、111 位、129 位、130位、131 位、133 位、134 位、135 位、136 位、137 位、139 位、140 位、141 位、142 位、143 位、145位、147位、154位、155位、156位、186位和187位。用于并入兩個或兩個以上非天然編碼的氨基酸的特別優(yōu)選的位點包括以下殘基的組合:35位、88位、91位、92位、94位、95位、99位、101 位、103 位、111 位、131 位、133 位、134 位、135 位、136 位、139 位、140 位、143 位、145位和155位。
[0217]用于并入具有兩個或兩個以上非天然編碼的氨基酸的GH (例如hGH)中的優(yōu)選位點包括以下殘基的組合:SEQ ID N0:2第I位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97 位、98 位、99 位、100 位、101 位、102 位、103 位、104 位、105 位、106 位、107 位、108 位、109位、111 位、112 位、113 位、115 位、116 位、119 位、120 位、122 位、123 位、126 位、127 位、129位、130 位、131 位、132 位、133 位、134 位、135 位、136 位、137 位、138 位、139 位、140 位、141位、142 位、143 位、144 位、145 位、146 位、147 位、148 位、149 位、150 位、151 位、152 位、153位、154 位、155 位、156 位、158 位、159 位、161 位、168 位、172 位、183 位、184 位、185 位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白質(zhì)的羧基端)或其任何組合。
[0218]V.非真核生物和真核生物中的表達
[0219]為獲得經(jīng)克隆hGH多肽的高水平表達，將編碼本發(fā)明的hGH多肽的聚核苷酸亞克隆到表達載體中，所述表達載體含有用于直接轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子，且如果對于編碼蛋白質(zhì)的核酸而言，還含有用于翻譯起始的核糖體結合位點。所屬領域技術人員已知適當?shù)募毦鷨幼?，且例如描述于Sambrook等人Molecular Cloning, A LaboratoryManual (2001)和 Ausubel 等人 Current Protocols in Molecular Biology (1999)中。
[0220]用于表達本發(fā)明的hGH多肽的細菌表達系統(tǒng)可利用包括(但不限于)大腸桿菌、芽胞桿菌(Bacillus sp.)、突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和沙門氏菌(Salmonella)中者(Palva 等人，Gene22:229-235 (1983) ;Mosbach 等人，Nature302:543-545 (1983))。所述表達系統(tǒng)的試劑盒為市售。用于哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統(tǒng)為已為所屬領域技術人員所知且也為市售。在使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上文所述)表達本發(fā)明的hGH多肽的情況下，供表達的宿主細胞是基于其使用正交組份的能力選擇。示范性宿主細胞包括革蘭氏陽性細菌(Gram-positivebacteria)(包括但不限于，短芽孢桿菌(B.brevis)、枯草芽胞桿菌(B.subtilis)或鏈霉菌(Streptomyces))及革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌、突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、戀臭假單胞菌(Pseudomonasputida))以及酵母和其他真核細胞?？墒褂萌绫疚乃龅陌?-tRNA/0-RS對的細胞。
[0221]本發(fā)明的真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供合成包含極大有用量的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。一方面，組合物視情況包括(包括但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少I毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少I克或更多包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)，或可以活體內(nèi)蛋白質(zhì)制造方法(詳見本文提供的重組蛋白質(zhì)制造和純化方法)達成的量的蛋白質(zhì)。另一方面，所述蛋白質(zhì)視情況以包括(但不限于)每升包括(但不限于)細胞溶解產(chǎn)物、緩沖劑、醫(yī)藥學緩沖劑或其它液體懸浮液(包括但不限于，包括但不限于約Inl到約100L或100L以上的任一體積)中至少10微克蛋白質(zhì)、至少50微克蛋白質(zhì)、至少75微克蛋白質(zhì)、至少100微克蛋白質(zhì)、至少200微克蛋白質(zhì)、至少250微克蛋白質(zhì)、至少500微克蛋白質(zhì)、至少I毫克蛋白質(zhì)或至少10毫克蛋白質(zhì)的濃度存在于組合物中。在真核細胞中制造大量(包括但不限于，高于以包括但不限于活體外翻譯的其它方法通?？赡墚a(chǎn)生的量)包括至少一個非天然氨基酸的蛋白質(zhì)為本發(fā)明的一個特征。
[0222]本發(fā)明的真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供生物合成包含極大有用量的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。舉例而言，可制造出包括(但不限于)每升細胞提取液、細胞溶解產(chǎn)物、培養(yǎng)基、緩沖液和/或類似物至少10μ g、至少50μ g、至少75μ g、至少100 μ g、至少200 μ g、至少250 μ g或至少500 μ g、至少lmg、至少2mg、至少3mg、至少4mg、至少5mg、至少6mg、至少 7mg、至少 8mg、至少 9mg、至少 10mg、至少 20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、lg、5g、IOg 或 IOg 以上蛋白質(zhì)的濃度的包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。
[0223]表達系統(tǒng)、載體、宿主細胞、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基和與hGH多肽宿主細胞的分離已于標題為 “Modifed Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses” 的美國專利申請案第11/046，432號中進一步描述，所述專利是以引用的方式并入本文中。
[0224]V.通用純化方法
[0225]本發(fā)明的hGH多肽通常是在重組系統(tǒng)中表達后經(jīng)純化?？赏ㄟ^此項技術已知的多種方法從宿主細胞中純化出hGH多肽。細菌宿主細胞中產(chǎn)生的hGH多肽可具有弱溶解性或不溶(包涵體的形式)。可易于利用本文所揭示的方法和此項技術中已知的方法對hGH多肽進行氨基酸取代，所述取代是出于增加重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的溶解性的目的選擇。在蛋白質(zhì)不溶的情況下，可通過離心從宿主細胞溶解產(chǎn)物中收集蛋白質(zhì)，且隨后可進一步使細胞均質(zhì)化。在蛋白質(zhì)具弱溶解性的情況下，可加入包括但不限于聚乙烯亞胺(PEI)的化合物以誘使部分可溶蛋白質(zhì)沉淀。隨后，可通過離心便利地收集已沉淀的蛋白質(zhì)?？墒褂盟鶎兕I域技術人員已知的多種方法破碎重組宿主細胞或使其均質(zhì)化以從所述細胞內(nèi)釋放包涵體。可使用所屬領域技術人員已知的技術執(zhí)行宿主細胞的破碎或均質(zhì)化，所述技術包括(但不限于)以酶破碎細胞、超聲波處理、杜恩斯均質(zhì)化(dounce homogenization)或高壓釋放破碎。在本發(fā)明方法的一個實施例中，使用高壓釋放技術破碎大腸桿菌宿主細胞，從而釋放hGH多肽的包涵體。當處理hGH多肽的包涵體時，有益的使重復的均質(zhì)化時間減到最小，以便使包涵體的產(chǎn)量最大化，而不會因諸如溶解、機械剪切或蛋白質(zhì)水解等因素而有所損失。
[0226]接著，可使用此項技術中已知的多種適當增溶劑中的任一種溶解不溶或已沉淀的hGH多肽?？梢阅蛩鼗螓}酸胍溶解hGH多肽。應使溶解的hGH多肽的體積減到最小，從而能夠便利地使用易處理的批量大小制造大批量。這一因素對于可以數(shù)千升體積成批生長重組宿主的大規(guī)模商業(yè)工廠而言尤為重要。此外，當在大規(guī)模商業(yè)工廠中制造hGH多肽、尤其供人類使用的醫(yī)藥時，如可能，應當避免可損壞機器和容器或蛋白制品本身的有害化學物質(zhì)。本發(fā)明的方法中已表明，可使用較溫和的變性劑尿素替代較苛刻的變性劑鹽酸胍來溶解hGH多肽包涵體。使用尿素在有效溶解hGH多肽包涵體的同時也顯著減小損壞hGH多肽的制造和純化過程中所利用的不銹鋼設備的風險。
[0227]在可溶hGH蛋白的情況下，可將hGH分泌到細胞周質(zhì)間隙或培養(yǎng)基中。此外，可溶hGH可存在于宿主細胞的細胞質(zhì)中。在執(zhí)行純化步驟前可能需要濃縮可溶hGH。可使用所屬領域技術人員已知的標準技術從例如細胞溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)基中濃縮可溶hGH。此外，可使用所屬領域技術人員已知的標準技術破碎宿主細胞,并且將可溶hGH從宿主細胞的細胞質(zhì)或細胞周質(zhì)間隙中釋放出來。
[0228]當將hGH多肽制造為融合蛋白時，可去除融合序列?？赏ㄟ^酶裂解或化學裂解實現(xiàn)融合序列的去除?？墒褂盟鶎兕I域技術人員已知的方法實現(xiàn)融合序列的酶去除。對于去除融合序列的酶的選擇將通過融合物的身份確定，且如所屬領域技術人員將顯而易見，反應條件將通過酶的選擇予以確定。化學裂解可使用所屬領域技術人員已知的試劑(包括但不限于溴化氰、TEV蛋白酶和其它試劑)實現(xiàn)?？赏ㄟ^所屬領域技術人員已知的方法從經(jīng)裂解的融合序列中純化出所裂 解的hGH多肽。如所屬領域技術人員將顯而易見，所述方法將通過融合序列和hGH多肽的身份和特性確定。用于純化的方法可包括(但不限于)尺寸排阻色譜法、疏水相互作用色譜法、離子交換色譜法或透析法，或其任何組合。
[0229]也可純化hGH多肽，從而將DNA從蛋白質(zhì)溶液中去除。DNA可通過此項技術中已知的任何適當方法(諸如沉淀或離子交換色譜法)予以去除，且也可通過用核酸沉淀劑(諸如但不限于硫酸魚精蛋白)沉淀來去除?？墒褂盟鶎兕I域技術人員已知的標準方法使hGH多肽與已沉淀的DNA分離，包括但不限于，離心或過濾。去除宿主核酸分子對于將使用hGH多肽治療人類的工廠而言為一重要因素，而且本發(fā)明的方法會將宿主細胞DNA減少到醫(yī)藥學上可接受的程度。
[0230]小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵的方法也可用于蛋白質(zhì)表達中，包括(但不限于)發(fā)酵罐、搖瓶、流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、轉瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和攪拌罐生物反應器系統(tǒng)。這些方法的每一種都可在分批、饋料分批或連續(xù)模式工藝中執(zhí)行。
[0231]一般可使用此項技術中的標準方法回收本發(fā)明的人hGH多肽。舉例而言，可將培養(yǎng)基或細胞溶解產(chǎn)物離心或過濾以去除細胞碎片?？蓪⑸锨逡簼饪s或稀釋到所需體積，或?qū)⑵渫笧V到適當緩沖液中以調(diào)節(jié)制劑供進一步純化。進一步純化本發(fā)明的hGH多肽包括使去酰胺化和剪短形式的hGH多肽變異體與完整形式分離。
[0232]以下示范性程序中的任一者都可用于純化本發(fā)明的hGH多肽:親和色譜；陰離子或陽離子交換色譜(包括但不限于使用DEAE SEPHAR0SE) ;二氧化硅色譜；高效液相色譜(HPLC);反相HPLC (RP-HPLC);凝膠過濾色譜(包括但不限于使用SEPHADEX G-75);疏水相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合色譜；超濾/透濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜焦聚；置換色譜；電泳程序(包括但不限于制備型等電聚焦)；差別溶解性(differentialsolubility)(包括但不限于硫酸銨沉淀)；SDS-PAGE ;或萃取。
[0233]根據(jù)所屬領域技術人員已知和使用的標準程序，可部分或?qū)嵸|(zhì)完全將本發(fā)明的蛋白質(zhì)純化成均質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)、包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的抗體、包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的結合搭配物等。因此，可通過所屬領域技術人員已知的多種方法中的任一種回收并純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括(但不限于)硫酸銨或乙醇沉淀、酸或堿萃取、柱色譜、親和柱色譜、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、羥基磷灰石色譜、凝集素色譜、凝膠電泳和其類似方法。可視需要將蛋白質(zhì)再折疊步驟用于制造正確折疊的成熟蛋白質(zhì)。當需要高純度時，可在最終純化步驟中使用高效液相色譜(HPLC)、親和色譜或其它適當方法。在一實施例中，將所制造的抗非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì))的抗體用作純化試劑包括(但不限于)用于包含一種或一種以上非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的基于親和性的純化。部分純化或純化成均質(zhì)后，視需要，將多肽視情況用于多種用處，包括(但不限于)用作檢定組份、治療劑、預防劑、診斷劑、研究試劑和/或作為抗體制造的免疫原。
[0234]除本文所述的其它參考文獻外，多種純化/蛋白質(zhì)折疊方法也已為所屬領域技術人員所知，包括(但不限于)以下參考文獻中所述的那些方法:R.Scopes, ProteinPurification,Springer-Verlag, N.Y.(1982):Deutscher, Methods in Enzymologv 第 182卷:Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc.N.Y.(1990) ；Sandana, (1997)Bioseparation of Proteins, Academic Press,Inc.；Bollag 等人(1996)ProteinMethods,第 2 版 ffiley-Liss, NY ；ffalker, (1996)The Protein Protocols HandbookHumana Press, NJ, Harris and Angal, (1990)Protein Purification Applications:APractical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England:Harris 矛口 Angal,ProteinPurification Methods:A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England;Scopes, (1993)Protein Purification!Principles and Practice 第 3 版 SpringerVerlag, NY ；Janson and Ryden, (1998)Protein Purification!Principles, HighResolution Methods and Applications,第 2 版Wiley-VCH, NY:和 Walker (1998), ProteinProtocols on CD-ROM Humana Press, NJ ;和本文所引用的參考文獻。[0235]在真核宿主細胞或非真核宿主細胞中以非天然氨基酸制造所需蛋白質(zhì)或多肽的一個優(yōu)勢在于所述蛋白質(zhì)或多肽通常將以其天然構象折疊。然而，在本發(fā)明的某些實施例中，所屬領域技術人員將認識到，合成、表達和/或純化后，蛋白質(zhì)可具有與相關多肽的所需構象不同的構象。在本發(fā)明一方面中，視情況使所表達的蛋白質(zhì)變性且隨后使其復性。這是利用此項技術中已知的方法實現(xiàn)，包括(但不限于)通過將伴侶素加入所需蛋白質(zhì)或多肽中、通過將蛋白質(zhì)溶解于離液劑(諸如鹽酸胍)中、利用蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶等。
[0236]總的說來，有時需要使所表達的多肽變性和還原，且隨后使所述多肽再折疊成優(yōu)選構象。舉例而言，可將胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侶素加入所需翻譯產(chǎn)物中。還原、變性和復性蛋白質(zhì)的方法已為所屬領域技術人員所知(參看，上述參考文獻和Debinski,等人(1993)T.Biol.Chem., 268:14065-14070:Kreitman 和 Pastan(1993)Bioconiug.Chem..4:581-585 ;和 Buchner 等人，(1992)Anal.Biochem..205:263-270)。舉例而言，Debinski等人描述在胍-DTE中變性和還原包涵體蛋白?？稍诤邪?但不限于)氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液中再折疊蛋白質(zhì)?？勺⑷牖蛄硗庖迫朐僬郫B試劑以與所述一種或一種以上多肽或其它表達產(chǎn)物接觸，或可注入或另外移入所述一種或一種以上多肽或其它表達產(chǎn)物以與再折疊試劑接觸。
[0237]在以原核生物制造hGH多肽的情況下，由此制造的hGH多肽可能折疊異常，且因此缺乏或具有降低的生物活性。所述蛋白質(zhì)的生物活性可通過“再折疊”恢復。一般說來，通過例如使用一種或一種以上離液劑(例如，尿素和/或胍)和能夠還原二硫鍵的還原劑(例如，二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇(2-ME))溶解(其中hGH多肽也不溶)、伸展和還原多肽鏈使折疊異常的hGH多肽再折疊。接著，在適度濃度的離液劑下，加入氧化劑(例如，氧、胱氨酸或胱氨)，這使得再形成二硫鍵?？墒褂么隧椉夹g中已知的標準方法使hGH多肽再折疊，諸如美國專利第4，511，502號、第4，511，503號和第4，512，922號中所述的方法，所述專利是以引用的方式并入本文中。也可使hGH多肽與其它蛋白質(zhì)共折疊以形成雜二聚體或雜多聚體。
[0238]再折疊或共折疊后，可進一步純化hGH多肽。hGH的純化可使用所屬領域技術人員已知的多種技術實現(xiàn)，包括疏水相互作用色譜、尺寸排阻色譜、離子交換色譜、反相高效液相色譜、親和色譜和其類似技術或其任何組合。額外純化也可包括干燥或沉淀經(jīng)純化蛋白質(zhì)的步驟。
[0239]純化后，可于不同緩沖液中交換hGH和/或通過所屬領域技術人員已知的多種方法中的任一種加以濃縮，所述方法包括(但不限于)透濾和透析?？墒挂詥我唤?jīng)純化蛋白質(zhì)形式提供的hGH經(jīng)歷聚集和沉淀。
[0240]經(jīng)純化hGH可為至少90%純(如通過反相高效液相色譜、RP-HPLC或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-PAGE測量)或至少95%純或至少98%純，或至少99%純或更高純度。不管hGH純度的確切數(shù)字值如何，hGH已具有足夠純度以用作醫(yī)藥產(chǎn)品或用于進一步加工(諸如與諸如PEG的水溶性聚合物接合)。
[0241]在不存在其它活性成分或蛋白質(zhì)(除賦形劑、載劑和穩(wěn)定劑、血清白蛋白和其類似物外)的情況下可將某些hGH分子用作治療劑，或可使其與另一蛋白質(zhì)或聚合物復合。
[0242]可對細胞溶解產(chǎn)物、提取液、培養(yǎng)基、包涵體、宿主細胞周質(zhì)間隙、宿主細胞細胞質(zhì)或包涵h(huán)GH多肽的其它材料或?qū)τ扇魏畏蛛x步驟產(chǎn)生的任何hGH多肽混合物執(zhí)行多種分離步驟中的任一種，所述分離步驟包括(但不限于)親和色譜、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、凝膠過濾色譜、高效液相 色譜(“HPLC”)、反相HPLC (“ RP-HPLC”)、膨脹床吸附或其任何組合和/或重復且以任何適當次序。
[0243]用于執(zhí)行本文所述的技術的設備和其它必需材料為市售。泵、部分收集器、監(jiān)測器、記錄儀和全系統(tǒng)是例如從Applied Biosystems (Foster City, CA)、Bio-RadLaboratories, Inc.(Hercules, CA)和 Amersham Biosciences,Inc.(Piscataway, NJ)得至|J。色譜材料(包括但不限于交換基質(zhì)材料、媒質(zhì)和緩沖液)也是從所述公司得到。
[0244]可使用專用設備(諸如泵)更快速的實現(xiàn)本文所述的柱色譜方法中的平衡和其它步驟(諸如洗漆和洗提)。市售泵包括(但不限于)H1LOALH: Pump P_50、Peristaltic PumpP-1> Pump P-901 和 Pump P-90 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)0
[0245]部分收集器的實例包括RediFrac Fraction Collector、FRAC-1OO 和FRAC-200Fraction Collectors 和 SUPERFRAC? Fraction Collector (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ)。也可用混合機以形成pH值和線性濃度梯度。市售混合機包括 Gradient Mixer GM-1 和 In-Line Mixer (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)。
[0246]可使用任何市售監(jiān)測器監(jiān)測色譜過程?？墒褂盟霰O(jiān)測器搜集類似UV、pH值和傳導率等信息。監(jiān)測器的實例包括Monitor UV-U U VICORDS.S I1、Monitor UV-MI1、Monitor UV-900、Monitor UPC-900、Monitor pH/C-900 和 Conductivity Monitor(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)。實際上，全系統(tǒng)為市售，包括 AmershamBiosciences (Piscataway, NJ)的各種 A K TA?.系統(tǒng)。[0247]例如，在本發(fā)明的一個實施例中，可通過首先以尿素使所得純hGH多肽變性，隨后在適當PH值下于含有還原劑(諸如DTT)的TRIS緩沖液中進行稀釋來使hGH多肽還原和變性。在另一實施例中，hGH多肽是在介于約2M到約9M之間的濃度范圍內(nèi)的尿素中變性，隨后在約5.0到約8.0的范圍內(nèi)的pH值下于TRIS緩沖液中進行稀釋。接著，可培育本實施例中的再折疊混合物。在一實施例中，在室溫下培育再折疊混合物四小時到二十四小時。接著，可進一步分離或純化經(jīng)還原和變性的hGH多肽混合物。[0248]如本文所述，可調(diào)節(jié)第一 hGH多肽混合物的pH值，隨后執(zhí)行任何隨后的分離步驟。此外，可使用此項技術中已知的技術濃縮第一 hGH多肽混合物或其任何隨后的混合物。而且，可使用所屬領域技術人員已知的技術以適于下一分離步驟的緩沖液交換包含第一 hGH多肽混合物或其任何隨后混合物的洗提緩沖液。
[0249]離子交換色譜可執(zhí)行離子交換色譜。一般參看
I on Exchange CHEOMATOgeaphy.Principles
AND Methods (目錄編號 18-1114-21，Amersham Biosciences (Piscataway，NJ))。市售離子交換柱包括 H1TRAP.?、HIPREP? 和 HILOAD? Columns (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ)□所述柱利用強陰離子交換劑，諸如Q SEPHAROSE FastFlow、Q SEPHAROSE? High Performance 和 Q SEPHAROSE? XL ;強陽離子交換劑，諸如 SP SEPHAROSE? High Performance.SP SEPHAROSE? Fast Flow 和 SPSEPHAROSE? XL ；弱陰離子交換劑，諸如DEAE SEPHAROSE? Fast Flow ;和弱陽離子交換劑，諸如 CM SHPf iAR0Sn:ii Fast FlowCAmersham Biosciences, Piscataway, NJ)0 可在純化工藝的任何階段對hGH多肽執(zhí)行陰離子或陽離子交換柱色譜以實質(zhì)分離純hGH多肽。
[0250]可使用任何適當?shù)年栯x子交換基質(zhì)執(zhí)行陽離子交換色譜步驟。有用的陽離子交換基質(zhì)包括(但不限于)纖維狀、多孔、非多孔、微粒狀、珠狀或交聯(lián)陽離子交換基質(zhì)材料。所述陽離子交換基質(zhì)材料包括(但不限于)纖維素、瓊脂、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何前述材料的復合物。
[0251]陽離子交換基質(zhì)可為任何適當?shù)年栯x子交換劑，包括強和弱陽離子交換劑。強陽離子交換劑可在寬PH值范圍內(nèi)保持離子化，且因此能夠在寬pH值范圍內(nèi)與hGH結合。然而，弱陽離子交換基可隨pH值的變化而失去離子化作用。舉例而言，當pH值降到約pH4或PH5以下時，弱陽離子交換劑可失去電荷。適當強陽離子交換劑包括(但不限于)帶電官能團，諸如磺丙基(SP)、磺酸甲酯(S)或磺乙基(SE)。陽離子交換基質(zhì)可為具有在約2.5到約6.0內(nèi)的hGH結合pH值范圍的強陽離子交換劑?；蛘?，強陽離子交換劑可具有在約pH2.5到約pH5.5內(nèi)的hGH結合pH值范圍。陽離子交換基質(zhì)可為具有約3.0的hGH結合pH值的強陽離子交換劑。或者，陽離子交換基質(zhì)可為具有在約6.0到約8.0內(nèi)的hGH結合pH值范圍的強陽離子交換劑。陽離子交換基質(zhì)可為具有在約8.0到約12.5內(nèi)的hGH結合pH值范圍的強陽離子交換劑。或者，強陽離子交換劑可具有在約PH8.0到約pH12.0內(nèi)的hGH結合pH值范圍。
[0252]裝載hGH之前，例如可使用若干柱體積稀弱酸(例如，4柱體積20mM乙酸，pH3)平衡陽離子交換基質(zhì)。平衡后，可加入hGH并且可洗滌柱I次到數(shù)次，隨后也使用弱酸溶液(諸如弱乙酸或磷酸溶液)實質(zhì)完全洗提純hGH。舉例而言，可使用約2-4柱體積20mM乙酸(PH3)洗滌柱。例如使用2-4柱體積0.05M乙酸鈉(ρΗ5.5)或與0.1M氯化鈉混合的0.05Μ乙酸鈉(pH5.5)進行的額外洗滌也可使用?；蛘?使用此項技術中已知的方法,可使用若干柱體積稀、弱堿平衡陽離子交換基質(zhì)。
[0253]另外，可通過使陽離子交換劑基質(zhì)與具有足夠低pH值或離子強度以從基質(zhì)中置換出hGH的緩沖液接觸來洗提實質(zhì)純的hGH。洗提緩沖液的pH值可在約pH2.5到約pH6.0的范圍內(nèi)。更具體的說，洗提緩沖液的pH值可在約pH2.5至約pH5.5，約pH2.5至約pH5.0范圍。洗提緩沖液可具有約3.0的pH值。另外，洗提緩沖液的量可廣泛變化，并且一般將在約2至約10柱體積的范圍內(nèi)。此外，所屬領域技術人員已知的合適緩沖液可包括(但不限于)濃度在至少約5mM到至少約IOOmM的范圍內(nèi)的檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、HEPES和MES緩沖液。
[0254]將hGH吸附到陽離子交換劑基質(zhì)上后，可通過使所述基質(zhì)與具有足夠高pH值或離子強度以從所述基質(zhì)中置換出hGH的緩沖液接觸來洗提實質(zhì)純的hGH。洗提緩沖液的pH值可在約pH8.0到約pH12.5的范圍內(nèi)。更具體說來，洗提緩沖液的pH值可在約pH8.0到約PH12.0的范圍內(nèi)。用于高pH值洗提實質(zhì)純的hGH的適當緩沖液包括(但不限于)濃度在至少約5mM到至少約IOOmM的范圍內(nèi)的檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、HEPES和MES緩沖液。此外，可使用具有0.1M硼酸鉀、0.6M氯化鉀、0.1MEDTA的緩沖液，pH8.7。也可使用標準緩沖液洗提實質(zhì)純的hGH，諸如二甘氨酸緩沖液，其包括約50到IOOmM 二甘氨酸、約75mM 二甘氨酸；25到約IOOmM氯化鈉、約50mM氯化鈉；和約0.05到約0.5mM EDTA,約0.1mM EDTA(ρΗ7.5)。
[0255]反相色譜可遵循所屬領域技術人員已知的適當方案執(zhí)行RP-HPLC以純化蛋白質(zhì)。例如參看Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982) 124:217-230(1982) ;Rivier 等人，J.CHR0M.(1983)268:112-119 ；Kunitani 等人，J.CHR0M.(1986)359:391-402?？蓪?hGH 多肽執(zhí)行RP-HPLC以分離出實質(zhì)純的hGH多肽。就此點看來，可使用具有具多種長度的烷基官能團的
二氧化硅衍生化樹脂，包括(但不限于)至少約C3到至少約C3tl、至少約C3到至少約C2tl或至少約C3到至少約C18樹脂?；蛘?可使用聚合樹脂。舉例而言,可使用TosoHaas AmberchromeCGlOOOsd樹脂，其為苯乙烯聚合物樹脂。也可使用具有多種烷基鏈長度的氰基或聚合樹脂。此外，可以諸如乙醇的溶劑洗滌RP-HPLC柱。Source RP柱為RP-HPLC柱的另一實例。
[0256]可使用含有離子配對劑和有機改性劑(諸如甲醇、異丙醇、四氫呋喃、乙腈或乙醇)的適當洗提緩沖液以從RP-HPLC柱中洗提出hGH多肽。最常用的離子配對劑包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基銨、四丁基銨和三乙基乙酸銨。可使用一種或一種以上優(yōu)選用于減少分離時間和減小峰寬的梯度或與梯度條件相當?shù)臈l件執(zhí)行洗提。另一種方法涉及使用兩種具有不同溶劑濃度范圍的梯度。本文中使用的適當洗提緩沖液的實例包括(但不限于)乙酸銨和乙腈溶液。
[0257]可例如使用SOURCE RP柱以乙腈梯度分離或純化hGH。
[0258]疏水相互作用色譜純化技術可對hGH多肽執(zhí)行疏水相互作用色譜(HIC)。一般參看 Hydrctobic Interaction Chrqmatqgeaphy Handb00K.Principles and MEraQDS (Cat.N0.18_1020_90, AmershamBiosciences (Piscataway, NJ),所述文獻是以引用的方式并入本文中。適當HIC基質(zhì)可包括(但不限于)經(jīng)烷基或芳基取代的基質(zhì)，諸如經(jīng)丁基、己基、辛基或苯基取代的基質(zhì)，包括瓊脂、交聯(lián)瓊脂、瓊脂糖、纖維素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基質(zhì)；和混合型樹脂，包括(但不限于)聚乙二胺樹脂或經(jīng)丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)樹脂。疏水相互作用柱色譜的市售來源包括(但不限于)HITiRAP?、HIPREP?和HI LOAD ?柱(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)。
[0259]簡單說來，裝載前，可使用所屬領域技術人員已知的標準緩沖液(諸如乙酸/氯化鈉溶液或含有硫酸銨的HEPES)平衡HIC柱?？蓪⒘蛩徜@用作裝載HIC柱的緩沖液。裝載hGH多肽后，可使用標準緩沖液和條件洗滌所述柱以去除HIC柱上不合需要的物質(zhì)但剩下hGH多肽?？捎眉s3到約10柱體積的標準緩沖液洗提hGH多肽，所述緩沖液諸如含有EDTA和濃度比平衡緩沖液低的硫酸銨的HEPES緩沖液，或乙酸/氯化鈉緩沖液等。例如使用磷酸鉀梯度降低線性鹽梯度也可用于洗提hGH分子。接著，可例如通過過濾(諸如透濾或超濾)濃縮洗提液?？衫猛笧V去除用于洗提hGH多肽的鹽。
[0260]可例如使用凝膠過濾(GelFILTRATION:PRINCIPLES AND Methods(Cat.N0.18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ,所述文獻是以引用的方式并入本文)、羥基磷灰石色譜(適當基質(zhì)包括(但不限于)HA-Ultrogel, High Resolution(Calbiochem)、CHT 陶瓷羥基憐灰石(BioRad)、Bio-Gel HTP 羥基憐灰石(BioRad))、HPLC、膨脹床吸附、超濾、透濾、凍干和其類似方法對第一 hGH多肽混合物或其任何隨后的混合物執(zhí)行分離步驟，以去除任何過量的鹽并且以用于下一分離步驟或甚至最終藥物產(chǎn)物配方的適當緩沖液置換所述緩沖液。
[0261]可使用所屬領域技術人員已知的技術在本文所述的各步驟處監(jiān)測hGH多肽(包括實質(zhì)純的hGH多肽)的產(chǎn)量。也可在最后的分離步驟時使用所述技術評定實質(zhì)純的hGH多肽的產(chǎn)量。舉例而言，可使用數(shù)個具有多種烷基鏈長度的反相高效液相色譜柱(諸如氰基RP-HPLC, C18RP-HPLC)以及陽離子交換HPLC和凝膠過濾HPLC監(jiān)測hGH多肽的產(chǎn)量。
[0262]純度可使用諸如SDS-PAGE的標準技術或通過使用蛋白印跡法(Western blot)和ELISA檢定測量hGH多肽來予以測定。舉例而言，可產(chǎn)生對抗由陰性對照酵母發(fā)酵和陽離子交換回收分離出的蛋白質(zhì)的多克隆抗體。也可使用抗體探查污染宿主細胞蛋白質(zhì)的存在。
`[0263]RP-HPLC材料Vydac C4 (Vydac)是由二氧化硅凝膠顆粒組成，其表面具有C4烷基鏈。hGH多肽與蛋白質(zhì)雜質(zhì)的分離是基于疏水相互作用強度的差異。洗提是以稀三氟乙酸中的乙腈梯度執(zhí)行。制備型HPLC是使用不銹鋼柱(填充有2.8到3.2升Vydac C4硅膠)執(zhí)行。通過加入三氟乙酸酸化羥基磷灰石Ultrogel洗出液并將其裝載于Vydac C4柱。就洗滌和洗提而言，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集洗提餾分并立即以磷酸鹽緩沖液進行中和。匯集IPC界限內(nèi)的hGH多肽部分。
[0264]DEAE瓊脂糖(GE Healthcar)材料是由與瓊脂糖珠粒表面共價結合的二乙胺基乙基(DEAE)組成。hGH多肽與DEAE基團的結合是通過離子相互作用介導。乙腈和三氟乙酸穿過柱而無保留。已洗去這些物質(zhì)后，通過用低PH值下的乙酸鹽緩沖液洗滌柱去除痕量雜質(zhì)。接著，用中性磷酸鹽緩沖液洗滌柱，并且用具有增加的離子強度的緩沖液洗提hGH多肽。以DEAE瓊脂糖的快速流動壓緊柱。調(diào)節(jié)柱體積以確保hGH多肽裝載量在每毫升凝膠3-10mg hGH多肽的范圍內(nèi)。用水和平衡緩沖液(磷酸鈉/磷酸鉀)洗滌柱。裝載所匯集的HPLC洗出液餾分，并用平衡緩沖液洗滌柱。接著，用洗滌緩沖液(乙酸鈉緩沖液)洗滌隨后用平衡緩沖液洗滌柱。隨后，以洗提緩沖液(氯化鈉、磷酸鈉/磷酸鉀)從柱中洗提出hGH多肽，并且根據(jù)主要洗提概況收集單一洗提餾分。將DEAE瓊脂糖柱洗出液調(diào)到指定的傳導率。將所得藥物無菌過濾到特氟綸瓶(Teflon bottle)中并在-70°C下儲存。[0265]可使用的其它方法包括(但不限于)去除內(nèi)毒素的步驟。內(nèi)毒素為一種位于革蘭氏陰性宿主細胞(諸如大腸桿菌)外膜上的脂多糖(LPS)。用于減少內(nèi)毒素含量的方法已為所屬領域技術人員所知，且包括(但不限于)使用二氧化硅支撐體、玻璃粉或羥基磷灰石的純化技術、反相色譜、親和色譜、尺寸排阻色譜、陰離子交換色譜、疏水相互作用色譜、這些方法的組合和其類似方法?？赡苄枰揎椈蝾~外方法將污染物(諸如共遷移蛋白)從所需多肽中去除。用于測量內(nèi)毒素含量的方法已為所屬領域技術人員所知，且包括(但不限于)鱟變形細胞溶解產(chǎn)物(Limulus Amebocyte Lysate, LAL)檢定。
[0266]可使用多種方法和程序評定包含一種或一種以上非天然編碼的氨基酸的hGH蛋白的產(chǎn)量和純度，所述方法和程序包括(但不限于)Bradford檢定、SDS-PAGE、銀染色SDS-PAGE、考馬斯染色 SDS-PAGE (coomassie stained SDS-PAGE)、質(zhì)譜(包括但不限于MALD1-T0F)和所屬領域技術人員已知的表征蛋白質(zhì)的其它方法。其它方法包括(但不限于):與蛋白質(zhì)染色方法偶聯(lián)的SDS-PAGE、免疫印跡、基質(zhì)輔助激光解吸/電離-質(zhì)譜法(MALD1-MS)、液相色譜/質(zhì)譜、等電聚焦、分析型陰離子交換、色譜聚焦和圓二色譜法。
[0267]也可將包括(但不限于)本文所列的有關分離和純化的程序用于配方研究中，以評定本發(fā)明hGH多肽的穩(wěn)定性、PEG化形式hGH多肽的穩(wěn)定性和PEG化反應的進程。
[0268]VI1.交替系統(tǒng)中的表達
[0269]已使用數(shù)種策略將非天然氨基酸引入非重組宿主細胞、經(jīng)突變誘發(fā)的宿主細胞或無細胞系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)中。這些系統(tǒng)也適用于制造包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽。以反應側鏈使氨 基酸(諸如Lys、Cys和Tyr)衍生化將導致賴氨酸轉化成N2-乙?；?賴氨酸?；瘜W合成也提供一種用于并入非天然氨基酸的簡單方法。隨著近來對于肽片段的酶連接和天然化學連接研究的發(fā)展，可能制造出較大蛋白質(zhì)。例如參看P.E.Dawson 和 S.B.H.Kent, Annu.Rev.Biochem.69:923 (2000)。以化學方法妝連接和天然化學連接已描述于美國專利第6，184，344號、美國專利公開案第2004/0138412號、美國專利公開案第2003/0208046號、W002/098902和W003/042235中，所述專利都是以引用的方式并入本文中。已使用將經(jīng)所需非天然氨基酸化學酰基化的抑制物tRNA加入能夠支持蛋白質(zhì)生物合成的活體外提取物中的通用活體外生物合成方法將超過100個非天然氨基酸位點特異性并入具有實際任何尺寸的多種蛋白質(zhì)中。例如參看V.ff.Cornish, D.Mendel 和 P.G.Schultz, Angew.Chem.1nt.Ed.Engl., 1995, 34:621 (1995) ；CJ.Noren, SJ.Anthony-Cahill, M.C.Griffith, P.G.Schultz, A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins, Science244:182-188 (1989)；和 J.D.Bain, C.G.Glabe, T.A.Dix, A.R.Chamberlin, E.S.Diala, Biosyntheticsite-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide.1.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已將廣泛多種官能團引入蛋白質(zhì)中以供有關蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)折疊、酶機制和信號轉導的研究。
[0270]已研究出一種稱為選擇性壓力并入的活體內(nèi)方法來開發(fā)混雜的野生型合成酶。例如參 M N.Budisa, C.Minks, S.Alefelder, ff.Wenger, F.M.Dong, L.Moroder
R.Huber, FASEBJ., 13:41 (1999)。使向細胞供應特定天然氨基酸的相關代謝途徑已切斷的營養(yǎng)缺陷型菌株生長于含有有限濃度天然氨基酸的基本培養(yǎng)基中，同時阻遏目標基因的轉錄。穩(wěn)定生長期開始時，耗盡天然氨基酸并以非天然氨基酸類似物加以置換。誘導表達重組蛋白將導致含有非天然氨基酸類似物的蛋白質(zhì)的積累。舉例而言，使用這一策略，已將鄰-、間-和對氟代苯丙氨酸引入蛋白質(zhì)中并且在UV光譜中展現(xiàn)出易于鑒別的兩個特征性峰肩，例如參看 C.Minks, R.Huber, L.Moroder 和 N.Budisa, Anal.Biochem., 284:29 (2000)；已使用三氟甲硫胺酸置換噬菌體T4溶菌酶中的甲硫氨酸，以通過19F NMR研究其與殼低聚糖配體的相互作用，例如參看 H.Duewel, E.Daub, V.Robinson 和 J.F.Honek, Biochemistry,36:3404(1997);并且已并入三氟亮氨酸替代亮氨酸，從而使亮氨酸拉鏈蛋白的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性增加。例如參看 Y.Tang, G.Ghirlanda, ff.A.Petka, T.Nakajima, ff.F.DeGrado和 D.A.Tirrell, Angew.Chem.1nt.Ed.Engl., 40:1494 (2001)。此外，將硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各種重組蛋白中將會便利對X射線晶體學中各相的解答。例如參看ff.A.Hendrickson, J.R.Horton 和 P.M.Lemaster, EMBO Τ..9:1665 (1990) ； J.0.Boles, Κ.Lewinski, M.Kunkle, J.D.0dom, B.Dunlap, L.Lebioda 和 M.Hatada, Nat.Struct.Biol..1: 283 (1994) ；N.Budisa, B.Steipe, P.Demange, C.Eckerskorn, , J.Kellermann 和R.Huber, Eur.T.Biochem., 230:788 (1995)；和 N.Budisa, ff.Karnbrock, S.Steinbacher, A.Humm, L.Prade, T.Neuefeind, L.Moroder 和 R.Huber, T.Mol.Biol., 270:616 (1997)。也已有效并入具有烯或炔官能團的甲硫氨酸類似物，從而允許通過化學方式對蛋白質(zhì)進行額外修飾。例如參看 J.C.van Hest 和 P.A.Tirrell.FEBS Lett..428:68(1998) ；J.C..vanHest.K.L.Kiick 和 D.A.Tirrell, T.Am.Chem.Soc.122:1282(2000);和1(丄.Kiick and D.A.Tirrell, Tetrahedron, 56:9487(2000);美國專利第 6, 586, 207 號；美國專利公開案2002/0042097，所述專利文獻都是以引用的方式并入本文中。
[0271]本方法的成就將視氨?；鵷RNA合成酶對非天然氨基酸類似物的識別而定，總的說來，這需要高選擇性來確保蛋白質(zhì)翻譯的保真性。一種擴大本方法的范疇的方式為放松氨?；鵷RNA合成酶的底物特異性，這已在有限數(shù)量的情況下達成。舉例而言，在大腸桿菌苯丙胺?；鵷RNA合成酶(PheRS)的情況下以Gly置換Ala29將增加底物結合口袋的尺寸，并且引起對氯苯丙氨酸(P-Cl-Phe)對tRNAPhe的酰基化作用。參看M.1bba, P.Kast和H.Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994)。具有此突變體PheRS的大腸 桿菌菌株允許并入對氯苯丙氨酸或?qū)︿灞奖彼醽硖娲奖彼?。例如參看M.1bba和H.Hennecke, FEBSLett., 364: 272 (1995)；和 N.Sharma, R.Furter, P.Kast and P.A.Tirrel I, FEBSLett.，467:37 (2000)。類似地，已證實鄰近大腸桿菌酪胺酰tRNA合成酶的氨基酸結合位點處的點突變Phel30Ser使重氮酪氨酸能夠比酪氨酸有效地并入。參看F.Hamano-Takaku, T.1wama, S.Saito-Yano, K.Takaku, Y.Monden, M.Kitabatake, D.Soil and S.Nishimura, Τ.Biol.Chem..275:40324(2000)。
[0272]在活體內(nèi)將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中的另一種策略為修飾具有校對機制的合成酶。這些合成酶無法區(qū)分且因此活化在結構上與同類天然氨基酸類似的氨基酸。這一錯誤在單獨位點處經(jīng)校正，其使來自tRNA的錯誤氨基酸脫?；员３值鞍踪|(zhì)翻譯的保真度。如果喪失合成酶的校對活性，那么錯誤活化的結構類似物可逃離編輯功能并且被并入。近來已以纟顏氨?；鵷RNA合成酶(ValRS)證實這一方法。參看V.Doring, H.D.Mootz, L.A.Nangle, T.L.Hendrickson, V.de Crecy-Lagard, P.Schimmel 和 P.Marliere; Science, 292:501 (2001)。ValRS可以Cys、Tyr或氨基丁酸(Abu)錯誤氨?；痶RNAVal ;隨后，這些非同類的氨基酸經(jīng)編輯結構域水解。隨機突變誘發(fā)大腸桿菌染色體后，選擇在ValRS的編輯位點中具有突變的突變體大腸桿菌菌株。這一編輯缺陷型ValRS錯誤地將Cys裝于tRNAVal上。由于Abu在空間上與Cys類似(Cys的-SH基團經(jīng)Abu中的-CH3置換)，故當這一突變體大腸桿菌菌株在Abu存在下生長時，突變體ValRS也將Abu并入蛋白質(zhì)中。質(zhì)譜分析表明，在天然蛋白質(zhì)的各纈氨酸位置處約24%的纈氨酸經(jīng)Abu置換。
[0273]固相合成和半合成方法也已允許合成大量含有新穎氨基酸的蛋白質(zhì)。舉例而言，參看本文引用的以下公開案和參考文獻，如下所述:Crick, F.H.C.，Barrett, L.Brenner,S.Watts-TobinjR.General nature of the genetic code for proteins.Nature,192:1227-1232(1961) ;Hofmann，K.，Bohn, H.Studies on polypeptides.XXXV1.The effect of pyrazoIe-1midazole replacements on the S—protein activatingpotency of an S-peptide fragment，J.Am Chem，88 (24):5914-5919 (1966) ；Kaiser,E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins includingenyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54(1989) ;Nakatsuka，T.，Sasaki, T.，Kaiser, E.T.Peptidesegment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin，J AmChem Soc，109:3808-3810 (1987) ；Schnolzer, M., Kent,S B H.Constructing proteinsby dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIV protease,Science,256 (5054):221-225 (1992) ;Chaiken，1.M.Semisynthetic peptidesand proteins,CRC Crit Rev Biochem,11 (3):255-301 (1981) ;Offord，R.E.Proteinengineering by chemical means ? Protein Eng.，I (3):151-157(1987);和 Jackson，D.Y.,Burnierj J., Quanj Cj Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A.A Designed Peptide Ligase forTotal Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues，Science，266(5183):243(1994)。
[0274]已使用化學修飾在活體外將包括輔助因子、自旋標記和寡核苷酸的多種非天然側鏈引入蛋白質(zhì)中。例如參看 Corey，D.R.，Schultz，P.G.Generation of a hybridsequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403(1987) ；Kaiser, E. T., Lawrence D.S., Rokitaj S.E.The chemical modificationof enzymatic specificity，Annu Rev Biochem，54:565-595 (1985) ；Kaiser, E.T.，Lawrence, D.S.Chemical mutation ofenyzme active sites,Science, 226(4674):505-511 (1984) ；Neet, K.E., Nanci A, Koshlandj D.E.Properties of thiol-subtilisin，J_Biol.Chem，243 (24):6392-6401 (1968) ；Polgar, L.et M.L.Bender.A new enzymecontaining a synthetically formed active site.Tliiol-subtilisin.J.Am ChemSoc.88:3153-3154 (1966)；和 Pollack, SJ., Nakayamaj G.Schultz, P.G.1ntroduction ofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites，Science，242 (4881):1038-1040 (1988)o
[0275]另外，已使用使用化學方法修飾氨?；鵷RNA的生物合成方法將數(shù)個生物物理探針并入活體外合成的蛋白質(zhì)中。參看以下專利文獻中所引用的以下公開案和參考文獻:Brunner，J.New Photolabeling and crosslinking methods，Annu.RevBiochem, 62:483-514(1993) jflKrieg，U.C.，Walter, P.，Hohnsonj A.E.Photocrosslinldngof the signal sequence of nascent preprolactin of the54~kilodalton polypeptideof the signal recognition particle，Proc.Natl.Acad.Sci，83(22):8604-8608(1986)。[0276]先前已證實，可通過將經(jīng)化學方法氨酰基化的抑制物tRNA加入經(jīng)含有所需琥珀無義突變的基因程式設計的蛋白質(zhì)合成反應中，在活體外將非天然氨基酸位點特異性并入蛋白質(zhì)中。使用這些方法，使用對特定氨基酸具營養(yǎng)缺陷的菌株，可以結構類似的同源物取代20種常見氨基酸中的多種氨基酸，例如以氟代苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參看Noren，C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G.A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins,Science, 244:182-188(1989) ；M.ff.Nowak 等人，Science268:439-42 (1995) ；Bain, J.D.，Glabe, C.G.，Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of anon-natural amino acid into a polypeptide, T.Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)；N.Budisa 等人,FASEB Τ.13:41-51 (1999) ；Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S.,Noren, C.J., Schultz, P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural aminoacids site-specifically into proteins.Methods in Enz,,第 202 卷，301-336 (1992)；和 Mendel,D.，Cornish, V.W.&Schultz, P.G.Site-Directed Mutagenesis with anExpanded Genetic Code, Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24, 435-62(1995)。
[0277]舉例而言，制備識別終止密碼子UAG的抑制物tRNA，并且用非天然氨基酸以化學方法使其氨?；Ｊ褂贸Ｒ?guī)定點突變誘發(fā)將終止密碼子TAG引入蛋白質(zhì)基因中的所需位點處。例如參看 Sayers, J.R., Schmidt, ff.Eckstein, F.5’ _3’ Exoniicleasesin phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis.Nucleic AcidsRes, 16(3):791-802(1988)。當將?；种莆飔RNA和突變體基因組合于活體外轉錄/翻譯系統(tǒng)中時，對UAG密碼子起反應并入非天然基酸，從而提供在特定位置處含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)。使用[3H]-Phe進行的實驗和以α羥基酸進行的實驗證實，僅所需氨基酸被并入UAG密碼子指定的位置處，且并未將這一氨基酸并入蛋白質(zhì)中的任何其它位點。例如參看Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003) Nature StructuralBiologylO(6):425-432 ；和 Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz,P.G.Site-specificincorporation of novel backbone structures into proteins, Science.255 (5041):197-200(1992)。
`[0278]可通過任何方法或技術(包括但不限于，化學或酶氨?；椒?以所需氨基酸使tRNA氨酰基化。
[0279]氨?；赏ㄟ^氨?；鵷RNA合成酶或其它酶分子(包括但不限于，核糖酶)實現(xiàn)。術語“核糖酶”可與“催化型RNA”互換使用。Cech和其同事(Cech, 1987，Science, 236:1532-1539 ;McCorkle 等人，1987, Concepts Biochem.64:221-226)證實可充當催化劑(核糖酶)的天然存在的RNA的存在。然而，盡管僅已證實這些天然RNA催化劑對用于裂解和剪切的核糖核酸底物起作用，但近期有關人工核糖酶進展的研究已擴大對各種化學反應的催化作用的型式。相關研究已鑒別出可催化其自身(2’)3’末端的氨?；鵕NA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science267:643-647)和可將氛基酸從一個RNA分子轉移到另一 RNA 分子的 RNA 分子(Lohse 等人，1996，Nature381:442-444)。
[0280]美國專利申請公開案2003/0228593 (其是以引用的方式并入本文)描述構建核糖酶的方法和其對于用天然編碼的氨基酸和非天然編碼的氨基酸氨?；痶RNA的用途?？墒箃RNA氨酰基化的底物固定形式的酶分子(包括但不限于，核糖酶)能夠有效地親和純化氨?；a(chǎn)物。適當基質(zhì)的實例包括瓊脂、瓊脂糖和磁珠。供氨?；饔玫牡孜锕潭ㄐ问降暮颂敲傅闹圃旌陀猛疽衙枋鲇贑hemistry and Biology2003, 10:1077-1084和美國專利申請公開案2003/0228593中，所述專利文獻是以引用的方式并入本文。
[0281] 化學氨酰基化方法包括(但不限于)由Hecht和其同事(Hecht, S.M.Ace.Chem.Res.1992, 25, 545 ；Heckler, T.G.; Roesser, J.R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S.M.Biochemistryl988, 27, 7254 ；Hecht, S.M.; Alford, B.L.; Kuroda, Y.; Kitano, S.J.Biol.Chem.1978, 253, 4517)和 Schultz,Chamberlin, Dougherty 等(Cornish, V.ff.; Mendel, D.; Schultz, P.G.Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.1995, 34, 621 ；Robertson, S.A.; El lman, J.A.; Schultz, P.G.J.Am.Chem.Soc.1991, 1 13, 2722 ；Noren, C.J.; Anthony-Cahill, S.J.;Griffith, M.C; Schultz, P.G.Sciencel989, 244, 182 ；Bain, J.D.; Glabe, C.G.; Dix, T.A.; Chamberlin, A.R.J.Am.Chem.Soc.1989, 111，8013 ；Bain, J.D.等人 Naturel992, 356，537 ；Gallivan, J.P.; Lester, H.A.; Dougherty, D.A.Chem.Biol.1997，4，740 ;Turcatti 等 A J.Biol.Chem.1996, 271, 19991 ；Nowak, M.ff.等人Science, 1995，268，439 ；Saks, Μ.E.等人 J.Biol.Chem.1996，271，23169 ；Hohsaka, T.等人J.Am.Chem.Soc.1999，121，34)提出的方法，所述參考文獻是以引用的方式并入本文中，所述方法避免使用氨酰基合成酶。所述方法或其它化學氨?；椒捎糜谑箃RNA分子氨?；?br> [0282]用于產(chǎn)生催化性RNA的方法可涉及產(chǎn)生單獨隨機核糖酶序列池；對所述池執(zhí)行定向進化；針對所需氨?；钚院Y選所述池；和選擇那些展現(xiàn)所需氨酰基化活性的核糖酶的序列。
[0283]核糖酶可包含便利?；钚缘幕?或區(qū)域，諸如GGU基元和富含U的區(qū)域。舉例而言，據(jù)報導，富含U的區(qū)域可便利識別氨基酸底物，且GGU基元可與tRNA3’末端形成堿基配對?？偟恼f來，GGU基元和富含U的區(qū)域便利同時識別氨基酸與tRNA，且由此便利使tRNA3’端氨?；?。
[0284]可通過使用與tRNAAsn CCCG接合的部分隨機化r24mini進行活體外選擇，隨后系統(tǒng)性工程設計見于活性克隆中的一致序列來產(chǎn)生核糖酶。由本方法獲得的示范性核糖酶稱為“Fx3核糖酶”且描述于美國公開申請案第2003/0228593號中，所述專利的內(nèi)容是以引用的方式并入本文，所述核糖酶充當合成具有同類非天然氨基酸的各種氨?；鵷RNA的通用催化劑。
[0285]可使用固定于底物上以有效親和純化氨酰基tRNA。適當?shù)孜锏膶嵗?但不限于)瓊脂、瓊脂糖和磁珠?？衫肦NA的化學結構將核糖酶固定于樹脂上，諸如，可以高碘酸鹽氧化RNA的核糖上的3’ -順式-二醇以得到相應二醛以便利將RNA固定于樹脂上。可使用各類樹脂，包括廉價酰肼樹脂，其中還原氨化使得樹脂與核糖酶之間以不可逆連接相互作用?？赏ㄟ^柱上氨?；夹g(on-column aminoacylation technique)顯著便利氨?；鵷RNA的合成。Kourouklis等人Methods2005; 36:239-4描述基于柱的氨?；到y(tǒng)。
[0286]可以多種方式實現(xiàn)氨酰基化tRNA的分離。一種適當方法為用緩沖液從柱中洗提出氨酰基tRNA，所述緩沖液諸如具有IOmM EDTA的乙酸鈉溶液、含有50mM N_(2_羥乙基)哌嗪4’-(3-丙烷磺酸)、12.5禮KCl (pH7.0)、10mM EDTA的緩沖液或簡單地經(jīng)EDTA緩沖的水(ρΗ7.0)。[0287]可將氨?；痶RNA加入翻譯反應中以便將使tRNA氨?；陌被岵⑷敕g反應所制造的多肽中選擇的位置中?？墒褂帽景l(fā)明的氨酰基化tRNA的翻譯系統(tǒng)的實例包括(但不限于)細胞溶解產(chǎn)物。細胞溶解產(chǎn)物提供從輸入的mRNA活體外翻譯多肽必需的反應組份。所述反應組份的實例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始因子和延長因子和與翻譯有關的其它因子。此外，翻譯系統(tǒng)可為批量翻譯或區(qū)域化翻譯。批量翻譯系統(tǒng)將反應組份組合于單一隔室中，而區(qū)域化翻譯系統(tǒng)使翻譯反應組份與可抑制翻譯效率的反應產(chǎn)物分離。所述翻譯系統(tǒng)為市售。
[0288]另外，可使用偶聯(lián)的轉錄/翻譯系統(tǒng)。偶聯(lián)的轉錄/翻譯系統(tǒng)允許將輸入DNA轉錄成對應的mRNA，其接著經(jīng)反應組份翻譯。市售偶聯(lián)轉錄/翻譯的實例為快速翻譯系統(tǒng)(Rapid Translation System) (RTS, Roche Inc.)。所述系統(tǒng)包括含有提供翻譯組份(諸如核糖體和翻譯因子)的大腸桿菌溶解產(chǎn)物的混合物。此外，還包括RNA聚合酶以將輸入的DNA轉錄成供翻譯使用的mRNA模板。RTS可使用借助插入到反應隔室(包括供應/廢物隔室和轉錄/翻譯隔室)之間的膜區(qū)域化的反應組份。
[0289]tRNA的氨?；梢云渌噭﹫?zhí)行，所述試劑包括(但不限于)轉移酶、聚合酶、催化抗體、多功能蛋白和其類似物。
[0290]Lu等人于Mol Cell.200110月；8 (4): 759-69中描述一種以化學方式使蛋白質(zhì)與
含有非天然氨基酸的合成肽連接的方法(表達蛋白連接)。
[0291]也已使用微注射技術將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參看M.W.Nowak，P.C.Kearney, J.R.Sampson, Μ.E.Saks, C.G.Labarca, S.K.Silverman, ff.G.Zhong, J.Thorson, J.N.Abelson, N.Davidson, P.G.Schultz, D.A.Dougherty and H.A.Lester, Science, 268:439(1995)；和 D.A.Dougherty, Curr.0pin.Chem.Biol., 4:645 (2000)。將爪蟾卵母細胞與活體外制造的兩種RNA物質(zhì)共注射:在所需氨基酸位置處編碼具有UAG終止密碼子的目標蛋白的mRNA，和經(jīng)所需非天然氨基酸氨?；溺暌种莆飔RNA。接著，將卵母細胞的翻譯機器插入由UAG指定的位置處的非天然氨基酸。本方法已允許對一般不受活體外表達系統(tǒng)作用的完整膜蛋白進行活體內(nèi)結構-功能研究。實例包括將熒光氨基酸并入速激肽神經(jīng)激肽-2受體中以通過熒光共振能量轉移測量距離，例如參看 G.Turcatti, K.Nemeth, M.D.Edgerton, U.Meseth, F.Talabot, Μ.Peitsch.T.Knowles.H.Vogel 和 A.ChoUet.T.Biol.Chem..271:19991 (1996):并入經(jīng)生物素標記的氨基酸以鑒別離子通道中表面暴露的殘基，例如參看J.P.Gallivan, H.A.Lester 和 D.A.Dougherty, Chem.Biol..4:739 (1997);使用籠鎖酪氨酸類似物以實時監(jiān)測離子通道中的構象改變，例如參看J.C.Miller, S.K.Silverman, P.M.England, D.A.Dougherty 和 H.A.Lester, Neuron, 20:619 (1998);使用 α 羥基氨基酸改變離子通道主鏈以探查其門控機制。例如參看P.M.England, Y.Zhang, D.A.Dougherty和
H.A.Lester, Cell.96:89 (1999)；和 Τ.Lu, A.Y.Ting, J.Mainland, L.Y.Jan, P.G.Schultz 和J.Yang, Nat.Neurosc1..4:239 (2001)。
[0292]在活體內(nèi)將非天然氨基酸直接并入蛋白質(zhì)中的能力提供多種益處，包括(但不限于)高突變體蛋白產(chǎn)量、技術簡便、研究細胞或可能的活有機體中的突變體蛋白的潛力和使用這些突變體蛋白作治療性治療和診斷用。將具有各種尺寸、酸度、親核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括于蛋白質(zhì)中的能力可極大擴大合理且系統(tǒng)性操縱蛋白質(zhì)結構探查蛋白質(zhì)功能與產(chǎn)生具有新穎特性的新穎蛋白質(zhì)或有機體的能力。
[0293]在有關位點特異性并入對氟苯丙氨酸的一次嘗試中，將酵母琥珀抑制物tRNAPheCUA/苯丙氨酰基tRNA合成酶對用于p-F-Phe抗性、Phe營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌菌株中。例如參看 R.Furter, Protein Sc1., 7:419 (1998)。
[0294]還可能使用無細胞(活體外)翻譯系統(tǒng)表達本發(fā)明的hGH多肽。翻譯系統(tǒng)可為細胞翻譯系統(tǒng)或無細胞翻譯系統(tǒng)，且可為原核細胞或真核生物。細胞翻譯系統(tǒng)包括(但不限于)所需核酸序列可轉錄成mRNA且所述mRNA可經(jīng)翻譯的全細胞制劑，諸如透性化細胞或細胞培養(yǎng)物。無細胞翻譯系統(tǒng)可為市售，且眾所周知許多不同的類型和系統(tǒng)。無細胞系統(tǒng)的實例包括(但不限于)原核生物溶解產(chǎn)物(諸如大腸桿菌溶解產(chǎn)物)和真核生物溶解產(chǎn)物(諸如麥芽提取物)、昆蟲細胞溶解產(chǎn)物、兔網(wǎng)織紅細胞溶解產(chǎn)物、兔卵母細胞溶解產(chǎn)物和人類細胞溶解產(chǎn)物。當所得蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化、磷酸化或另外經(jīng)修飾時，由于許多所述修飾僅可能在真核生物系統(tǒng)中，故可優(yōu)選真核生物提取物或溶解產(chǎn)物。這些提取物和溶解產(chǎn)物的一部分可為市售(Promega ;Madison, Wis.；Stratagene ；La Jolla, Calif.；Amersham ;Ar lington Heights, 111.；GIBC0/BRL ；Grand Island, N.Y.)?？捎糜诜g分泌型蛋白的膜提取物(諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)也可用。在可包括mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(活體外轉錄與翻譯的組合)的這些系統(tǒng)中，活體外合成是通過核糖體引導。已將相當多的努力致力于研究無細胞蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中。例如參看 Kim, D.M.和 J.R.Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001)；Kim, D.M.和 J.R.Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000) ；Kim, D.M.和 J.R.Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390，(2000) ；Kim, D.M.和J.R.Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188，(1999) jPPatnaik，R.andJ.R.Swartz, Biotechniques24, 862-868，(1998);美國專利第 6，337，191 號；美國專利公開案第2002/0081660號；W000/55353 ;W090/05785，所述專利文獻都是以引用的方式并入本文?？捎糜诒磉_包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的另一種方法包括mRNA-肽融合技術。例如參看 R.Roberts 和 J. Szostak, Proc.Natl Acad.Sc1.(USA) 94:12297-12302 (1997)；A.Frankel 等人，Chemistry&BiologylO: 1043-1050 (2003)。以本方法，在核糖體上將連接到嘌呤霉素的mRNA模板翻譯成肽。如果已對一種或一種以上tRNA分子進行修飾，那么也可將非天然氨基酸并入肽中。閱讀最后一個mRNA密碼子后，嘌呤霉素將俘獲肽的C端。如果在活體外檢定中發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽接合物具有引人關注的特性，那么可輕易地從mRNA序列中揭示其身份。以此方式，可篩選包含一種或一種以上非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的文庫以鑒別具有所需特性的多肽。目前，據(jù)報導，以純組份進行活體外核糖體翻譯將允許合成經(jīng)非天然編碼的氨基酸取代的肽。例如參看A.Forster等人，Proc.Natl Acad.Sc1.(USA) 100:6353(2003)。
[0295]也可使用已復水的翻譯系統(tǒng)。也已成功地使用純翻譯因子的混合物將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)以及溶解產(chǎn)物或補充有純翻譯因子的溶解產(chǎn)物的組合，所述純翻譯因子諸如起始因子-l(IF-l)、IF-2、IF-3( α或β )、延長因子T(EF-Tu)或終止因子。還可使無細胞系統(tǒng)與轉錄 / 翻譯系統(tǒng)偶聯(lián)，其中如 Current Protocols in Molecular BiologyCF.M.Ausubel等人編，Wiley Interscience, 1993)(其是以引用的方式清楚地并入本文)中所述,將DNA引入所述系統(tǒng)中，轉錄成mRNA且翻譯所述mRNA。在真核轉錄系統(tǒng)中轉錄的RNA可為異核RNA (hnRNA)或5’端帽子(7-甲基鳥苷)和3’端聚A尾成熟mRNA的形式，此可為某些翻譯系統(tǒng)的優(yōu)勢。舉例而言，在網(wǎng)織紅細胞溶解系統(tǒng)中以高效率翻譯經(jīng)封端mRNA。
[0296]VII1.與hGH多肽偶聯(lián)的大分子聚合物
[0297]對本文所述的非天然氨基酸多肽的各種修飾可使用本文所述的組合物、方法、技術和策略實現(xiàn)。這些修飾包括將其它功能性并入多肽的非天然氨基酸組份上，所述功能性包括但不限于，標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯(lián)劑、放射性核、細胞毒性化合物、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體 片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、糖類、水溶性樹枝狀高分子、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米顆粒、自旋標記、熒光團、含金屬部分、放射性部分、新穎官能團、與其它分子共價或非共價相互作用的基團、光籠鎖部分、光化輻射可激發(fā)部分、光致異構化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、并入重原子的部分、化學可裂解基團、光可裂解基團、延長的側鏈、與碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經(jīng)同位素標記部分、生物物理學探針、發(fā)磷光基團、化學發(fā)光基團、電子致密基團、磁性基團、插入基團、發(fā)色團、能量轉移劑、生物活性劑、可檢測標記、小分子、量子點、納米傳導物、放射性核苷酸、無線電傳導物、中子俘獲劑或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需化合物或物質(zhì)。作為本文所述的組合物、方法、技術和策略的例示性、非限制性實例，以下實施方式將集中于將大分子聚合物加入非天然氨基酸多肽中，且應了解本文所述的組合物、方法、技術和策略也適用于(必要時且所屬領域技術人員可針對本文的揭示內(nèi)容作出適當修改)加入其它功能性，包括但不限于上文所列的那些功能性。
[0298]多種大分子聚合物和其它分子可與本發(fā)明的hGH多肽連接以調(diào)節(jié)所述hGH多肽的生物特性，和/或向hGH分子提供新穎的生物特性?？赏ㄟ^天然編碼的氨基酸；非天然編碼的氨基酸；或天然或非天然氨基酸的任何功能性取代基；或加入天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能團使這些大分子聚合物與hGH多肽連接。聚合物的分子量可在包括(但不限于)介于約IOODa與約100，OOODa或更高分子量之間的廣泛范圍內(nèi)。聚合物的分子量可介于約IOODa與約100，OOODa之間，包括(但不限于)100, OOODa,95, OOODa,90, OOODa,85，000Da、80，000Da、75，000Da、70，000Da、65，000Da、60，000Da、55，000Da、50，OOODa、45，OOODa、40，OOODa、35，OOODa、30，OOODa、25，OOODa、20，OOODa、15，OOODa、10，OOODa、9，OOODa、8，OOODa、7，OOODa、6，OOODa、5，OOODa、4，OOODa、3，OOODa、2，OOODa、1，OOODa、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da 和 100Da。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約IOODa與50，OOODa之間。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約IOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約1，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約5，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，聚合物的分子量是介于約10，OOODa與40，OOODa之間。
[0299]本發(fā)明提供實質(zhì)同源的聚合物:蛋白質(zhì)接合物制劑。如本文所使用的“實質(zhì)同源”意思是觀察到聚合物:蛋白質(zhì)接合物分子比總蛋白質(zhì)的一半大。聚合物:蛋白質(zhì)接合物具有生物活性，且本文所提供的本“實質(zhì)同源”的PEG化hGH多肽制劑為足夠同源以展現(xiàn)同源制劑的益處(例如使臨床應用中各批制劑之間的藥代動力學易于預測)的制劑。
[0300]也可選擇制備聚合物:蛋白質(zhì)接合物分子的混合物，且本文所提供的益處在于可選擇單聚合物:蛋白質(zhì)接合物的比例以包括于混合物中。因此，視需要可制備各種蛋白質(zhì)與所連接的各種數(shù)量的聚合物部分(意即，二 _、三_、四-等)的混合物，并使所述接合物與使用本發(fā)明的方法制備的單聚合物:蛋白質(zhì)接合物組合，從而具有具預定的單聚合物:蛋白質(zhì)接合物比例的混合物。
[0301]所選擇的聚合物可具水溶性，從而使其所連接的蛋白質(zhì)不會沉淀于諸如生理學環(huán)境的水性環(huán)境中。聚合物可為分枝或不分枝聚合物。對于終產(chǎn)物制劑的治療用途而言，聚合物需為醫(yī)藥學上可接受的聚合物。
[0302]聚乙二醇分子比蛋白質(zhì)分子的比例將隨其在反應混合物中的濃度而變化。一般說來，最佳比率(就反應的效率而言為存在最少過量的未反應蛋白質(zhì)或聚合物)可通過所選聚乙二醇的分子量和可用反應性基團的可用數(shù)量確定。當涉及分子量時，通常聚合物的分子量越高，則可與蛋白質(zhì)連接的聚合物分子的數(shù)量越少。類似地，當優(yōu)化這些參數(shù)時，應考慮到聚合物的分枝。一般地，分子量越高(或分枝越多)則聚合物:蛋白質(zhì)的比率越高。
[0303]聚合物的實例包括(但不限于)聚烷基醚和其經(jīng)烷氧基封端的類似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/丙二醇和其經(jīng)甲氧基或乙氧基封端的類似物，尤其聚氧乙二醇，后者也稱為聚乙二醇或PEG);聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羥基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羥基烷基丙烯酰胺(例如聚羥丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羥基烷酯；聚唾液酸和其類似物；親水性肽序列；多醣和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纖維素和其衍生物，例如羧甲基纖維素、羥烷基纖維素；甲殼素和其衍生物，例如殼聚糖、琥珀?；鶜ぞ厶恰Ⅳ燃谆讱に?、羧甲基殼聚糖；透明質(zhì)酸和其衍生物；淀粉；海藻酸鹽；硫酸軟骨素；白蛋白；普魯蘭多 糖(pullulan)和羧甲基普魯蘭多糖；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；順丁烯二酸酐共聚物，諸如苯乙烯順丁烯二酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚順丁烯二酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和上述物質(zhì)的衍生物。
[0304]聚乙二醇分子比蛋白質(zhì)分子的比例將隨其在反應混合物中的濃度而變化。一般說來，最佳比率((就反應的效率而言為存在最少過量的未反應蛋白質(zhì)或聚合物)可通過所選聚乙二醇的分子量和可用反應性基團的可用數(shù)量確定。當涉及分子量時，通常聚合物的分子量越高，則可與蛋白質(zhì)連接的聚合物分子的數(shù)量越少。類似地，當優(yōu)化這些參數(shù)時，應考慮到聚合物的分枝。一般地，分子量越高(或分枝越多)則聚合物:蛋白質(zhì)的比率越高。
[0305]如本文所使用且當預期PEG:hGH多肽接合物時，術語“治療有效量”是指向患者提供所需益處的量。所述量將隨個體不同而變化，并且將視包括患者的全部生理條件和待治療的病況潛在成因的多種因素而定。治療使用的hGH多肽的量提供可接受的改變速率并且在有益的水平上保持所需改變。所屬領域技術人員可易于使用公共可用材料和程序確定本發(fā)明組合物的治療有效量。
[0306]水溶性聚合物可為任何結構形式，包括(但不限于)線性、叉形或分枝形。通常，水溶性聚合物為聚(烷二醇)，諸如聚(乙二醇)(PEG)，但其它水溶性聚合物也可使用。舉例而言，將使用PEG描述本發(fā)明的某些實施例。
[0307]PEG為眾所周知的水溶性聚合物，其為市售或可根據(jù)所屬領域技術人員已知的乙二醇的開環(huán)聚合方法進行制備(Sandler和Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, NewYork,第3卷，第138-161頁)。術語“PEG”在廣義上用于涵蓋忽略PEG大小或PEG末端修飾的任何聚乙二醇分子，并且可以由下式所示的與hGH多肽連接的形式表示=XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y，其中η為2到10，000 ;且X為H或末端修飾，包括(但不限于)C1^4烷基、保護基或末端官能團。
[0308]在一些情況下，用于本發(fā)明中的PEG在一端以羥基或甲氧基終止，意即，X為H或CH3 (“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以反應性基團終止，由此形成雙官能聚合物。典型的反應性基團可包括通常用于與見于20種常見氨基酸中的官能團反應的反應性基團(包括但不限于，順丁烯酰亞胺基團、活性碳酸酯(包括但不限于，對硝基苯酯)、活性酯(包括但不限于，N-羥基琥珀酰亞胺、對硝基苯酯)和醛)，以及對20種常見氨基酸具惰性但與非天然編碼的氨基酸內(nèi)存在的互補官能團特異性反應的官能團(包括但不限于，疊氮基、炔基)。應注意，上式中以Y表示的PEG的另一末端將經(jīng)由天然存在或非天然編碼的氨基酸直接或間接與hGH多肽連接。舉例而言，Y可為與多肽胺基(包括但不限于，賴氨酸的ε胺或N端)的酰胺、氨基甲酸酯或尿素鍵。或者，Y可為與硫醇基(包括但不限于，半胱氨酸的硫醇基)的順丁烯酰亞胺鍵?；蛘撸琘可為與通常不可經(jīng)由20種常見氨基酸接取的殘基的鍵。舉例而言，PEG上的疊氮基可與hGH多肽上的炔基反應形成Huisgen [3+2]環(huán)加成產(chǎn)物?；蛘?，PEG上的炔基可與非天然編碼的氨基酸中存在的疊氮基反應形成類似產(chǎn)物。在一些實施例中，強親核試劑(包括但不限于，肼、酰肼、羥胺、氨基脲)可與非天然編碼的氨基酸中存在的醛基或酮基反應形成腙、肟或縮氨基脲，其視應用在一些情況下可另外通過用適當還原劑處理而經(jīng)還原?；蛘撸赏ㄟ^非天然編碼的氨基酸將所述強親核試劑并入hGH多肽中，并且將其用于優(yōu)先與水溶性聚合物中存在的酮或醛基反應。
[0309]可視實際需要使用PEG的任何分子量，包括(但不限于)約100道爾頓(Dalton, Da)到100，OOODa或視需要更多(包括但不限于，有時0.l_50kDa或10_40kDa)。PEG的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)約IOODa與約100，OOODa或更多之間。PEG的分子量可介于約 IOODa 與約 100，OOODa 之間，包括(但不限于)100，OOODa,95, OOODa,90, OOODa,85, OOODa、80, 000Da>75, 000Da>70, 000Da>65, 000Da>60, 000Da>55, 000Da>50, 000Da>45, OOODa、40,OOODa、35，OOODa、30`，OOODa、25，OOODa、20，OOODa、15, OOODa、10，OOODa、9，OOODa、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4, 000Da、3, 000Da、2, OOODa、I, 000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da 和 100Da。在一些實施例中，PEG 的分子量是介于約IOODa與50，OOODa之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約IOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約1，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約5，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約10，OOODa與40，OOODa之間。也可使用支鏈PEG，包括(但不限于)各鏈的麗在
1-1OOkDa (包括但不限于l-50kDa或5_20kDa)范圍內(nèi)的PEG分子。支鏈PEG的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)約1，OOODa與約100，OOODa或更多之間。支鏈PEG的分子量可介于約 1，OOODa 與約 100，OOODa 之間，包括(但不限于)100, OOODa,95, OOODa,90, OOODa,85, 000Da>80, 000Da>75, 000Da>70, 000Da>65, 000Da>60, 000Da>55, 000Da>50, OOODa、45, OOODa、40，OOODa、35，OOODa、30，OOODa、25，OOODa、20，OOODa、15, OOODa、10, OOODa、
9,000Da、8, 000Da、7, 000Da、6, 000Da、5, 000Da、4, 000Da、3, 000Da、2, OOODa 和 I, OOODa。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量是介于約1，OOODa與50，OOODa之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量是介于約1，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量是介于約5，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量是介于約5，OOODa與20，OOODa之間。多種PEG分子已描述于包括(但不限于)the Shearwater Polymers, Inc.catalog, Nektar Therapeutics catalog (以引用的方式并入本文)中。
[0310]一般地，PEG分子的至少一個末端可用于與非天然編碼的氨基酸反應。舉例而言，可使用具有與氨基酸側鏈反應的炔部分和疊氮部分的PEG衍生物使PEG與非天然編碼的氨基酸反應。如果非天然編碼的氨基酸包含疊氮化物，那么PEG通常將含有實現(xiàn)[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物形成的炔部分或含有實現(xiàn)酰胺鍵形成的膦基的活性PEG物質(zhì)(意即，酯、碳酸酯)。或者，如果非天然編碼的氨基酸包含炔，那么PEG通常將含有實現(xiàn)[3+2]Huisgen環(huán)加成產(chǎn)物形成的疊氮部分。如果非天然編碼的氨基酸包含羰基，那么PEG通常將包含有效的親核試劑(包括但不限于，酰肼、肼、羥胺或氨基脲官能性)以便實現(xiàn)相應腙、肟和縮氨基脲鍵的分別形成。在其它替代選擇中，可反方向使用上述反應性基團，意即，非天然編碼的氨基酸中的疊氮部分可與含有炔的PEG衍生物反應。
[0311]在一些實施例中，具有PEG衍生物的hGH多肽含有與非天然編碼的氨基酸側鏈上存在的化學官能團反應的化學官能性。
[0312]在一些實施例中，本發(fā)明提供含疊氮化物和乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量為約800Da到約100，OOODa的水溶性聚合物主鏈。水溶性聚合物的聚合物主鏈可為聚(乙二醇)。然而，應了解，包括但不限于聚(乙二醇)和其它相關聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))的多種水溶性聚合物也適用于本發(fā)明的實踐中，且預期術語PEG或聚(乙二醇)的使用涵蓋并包括所有所述分子。術語PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇)，包括雙功能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉形PEG、分枝PEG、側接PEG (意即，具有一個或一個以上與聚合物主鏈側接的官能團的PEG或相關聚合物)或具有可降解鍵的PEG。
[0313]PEG通常澄清、無色、無臭、溶于水、對熱穩(wěn)定、對許多化學試劑具惰性，不會水解或退化且一般無毒。普遍認為聚(乙二醇)具生物可相容性，也就是說，PEG能夠在不引起危害的情況下與活組織或有機體共存。更具體說來，PEG實質(zhì)具非免疫原性，也就是說，PEG在體內(nèi)不傾向于產(chǎn)生免疫反應。當與體內(nèi)具有一些所需功能的分子(諸如生物活性劑)連接時，PEG傾向于遮蔽所述試劑，并且可能減小或消除任何免疫反應從而使有機體可耐受所述試劑的存在。PEG接合物傾向于不產(chǎn)生實質(zhì)的免疫反應或引起凝血或其它不合需要的作用。具有式-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-(其中η為約3到約4000，通常為約20到約2000)的PEG適用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一些實施例中，分子量為約800Da到約100，OOODa的PEG尤其可用作聚合物主鏈。PEG的分子量可具有寬范圍，包括(但不限于)約IOODa與約100，OOODa或更多之間。PEG的分子量可介于約IOODa與約100，OOODa之間，包括(但不限于)100, 000Da、95, 000Da、90, 000Da、85, 000Da、80, 000Da、75, 000Da、70, 000Da、65, OOODa>60，000Da、55，000Da、50，000Da、45，000Da、40，000Da、35，000Da、30，000Da、25，OOODa、20，OOODa、15，OOODa、10，OOODa、9，OOODa、8，OOODa、7，OOODa、6，OOODa、5，OOODa、4，OOODa、3，000Da、2，000Da、l，000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da 和IOODa0在一些實施例中，PEG的分子量是介于約IOODa與50，OOODa之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約IOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約1，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約5，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，PEG的分子量是介于約10，OOODa與40，OOODa之間。[0314]聚合物主鏈可為線性或分枝狀。分枝狀聚合物主鏈一般已為此項技術中所知。通常，分枝聚合物具有一個中心分枝核心部分和多個與所述中心分枝核心連接的線性聚合物鏈。通常使用分枝形式的PEG，其可通過使氧化乙烯與各種多元醇(諸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)加成而制得。中心分枝部分也可源自若干個氨基酸(諸如賴氨酸)。分枝狀聚(乙二醇)可以通用形式R(-PEG-0H)m表示，其中R是從核心部分衍生，諸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇；且111表示側臂數(shù)。也可將多臂PEG分子(諸如美國專利第5，932，462號、第 5，643，575 號、第 5，229, 490 號、第 4，289, 872 號；美國專利申請案 2003/0143596 ；W096/21469 ;和W093/21259，所述專利各自以其全文引用的方式并入本文)用作聚合物主鏈。
[0315]分枝狀PEG也可為以PEG (-YCHZ2)n表示的分叉狀PEG形式，其中Y為連接基團，且Z為通過指定長度的原子鏈與CH連接的活性端基。
[0316]另一種分枝形式，即側接PEG沿PEG主鏈而不是在PEG鏈末端具有反應性基團，諸
如羧基。
[0317]除這些形式的PEG外，也可制備在主鏈中具有弱或不可降解的鍵的聚合物。舉例而言，可制備在聚合物主鏈中具有經(jīng)歷水解的酯鍵的PEG。如下所示，這一水解將使聚合物裂解成具有較低分子量的片段:
[0318]-PEGJ-C02-PEG-+H20 — PEG-C02H+H0_PEG-。
[0319]所屬領域技術人員應了解，術語聚(乙二醇)或PEG表示或包括此項技術中已知的所有形式，包括(但不限于)本文所揭示的形式。
[0320]許多其它聚合物也適用于本發(fā)明中。在一些實施例中，具水溶性、具有2到約300個末端的聚合物主鏈尤其可用于本發(fā)明中。適當聚合物的實例包括(但不限于)其它聚(烷二醇)，諸如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括但不限于，乙二醇與丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物和其類似物。盡管聚合物主鏈各鏈的分子量可變化，但其通常在約SOODa到約100，OOODa、通常在約6，OOODa到約80，OOODa的范圍內(nèi)。聚合物主鏈各鏈的分子量可介于約 IOODa 與約 100，OOODa 之間，包括(但不限于)100，OOODa,95, OOODa,90, OOODa,85, OOODa、80, 000Da>75, 000Da>70, 000Da>65, 000Da>60, 000Da>55, 000Da>50, 000Da>45, OOODa、40,OOODa、35，OOODa、30，OOODa、25，OOODa、20，OOODa、15, OOODa、10, OOODa、9，OOODa、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5, 000Da、4, 000Da、3, 000Da、2, OOODa、I, 000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約IOODa與50，OOODa之間。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約IOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約1，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約5，OOODa與40，OOODa之間。在一些實施例中，聚合物主鏈各鏈的分子量是介于約10，OOODa與40，OOODa之間。
[0321]所屬領域技術人員將認識到，前述有關實質(zhì)水溶性主鏈的列表并不詳盡而僅出于說明的目的，并且預期具有上述品質(zhì)的所有聚合材料都適用于本發(fā)明中。
[0322]在本發(fā)明的一些實施例中，聚合物衍生物為“多官能的”，意思是聚合物主鏈具有至少兩個經(jīng)官能團功能化或活化的末端，且可能多達約300個末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有兩個末端的線性聚合物，每一末端都與相同或不同的官能團鍵接。
[0323]在一實施例中，聚合物衍生物具有結構:
[0324]X-A-POLY-B-N = N = N,
[0325]其中:
[0326]N=N=N為疊氮部分；
[0327]B為連接部分，其可存在或不存在；[0328]POLY為水溶性非抗原性聚合物；
[0329]A為連接部分，其可存在或不存在且其可與B相同或不同；
[0330]且
[0331]X為第二官能團。
[0332]A與B的連接部分的實例包括(但不限于)含有多達18個(包括但不限于，介于1-10個之間)碳原子的多重官能化烷基。烷基鏈中可包括雜原子，諸如氮、氧或硫。烷基鏈也可在雜原子處具有支鏈。A與B的連接部分的其它實例包括(但不限于)含有多達10個(包括但不限于，介于5-6個之間)碳原子的多重官能化芳基。芳基可經(jīng)一個或一個以上碳原子、氮原子、氧原子或硫原子取代。適當連接基團的其它實例包括美國專利第5，932，462號、第5，643，575號和美國專利申請公開案2003/0143596中所述的那些連接基團，所述專利各自以引用的方式并入本文中。所屬領域技術人員將認識到，前述有關連接部分的列表并不詳盡而僅出于說明的目的，并且預期具有上述品質(zhì)的所有連接部分都適用于本發(fā)明中。
[0333]用作X的適當官能團的實例包括(但不限于)羥基、經(jīng)保護羥基、烷氧基、活性酯(諸如N-羥基琥珀酰亞胺基酯和1-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(諸如碳酸N-羥基琥珀酰亞胺基酯和碳酸1-苯并三唑酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、經(jīng)保護胺、酰肼、經(jīng)保護酰肼、經(jīng)保護硫醇、羧酸、經(jīng)保護羧酸、異氰酸酯、異硫代氰酸酯、順丁烯二酰亞胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烴、酮和疊氮化物。如所屬領域技術人員所了解，所選擇的X部分應與疊氮基相容，從而不會與疊氮基發(fā)生反應。含有疊氮基的聚合物衍生物可具同型雙功能性，意思是第二個官能團(意即，X)也為疊氮部分；或具異型雙功能性，意思是第二官能團為不同的官能團。
[0334]術語“經(jīng)保護”是指存在防止化學反應官能團在某些反應條件下反應的保護基團或部分。保護基將視所保護的化學反應基團的類型而變化。舉例而言，如果化學反應基團為胺或酰肼，那么保護基可選自由叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)組成的群組。如果化學反應基團為硫醇，那么保護基可為正吡啶基二硫化物。如果化學反應基團為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，那么保護基可為苯甲基或烷基(諸如甲基、乙基或叔丁基)。此項技術中已知的其它保護基也可用于本發(fā)明中。
[0335]通?？赏ㄟ^此項技術中已知的方法(包括但不限于，沉淀產(chǎn)物隨后視需要進行色譜分析)實現(xiàn)對于粗產(chǎn)物的純化。
[0336]可將水溶性聚合物與本發(fā)明的hGH多肽連接。水溶性聚合物可通過并入hGH多肽中的非天然編碼的氨基酸，或非天然編碼或天然編碼的氨基酸的任何官能團或取代基，或加入到非天然編碼或天然編碼的氨基酸中的任何官能團或取代基連接?；蛘撸ㄟ^天然存在的氨基酸(包括但不限于，半胱氨酸、賴氨酸或N端殘基的胺基)使水溶性聚合物與并入非天然編碼的氨基酸的hGH多肽連接。在一些情況下，本發(fā)明的hGH多肽包含I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個非天然氨基酸,其中一個或一個以上非天然編碼的氨基酸與水溶性聚合物(包括但不限于，PEG和/或寡醣)連接。在一些情況中，本發(fā)明的hGH多肽另外包含I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上與水溶性聚合物連接的天然編碼的氨基酸。在一些情況中，本發(fā)明的hGH多肽包含一個或一個以上與水溶性聚合物連接的非天然編碼的氨基酸和一個或一個以上與水溶性聚合物連接的天然存在的氨基酸。在一些實施例中，相對于未接合形式的hGH多肽，用于本發(fā)明中的水溶性聚合物將增強所述hGH多肽的血清半衰期。
[0337]可調(diào)節(jié)與本發(fā)明的hGH多肽連接的水溶性聚合物的數(shù)量(意即，PEG化或糖基化程度)使藥理學、藥代動力學或藥效特性(諸如活體內(nèi)半衰期)改變(包括但不限于，增加或降低)。在一些實施例中，hGH半衰期比未經(jīng)修飾的多肽的半衰期增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2 倍、5 倍、6 倍、7 倍、8 倍、9 倍、10 倍、11 倍、12 倍、13 倍、14 倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少約100倍。
[0338]含有強親核基團(意即，酰肼、肼、羥胺或氨基脲)的PEG衍生物
[0339]在本發(fā)明的一個實施例中，用含有與PEG主鏈直接連接的末端肼、羥胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修飾包含含羰基非天然編碼的氨基酸的hGH多肽。
[0340]在一些實施例中，以羥胺為末端的PEG衍生物將具有以下結構:
[0341 ] RO- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) m-0-NH2,
[0342]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且η為100-1,000 (意即，平均分子量介于5_40kDa之間)。
[0343]在一些實施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物將具有以下結構:
[0344]RO- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) m-X-NH-NH2，
[0345]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且η為100-1，000，且X視情況為可存在或不存在的羰基(c=o)。
[0346]在一些實施例中，含氨基脲的PEG衍生物將具有以下結構:
[0347]RO- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2，
[0348]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且η為100-1，000。
[0349]在本發(fā)明的另一實施例中，用含有利用酰胺鍵連接到PEG主鏈的末端羥胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修飾包含含羰基氨基酸的hGH多肽。
[0350]在一些實施例中，以羥胺為末端的PEG衍生物將具有以下結構:
[0351 ] RO- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) 2_NH_C (O) (CH2) m-0-NH2，
[0352]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且η為100-1,000 (意即，平均分子量介于5_40kDa之間)。
[0353]在一些實施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物具有以下結構:
[0354]RO- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) 2_NH_C (O) (CH2) ,X-NH-NH2，
[0355]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且η為100-1，000，且X視情況為可存在或不存在的羰基(c=o)。
[0356]在一些實施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下結構:
[0357]RO- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) 2-NH_C (O) (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2，[0358]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且η為100-1，000。
[0359]在本發(fā)明的另一實施例中，用含有末端肼、羥胺、酰肼或氨基脲部分的分枝狀PEG衍生物修飾包含含羰基氨基酸的hGH多肽，其中所述分枝狀PEG的各鏈具有在10-40kDa范圍內(nèi)的麗。所述分枝狀PEG各鏈的麗可在5-20kDa的范圍內(nèi)。
[0360]在本發(fā)明的另一實施例中，以具有分枝結構的PEG衍生物修飾包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽。舉例而言，在一些實施例中，以肼或酰肼為末端的PEG衍生物將具有以下結構:
[0361 ] [R0- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) 2_NH_C (O) ] 2CH (CH2) m-X-NH-NH2,
[0362]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100_1，000，且X視情況為可存在或不存在的羰基(c=o)。
[0363]在一些實施例中，含氨基脲基團的PEG衍生物將具有以下結構:
[0364][R0- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) 2~C (O) -NH-CH2-CH2] 2CH_X_ (CH2) m-NH-C (0) -NH-NH2，
[0365]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、0、S、C(0)或不存在，m為2-10 且 η 為 100-1,000。
[0366]在一些實施例中，含羥胺基團的PEG衍生物將具有以下結構:
[0367][R0- (CH2CH2O) n_0_ (CH2) 2~C (O) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2) m-0-NH2,
[0368]其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、0、S、C(0)或不存在，m為
2-10 且 η 為 100-1,000。
[0369]水溶性聚合物與hGH多肽連接的程度和位點可調(diào)節(jié)hGH多肽與hGH多肽受體在位點I的結合。在一些實施例中，如通過平衡結合檢定所測量(諸如Spencer等人，J.Biol.Chem.，263:7862-7867(1988)中關于hGH所述的檢定)，安排鍵從而使hGH多肽在位點I處以約400nM或更低的Kd、150nM或更低的Kd且在一些情況下以IOOnM或更低的Kd與hGH多
肽受體結合。
[0370]活化聚合物以及肽接合的方法和化學已描述于文獻中且為此項技術中所知。用于活化聚合物的常用方法包括(但不限于)以溴化氰、高碘酸鹽、戊二醛、二環(huán)氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳二酰亞胺、磺?；u化物、三氯均三嗪等活化官能團(參看，R.F.Taylor, (1991), PROTEIN ImmobiliSATION-Fundamental and Applications, Marcel Dekker, N.Y.；S.S.Wong, (1992)，Chemistry of Protein Conjugation 細 Crosslinking, CRC Press, Boca Raton ；G.T.Hermanson 等人，(1993)，Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.；Dunn, R.L.等人，編輯 POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS SymposiumSeries第 469 卷，American Chemical Society, Washington, D.C.1991X
[0371]有關PEG功能化和接合的多項綜述和專論都適用。例如參看，Harris, Macromol.Chem.Phys.C25:325-373(1985) ；Scouten, Methods in Enzymologyl35:30-65(1987) ；ffong等人，Enzyme Microb.Technol.14:866-874(1992) ;Delgado 等人，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems9:249-304 (1992) ；Zalipsky,BioconjugateChem.6:150-165(1995)。
[0372]活化聚合物的方法也可見于TO94/17039、美國專利第5，324，844號、TO94/18247、W094/04193、美國專利第5，219，564號、美國專利第5，122，614號、W090/13540、美國專利第5，281，698號和W093/15189中，且有關活性聚合物與酶之間接合的方法見于以下專利文獻:所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII (W094/15625)、血色素(W094/09027)、載氧分子(美國專利第4，412，989號)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11:141-52(1985))。所引用的所有參考文獻和專利都是以引用的方式并入本文中。
[0373]含有非天然編碼的氨基酸(諸如，對疊氮基-L-苯丙氨酸)的hGH多肽的PEG化(意即，加入任何水溶性聚合物)是通過任何常規(guī)方法進行。舉例而言，hGH多肽是經(jīng)以炔封端的mPEG衍生物PEG化。簡單說來，室溫下，于攪拌下將過量的固態(tài)mPEG (5000) -O-CH2-C = CH加入含對疊氮基-L-Phe的hGH多肽的水溶液中。通常，水溶液經(jīng)pKa值接近進行反應的pH值(一般為約PH4-10)的緩沖液緩沖。舉例而言，用于在pH7.5下PEG化的適當緩沖液的實例包括(但不限于)HEPES、磷酸鹽、硼酸鹽、TRIS-HCl, EPPS和TES。持續(xù)監(jiān)測pH值且視需要加以調(diào)節(jié)。通常使反應持續(xù)約1-48小時。
[0374]隨后，使反應產(chǎn)物經(jīng)歷疏水相互作用色譜分析以使PEG化的hGH多肽變異體與游離mPEG (5000)-O-CH2-C = CH和PEG化hGH多肽的任何高分子量復合物分離，所述復合物可在活化未阻斷PEG分子的兩端從而交聯(lián)hGH多肽變異體分子時形成。疏水相互作用色譜分析期間的條件為使游離mPEG (5000) -O-CH2-C = CH流過柱，而任何交聯(lián)PEG化hGH多肽變異體復合物在含有一個與一個或一個以上PEG基團接合的hGH多肽變異體分子的所需形式后洗提的條件。適當?shù)臈l件將視交聯(lián)復合物比所需接合物的相對尺寸而變化，且易于為所屬領域技術人員確定。通過超濾濃縮含有所需接合物的洗提液并通過透濾使其脫鹽。
[0375]視需要，由疏水色譜分析獲得的PEG化hGH多肽可經(jīng)所屬領域技術人員已知的一種或一種以上程序進一步純化，所述程序包括(但不限于)親和色譜；陰離子或陽離子交換色譜(包括但不限于使用DEAE SEPHAROSE);二氧化硅色譜；反相HPLC (RP-HPLC);凝膠過濾(包括但不限于使用SEPHADEX G-75);疏水相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合色譜；超濾/透濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜焦聚；置換色譜；電泳程序(包括但不限于，制備型等電聚焦);差別溶解性(包括`但不限于硫酸銨沉淀);或萃取。表觀分子量可用GPC通過與球狀蛋白質(zhì)標準品比較估算(Preneta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICALAPPROACH (Harris&Angal 編輯)IRL Pressl989, 293-306)。hGH-PEG 接合物的純度可通過蛋白水解降解(包括但不限于，胰蛋白酶裂解)隨后質(zhì)譜分析來評定。Pepinsky RB等人，J.Pharmcol.&Exp.Ther.297(3):1059-66 (2001)。
[0376]與本發(fā)明hGH多肽的氨基酸連接的水溶性聚合物可另外(但不限于)經(jīng)衍生化或取代。
[0377]其它PEG衍牛物和通用PEG化摶術
[0378]含疊氮基、含炔基和含膦PEG衍生物描述于標題為“Modifed Human GrowthHormone Polypeptides and Their Uses” 的美國專利申請案第 11/046，432 號中。
[0379]可與hGH多肽連接的其它示范性PEG分子以及PEG化方法包括以下專利中所述者:例如，美國專利公開案第2004/0001838號；第2002/0052009號；第2003/0162949號；第 2004/0013637 號；第 2003/0228274 號?’第 2003/0220447 號；第 2003/0158333 號；第 2003/0143596 號；第 2003/0114647 號；第 2003/0105275 號；第 2003/0105224 號；第 2003/0023023 號；第 2002/0156047 號；第 2002/0099133 號；第 2002/0086939 號；第 2002/0082345 號；第 2002/0072573 號；第 2002/0052430 號；第 2002/0040076 號；第 2002/0037949 號；第 2002/0002250 號；第 2001/0056171 號；第 2001/0044526 號；第 2001/0021763 號；美國專利第 6，646，110 號；第 5，824，778 號；第 5，476，653 號；第5，219，564 號；第 5，629，384 號；第 5，736，625 號；第 4，902，502 號；第 5，281，698 號；第 5，122，614 號；第 5，473，034 號；第 5，516，673 號；第 5，382，657 號；第 6，552，167 號；第 6，610，281 號；第 6，515，100 號；第 6，461，603 號；第 6，436，386 號；第 6，214，966 號；第 5，990，237 號；第 5，900，461 號；第 5，739，208 號；第 5，672，662 號；第 5，446，090 號；第 5，808，096 號；第 5，612，460 號；第 5，324，844 號；第 5，252，714 號；第 6，420，339 號；第 6，201，072 號；第 6，451，346 號；第 6，306，821 號；第 5，559，213 號；第 5，747，646 號；第 5，834，594 號；第 5，849，860 號；第 5，980，948 號；第 6，004，573 號；第 6，129，912 號;W097/32607 ；EP229, 108 ；EP402, 378 ；W092/16555 ；W094/04193 ；W094/14758 ；W094/17039 ；W094/18247 ；W094/28024 ；W095/00162 ；W095/11924 ；W095/13090 ；W095/33490 ；W096/00080 ；W097/18832 ；W098/41562 ；W098/48837 ；W099/32134 ；W099/32139 ；W099/32140 ；W096/40791 ；W098/32466 ；W095/06058 ；EP439508 ；W097/03106 ；W096/21469 ；W095/13312 ；EP921131；W098/05363 ；EP809996 ；W096/41813 ；W096/07670 ；EP605963 ；EP510356 ；EP400472 ；EP183503和EP154316，所述專利都是以引用的方式并入本文中。本文所述的任何PEG分子都可以任何形式使用，包括(但不限于)單鏈、支鏈、多臂鏈、單官能、雙官能、多官能或其任何組合。標題為“Modified Human Growth Hormone Polypeptides andTheir Uses”的美國專利申請案第11/046，432號(其是以引用的方式并入本文)中提供其它有關PEG和其形式的討論。
[0380]IX.有關效力、功能性活體內(nèi)半衰期和藥代動力學參數(shù)的測量
[0381]本發(fā)明的一個重要方面在于通過構筑與水溶性聚合物部分接合或不接合的hGH多肽獲得的延長的生物半衰期。迅速降低hGH多肽的血清濃度使得評價對以接合和未接合hGH多肽和其變異體進行治療的生物反應極其重要。本發(fā)明的接合和未接合hGH多肽和其變異體可在皮下或靜脈內(nèi)投藥后也具有延長的血清半衰期，使得可能例如通過ELISA方法或初級篩選檢定進行測量。可使用來自BioSource International (Camarillo, CA)或Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX)的 ELISA 或 RIA 試劑盒。如本文所述進行活體內(nèi)生物半衰期的測量。
[0382]可根據(jù)Clark, R.等人，J.Biol.Chem.271 (36): 21969-21977 (1996)中所述的方案測定包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的效力和功能性活體內(nèi)半衰期。
[0383]可以正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每一治療組N=5只動物)估算包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的藥代動力學參數(shù)。動物將經(jīng)靜脈內(nèi)接收每只大鼠25 μ g的單一劑量或經(jīng)皮下接收每只大鼠50 μ g的單一劑量，并且根據(jù)預定時間段取得約5-7個血液樣本，所述預定時間段一般對于包含未與水溶性聚合物接合的非天然編碼的氨基酸的hGH多肽而言包含約6小時，而對于包含非天然編碼的氨基酸且與水溶性聚合物接合的hGH多肽而言為約4天。在數(shù)種物種中已對hGH多肽的藥代動力學數(shù)據(jù)進行良好研究，并且可直接將其與所獲得的有關包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽的數(shù)據(jù)相比較。參看以引用方式并入本文中的 Mordenti J.等人，Pharm.Res.8 (11): 1351-59 (1991)中有關 hGH 的研究。
[0384]也可以靈長類動物(例如，獼猴)估算藥代動力學參數(shù)。單次注射可經(jīng)皮下或靜脈內(nèi)投與，并且隨時監(jiān)測血清hGH含量。[0385]可通過此項技術中已知的各種檢定測定根據(jù)本發(fā)明的hGH多肽的特異性活性。根據(jù)本發(fā)明獲得并純化的hGH多肽突變蛋白質(zhì)或其片段的生物活性可通過本文所述或所參考的方法或所屬領域技術人員已知的方法進行測試。
[0386]X.投藥和醫(yī)藥組合物
[0387]本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)(包括但不限于，包含一個或一個以上非天然氨基酸的hGH、合成酶、蛋白質(zhì)等)視情況與包括(但不限于)適當醫(yī)藥載劑組合用于治療用途。所述組合物例如包含治療有效量的化合物和醫(yī)藥學上可接受的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑包括(但不限于)生理鹽水、經(jīng)緩沖生理鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其組合。使所述配方與投藥模式相適應。一般說來，投與蛋白質(zhì)的方法已為所屬領域技術人員所知，且可適用于投與本發(fā)明的多肽。
[0388]根據(jù)所屬領域技術人員已知的方法，視情況在一個或一個以上適當?shù)幕铙w外和/或活體內(nèi)動物疾病模型中測試包含一種或一種以上本發(fā)明多肽的治療組合物，以確定功效、組織代謝并估計劑量。具體說來，最初可通過本文中非天然氨基酸與天然氨基酸同源物的活性、穩(wěn)定性或其它適當測量(包括但不限于，將經(jīng)修飾以包括一個或一個以上非天然氨基酸的hGH多肽與天然氨基酸hGH多肽比較)(意即，在相關檢定中)測定劑量。
[0389]投藥是通過通常用于引入分子最終使其與血液或組織細胞接觸的任何途徑進行。本發(fā)明的非天然氨基酸多肽是以任何適當?shù)姆绞揭暻闆r與一種或一種以上醫(yī)藥學上可接受的載劑一起投與。向患者投與本發(fā)明上下文中所述的這些多肽的適當方法都可使用，且盡管可使用一種以 上途徑投與特定組合物，但特定途徑通?？商峁┍攘硪煌緩娇旖莺陀行У淖饔没蚍磻?。
[0390]醫(yī)藥學上可接受的載劑部分是通過所投與的特定組合物以及用于投與組合物的特定方法確定。因此，存在多種適當?shù)谋景l(fā)明醫(yī)藥組合物的配方。
[0391]可通過適于蛋白質(zhì)或肽的任何常規(guī)途徑投與本發(fā)明的hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)，所述途徑包括(但不限于)不經(jīng)腸方式，例如注射，包括(但不限于)皮下注射或靜脈內(nèi)注射或任何其它注射或輸注形式。多肽組合物可以多種途徑投與，包括(但不限于)經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、透皮、皮下、局部、舌下或直腸方式。也可經(jīng)由脂質(zhì)體投與包含經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的非天然氨基酸多肽的組合物。所述投藥途徑和適當配方一般已為所屬領域技術人員已知。包含非天然編碼的氨基酸的hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)可單獨使用或與其它適當?shù)慕M份(諸如醫(yī)藥載劑)組合使用。
[0392]也可將單獨或與其它適當組份組合的包含非天然氨基酸的hGH多肽制成氣霧劑配方(意即，其可經(jīng)“霧化”)以通過吸入投與?？蓪忪F劑配方放到加壓可接受的推進劑(諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和其類似物)中。
[0393]適于不經(jīng)腸投與(諸如，通過關節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑投與)的配方包括水性與非水性、等滲無菌注射溶液(其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使配方與預定接受者的血液等滲的溶質(zhì))和水性與非水性無菌懸浮液(其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑)。hGH配方可存在于單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中。
[0394]不經(jīng)腸投藥和靜脈內(nèi)投藥是優(yōu)選的投藥方法。具體說來，已使用的用于天然氨基酸同源物治療的投藥途徑(包括但不限于，通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白細胞介素、抗體和/或任何其它以醫(yī)藥學方式傳遞的蛋白質(zhì)的那些途徑)連同當前使用的配方提供優(yōu)選的投藥途徑和本發(fā)明多肽的配方。
[0395] 多肽組合物的粘度和調(diào)配概況可允許用小規(guī)格針通過使用比常規(guī)配方小的活塞壓力進行投藥?？墒褂幂^小規(guī)格針(包括但不限于，27號、28號、29號、30號或31號針)向受檢者投與本發(fā)明的多肽組合物。美國專利第6，875，432號(其是以引用的方式并入本文中)討論蛋白質(zhì)配方的粘度和與用于皮下投與的蛋白質(zhì)配方的粘度有關的問題。小規(guī)格針因減小注射疼痛從而改良患者對給藥方案的順應性而有益。注射所需的較小活塞壓力使hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)更易于以較短注射持續(xù)時間投與。針的類型包括(但不限于)錐形針、薄壁型針、正常壁厚針和羅氏針(luer needle)。
[0396]粘度可通過所屬領域技術人員已知的標準技術測量。“粘度”可為“運動粘度”或“絕對粘度”。“運動粘度”是對于在重力影響下流體流動抗性的量度。當將兩種具有相同體積的流體放在相同的毛細管粘度計中并且使其在重力下流動時，粘性流體將比粘性較低的流體花費更長的時間流過毛細管。如果一種流體花費200秒完成其流動，而另一種流體花費400秒，那么就運動粘度的比例而言，第二種流體的粘性為第一種流體的兩倍。“絕對粘度”有時稱為動態(tài)粘度或簡單粘度，其為運動粘度與流體密度的乘積:絕對粘度=運動粘度X密度。
[0397]運動粘度的大小為L2/T，其中L為長度且T為時間。通常，運動粘度是以厘斯(centistoke, cSt)表示。運動粘度的SI單位為mm2/s,其為lcSt。絕對粘度是以厘泊(centipoise, cP)表示。絕對粘度的 SI 單位為毫帕斯卡-秒(milliPascal-second，mPa-s),其中 lcP=lmPa_s。
[0398]在本發(fā)明的上下文中，向患者投藥的劑量視應用而在患者體內(nèi)隨時間變化足以具有有益的治療反應或其它適當活性。所述劑量是通過特定載體或配方的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期和患者的病況以及待治療的患者的體重或表面積測定。也可通過在特定患者體內(nèi)投與特定載體、配方或其類似物伴隨的任何不利副作用的存在、性質(zhì)和程度測定劑量大小。
[0399]在測定治療或預防疾病(包括但不限于，癌癥、遺傳疾病、糖尿病、AIDS或其類似疾病)將投與的載體或配方的有效量時，醫(yī)師將評價循環(huán)血漿含量、配方毒性、疾病進程和/或(相關時)抗非天然氨基酸多肽抗體的制造。
[0400]例如向70公斤重的患者投與的劑量通常在相當于目前所使用的治療蛋白質(zhì)的劑量的范圍內(nèi)，其經(jīng)調(diào)整以改變相關組合物的活性或血清半衰期。本發(fā)明的載體或醫(yī)藥配方可通過任何已知的常規(guī)療法，包括抗體投藥、疫苗投藥、細胞毒素劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物反應修飾劑的投藥，諸如此類來補充治療條件。
[0401]為投藥，本發(fā)明的配方是以由相關配方的LD-50或ED-50和/或在各種濃度下，(包括(但不限于))當適用于患者的質(zhì)量和總體健康時，非天然氨基酸多肽的任何副作用的觀察所確定的施用率投與。投藥可通過單一劑量或分次劑量完成。
[0402]如果經(jīng)歷配方輸注的患者感染發(fā)燒、受寒或肌肉疼痛，那么他/她可接受適當劑量的阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、乙酰胺苯酹或其他控制疼痛/發(fā)燒的藥物。經(jīng)歷諸如發(fā)燒、肌肉疼痛和受寒的對輸注的反應的患者，在未來輸注之前，用阿斯匹林、乙酰胺苯酹或(包括(但不限于))苯海拉明(diphenhydramine)前驅(qū)用藥30分鐘。派替唳(Meperidine)是用于不能對退熱劑和抗組胺快速作出反應的更嚴重的受寒和肌肉疼痛。視反應的嚴重性而減慢或中斷細胞輸注。
[0403]本發(fā)明的人類hGH多肽可直接投與哺乳動物受檢者。投藥是通過通常用于將hGH多肽引入受檢者的任何途徑進行。盡管在任何給定情況下，最適合的途徑將視所治療的病況的性質(zhì)和嚴重性而定，但是根據(jù)本發(fā)明實施例的hGH多肽組合物包括適于以下投藥的所述組合物:經(jīng)口、直腸、局部、吸入(包括(但不限于)通過氣霧劑)、頰內(nèi)(包括(但不限于)舌下)、陰道、不經(jīng)腸(包括(但不限于)皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(意即，皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)和透皮投藥。投藥可為局部或全身投藥。化合物配方可存在于單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中。本發(fā)明的hGH多肽可制備于呈單位劑量可注射形式(包括(但不限于)溶液、懸浮液或乳液)的與醫(yī)藥學上可接受的載劑或賦形劑的混合物中。本發(fā)明的hGH多肽也可通過連續(xù)輸注((包括但不限于，使用諸如滲透泵的小型真空泵)、單次團注或緩慢釋放儲槽式配方來投與。
[0404]適于投藥的配方包括可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使配方等滲的溶質(zhì)的水性與非水性溶液、等滲無菌溶液，和可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性與非水性無菌懸浮液。溶液和懸浮液可從前文描述的種類的無菌粉末、顆粒和片劑制備。
[0405]冷凍干燥是用于呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的常用技術，其用來從所關注的蛋白質(zhì)制劑中去除水。冷凍干燥或凍干法是一種首先將待干燥的材料冷凍且隨后通過在真空環(huán)境中升華去除冰或冷凍溶劑的方法。賦形劑可包括在預先凍干的配方中，以增強其在冷凍干燥過程中的穩(wěn)定性和/或改良存儲時凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性。Pikal, M.Biopharm.3 (9) 26-30 (1990)和Arakawa 等人 Pharm.Res.8 (3): 285-291 (1991)。
[0406]醫(yī)藥品的噴霧干燥也已為所屬領域的技術人員所知。舉例而言，參看Broadhead, J.等人，〃The Spray Drying of Pharmaceuticals, 〃in Drug Dev.1nd.Pharm, 18 (11&12)，1169-1206 (1992)。除小分子醫(yī)藥品之外，也已將各種生物材料噴霧干燥并且所述生物材料包括:酶、`血清、血漿、微生物和酵母。噴霧干燥是一項有用的技術，這是因為其可在單步驟方法中將液體醫(yī)藥制劑轉化成精細、無塵的或成團的粉末。基本技術包含以下四個步驟:a)將進料溶液霧化成噴霧；b)噴霧-空氣接觸；c)干燥噴霧；和d)使干燥產(chǎn)物與干燥空氣分離。以引用的方式并入本文的美國專利第6，235，710號和第6，001, 800號描述通過噴霧干燥制備重組促紅細胞生成素。
[0407]本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和配方可包含醫(yī)藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。醫(yī)藥學上可接受的載劑部分是通過所投與的特定組合物以及用于投與組合物的特定方法確定。因此，存在本發(fā)明的醫(yī)藥組合物(包括可選的醫(yī)藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑)的多種適合的配方(例如參見 Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 17 版，1985))。
[0408]適合的載劑包括(但不限于)，含有琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、組氨酸或組氨酸衍生物、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鹽和其他有機酸的緩沖液；抗氧化劑，包括(但不限于)抗壞血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)小于約10個殘基的所述多肽；蛋白質(zhì)，包括(但不限于)血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷胺酰胺、組氨酸或組氨酸衍生物、甲硫氨酸、天冬酰胺、精氨酸、谷氨酸或賴氨酸；單醣、二醣和其它碳水化合物類，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，包括(但不限于)EDTA ;二價金屬離子，包括(但不限于)鋅、鈷或銅；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽反離子，包括(但不限于)鈉；和/或非離子型表面活性劑，包括(但不限于)Tween? (包括但不限于TweenSO (聚山梨酸酯80)和Tween20 (聚山梨酸酯20 ;PS20))、Pluronics?和其他普流尼克酸(pluronicacid),包括(但不限于)普流尼克酸F68 (泊洛沙姆188 (poloxamerl88))或PEG。適合的表面活性劑(例如)包括(但不限于)基于聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙烷)，意BP, (ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0)的聚醚；或基于聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)，意即，(ΡΡ0-ΡΕ0-ΡΡ0)的聚醚；或其組合。ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0 和 ΡΡ0-ΡΕ0-ΡΡ0 是以商標名 Pluronics?、R-Pluronics?、Tetronics?和 R-Tetronics?(BASF Wyandotte Corp.，Wyandotte, Mich)市售，并且另外描述于以引用的方式全部并入本文的美國專利第4，820，352號中。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可為適合的表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合可用于使PEG化的hGH抗包括(但不限于)由攪動產(chǎn)生的應力的一種或一種以上應力穩(wěn)定。一些上述表面活性劑可稱為“膨脹劑”。一些也可以稱為“張力改性劑”。額外載劑包括(但不限于)硫酸銨((NH4) SO4)ο硫酸銨((NH4) SO4)可以在約0.1mM到約200mM范圍內(nèi)的量用于本發(fā)明的配方中，所述量包括(但不限于)200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、llOmM、100mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM、lmM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM和0.1mM。組氨酸可以在約0.1mM到約200mM范圍內(nèi)的量用于本發(fā)明的配方中，所述量包括(但不限于)200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、11OmM,100mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM、lmM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM 和0.1mM。在一些實施例中，組氨酸在配方中為約5mM與約30mM之間的量。
[0409]本發(fā)明配方中的緩沖劑可在約0.1mM到約200mM范圍內(nèi)，包括(但不限于)200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、llOmM、100mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、9mM、18mM、17mM、16mM、15mM、14mM、13mM、12mM、llmM、10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、ImM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM 和 0.1mM。在一些實施例中，緩沖劑的濃度為約0.1mM到約200mM。在一些實施例中，緩沖劑的濃度為約ImM到約75mM。在一些實施例中，緩沖劑的濃度為約ImM到約20mM。在一些實施例中，緩沖劑的濃度為約5mM到約30mM。本發(fā)明配方的緩沖劑可提供在約pH4.0到約pH8.5的pH值范圍，包括(但不限于)ρΗ8.5、ρΗ8.0、ρΗ7.5、ρΗ7.0、ρΗ6.5、ρΗ6.0、ρΗ5.5、ρΗ5.0、ρΗ4.5 和 ρΗ4.0。pH 值為上文所列舉的那些pH值內(nèi)的任何十等分的pH值；例如ρΗ8.5、ρΗ8.4、ρΗ8.3、ρΗ8.2、ρΗ8.1、ρΗ8.0、ρΗ7.9、ρΗ7.8、ρΗ7.7、ρΗ7.6、ρΗ7.5、ρΗ7.4、ρΗ7.3、ρΗ7.2、ρΗ7.1、ρΗ7.0、ρΗ6.9、ρΗ6.8、ρΗ6.7、ρΗ6.6、ρΗ6.5、ρΗ6.4、ρΗ6.3、ρΗ6.2、ρΗ6.1、ρΗ6.0、ρΗ5.9、ρΗ5.8、ρΗ5.7、ρΗ5.6、ρΗ5.5、ρΗ5.4、ρΗ5.3、ρΗ5.2、ρΗ5.1、ρΗ5.0、ρΗ4.9、ρΗ4.8、ρΗ4.7、ρΗ4.6、ρΗ4.5、ρΗ4.4、ρΗ4.3、ρΗ4.2、ρΗ4.I 和 ρΗ4.0。在一些實施例中，pH 值是介于約 ρΗ6.0 與約 ρΗ7.3之間。在一些實施例中，pH值是介于約ρΗ5.5與約ρΗ8.0之間。在一些實施例中，pH值是介于約PH4.0與約pH8.5之間。在一些實施例中，pH值是介于約pH4.0與約pH7.5之間。在一些實施例中，pH值是介于約pH6.0與約pH7.5之間。
[0410]本發(fā)明配方中的氨基酸可在約0.lg/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、llg/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、lg/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L 和 0.lg/L。在一些實施例中，氨基酸是介于約0.lg/L與60g/L之間。在一些實施例中，氨基酸是介于約0.lg/L與100g/L之間。在一些實施例中，氨基酸是介于約lg/L與50g/L之間。在一些實施例中，氨基酸是介于約5g/L與25g/L之間。
[0411]本發(fā)明配方中的糖醇可在約0.lg/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、llg/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、lg/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L和0.lg/L。在一些實施例中，糖醇是介于約0.lg/L與約60g/L之間。在一些實施例中，糖醇是介于約0.lg/L與約100g/L之間。在一些實施例中，糖醇是介于約lg/L與約50g/L之間。在一些實施例中，糖醇是介于約2g/L與約25g/L之間。
[0412]本發(fā)明配方中的碳水化合物可在約0.lg/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、llg/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、lg/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L和0.lg/L。在一些實施例中，碳水化合物是介于約0.lg/L與約100g/L之間。在一些實施例中，碳水化合物是介于約lg/L與約50g/L之間。在一些實施例中，碳水化合物是介于約2g/L與約25g/L之間。在一些實施例中，碳水化合物是介于約0.lg/L與約50g/L之間。
[0413]本發(fā)明配方中的二醣可在約0.lg/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、llg/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、lg/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L 和 0.lg/L。在一些實施例中，二醣是介于約 0.lg/L 與約50g/L之間。
[0414]本發(fā)明配方中的單醣可在約0.lg/L到100g/L的范圍內(nèi)，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、llg/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、lg/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L 和 0.lg/L。
[0415]本發(fā)明配方中的非離子表面活性劑可在約0.01%到約10%的范圍內(nèi)，包括(但不限于)10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.0085%、0.008%、0.0075%、0.007%、0.0065%、0.006%、0.0055%、0.005%、0.0045%、0.004%、0.0035%、0.003%,0.0025%,0.002%,0.0015%、0.001%、0.0009%,0.0008%,0.0007%,0.0006%,0.0005%、0.0004%,0.0003%,0.0002%和0.0001%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.0001%
到約10%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.01%到約10%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.1%到約5%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.1%到約1%。在一些實施例中，非離子表面活性劑為約0.0001%到約1%。
[0416]本發(fā)明配方中hGH的醫(yī)藥量可在約0.1mg到約50mg的范圍內(nèi)，包括(但不限于)50mg、49mg、48mg、47mg、46mg、45mg、44mg、43mg、42mg、41mg、40mg、39mg、38mg、37mg、36mg、35mg、34mg、33mg、32mg、31mg、30mg、29.5mg、29mg、28.5mg、28mg、27.5mg、27mg、26.5mg、26mg、25.5mg、25mg、24.5mg、24mg、23.5mg、23mg、22.5mg、22mg、21.5mg、21mg、20.5mg、20mg、19.5mg、19mg、18.5mg、18mg、17.5mg、17mg、16.5mg、16mg、15.5mg、15mg、14.5mg、14mg、13.5mg、13mg、12.5mg、12mg、ll.5mg、llmg、10.5mg、10mg、9.5mg、9mg、8.5mg、8mg、7.5mg、7.0mg、6.5mg、6.0mg、5.5mg、5.0mg、4.5mg、4.0mg、3.5mg、3.0mg、2.5mg、2.0mg、l.5mg、
1.0mg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg 和 0.1mg0 在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約2mg與約30mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約2mg與約25mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約0.1mg與約30mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約0.1mg與約8mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約0.5mg與約8mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約0.5mg與約6mg之間。在一些實施例中，配方中hGH的醫(yī)藥量是介于約Img與約5mg之間。
[0417]也可通過持續(xù)釋放系統(tǒng)或作為持續(xù)釋放系統(tǒng)的一部分投與本發(fā)明的hGH多肽，包括與諸如PEG的水溶性聚合物連接的多肽。持續(xù)釋放組合物包括(包括(但不限于))呈包括(但不限于)膜或微膠囊的成形物品形式的半滲透聚合物基質(zhì)。持續(xù)釋放基質(zhì)包括生物相容材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-輕乙酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15:267-277(1981) ；Langer, Chem.Tech.，12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚_D-(-)-3-羥丁酸(EP133，988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美國專利第3，773,919號；EP58，481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯共聚乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸和Y -乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers, 22，547-556 (1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明質(zhì)酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多醣、核酸、聚氨基酸、氨基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持續(xù)釋放組合物也包括脂質(zhì)體誘捕化合物。含脂質(zhì)體的化合物是通過本身已知的方法制備:DE3，218，121 ;Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A., 82:3688-3692 (1985) ；Hwang 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,77:4030-4034 (1980) ；EP52, 322 ；EP36, 676 ；美國專利第 4，619，794 號；EP143, 949 ;美國專利第5，021，234號；日本專利申請案83-118008 ;美國專利第4，485，045號和第4，544，545號；和EP102，324。所引用的所有參考文獻和專利都是以引用的方式并入本文中。
[0418]經(jīng)脂質(zhì)體誘捕的hGH多肽可通過描述于(例如):DE3, 218, 121 ；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，82:3688-3692 (1985) ；Hwang 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,77:4030-4034 (1980) ；EP52, 322 ；EP36, 676 ；美國專利第 4，619，794 號；EP143, 949 ;美國專利第5，021，234號；日本專利申請案83-118008 ;美國專利第4，485，045號和第4，544，545號；和EP102，324中的方法制備。眾所周知脂質(zhì)體的組合物和尺寸或能夠容易地由所屬領域的技術人員根據(jù)經(jīng)驗確定。脂質(zhì)體的一些實例如(例如)Park JW等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:1327-1331 (1995) ；Lasic D 和 Papahadjopoulos D (編輯):MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998) ；Drummond DC 等人，Liposomal drugdelivery systems for cancer therapy, in Teicher B(編輯):CANCER DRUG DISCOVERYAND DEVELOPMENT(2002) ；Park JW 等人，Clin.Cancer Res.8:1172-1181 (2002) ；NielsenUB 等人，Biochim.Biophys.Actal591(1-3):109-118(2002) ；Mamot C 等人,CancerRes.63:3154-3161(2003)中所述。所引用的所有參考文獻和專利都是以引用的方式并入本文中。
[0419]在本發(fā)明的上下文中，投與患者的劑量應足以在受檢者體內(nèi)引起隨時間的有益反應。一般地，每劑不經(jīng)腸投與的本發(fā)明hGH多肽的總醫(yī)藥學有效量是在每公斤患者體重每天約0.01 μ g到約100 μ g或約0.05mg到約Img的范圍內(nèi)，盡管所述有效量應服從治療判斷。給藥的頻率也應服從治療判斷，并且可比批準用于人類的市售hGH多肽產(chǎn)品的頻率頻繁或稀少。一般地，本發(fā)明的PEG化hGH多肽可通過上述任何投藥途徑投與。
[0420]X1.本發(fā)明hGH多肽的治療用途
[0421]本發(fā)明的hGH多肽可用于治療多種病癥。
[0422]舉例而言，本發(fā)明的hGH激動劑多肽可用于治療生長缺陷、免疫病癥和刺激心臟功能?；加猩L缺陷的個體包括(例如)患有特納氏綜合癥的個體；缺乏GH的個體(包括兒童)；在生長板閉合前約2-3年內(nèi)正常生長曲線經(jīng)歷延緩或延遲的兒童(有時稱為“矮小兒童”);和類胰島素生長因子I (IGF-1)對GH的反應已經(jīng)化學阻斷(意即，通過糖皮質(zhì)激素治療)或通過先天條件(諸如IGF-1對GH的反應先天減小的成年患者)阻斷的個體。本發(fā)明的hGH多肽可用于治療患有以下病況的個體:兒科生長激素缺乏、特發(fā)性身材矮小、兒童期起始的成人生長激素缺乏、成人期起始的成人生長激素缺乏或繼發(fā)性生長激素缺乏。在成人期診斷為生長激素缺乏的成人可能已具有垂體腫瘤或照射。包括(但不限于)代謝綜合癥、腦損傷、肥胖癥、骨質(zhì)疏松癥或抑郁的病況可在成人體內(nèi)導致類似于生長激素缺乏的癥狀。 [0423]激動劑hGH變異體可通過增加其免疫功能而起到刺激哺乳動物免疫系統(tǒng)的作用，無論增加是由抗體介導還是細胞介導引起，且無論所述免疫系統(tǒng)對于經(jīng)hGH多肽治療的主體而言為內(nèi)源性還是從供體移植到接受hGH多肽的主體接受者(如骨髓移植物)都是如此?！懊庖卟“Y”包括個體免疫系統(tǒng)相比正常系統(tǒng)對抗原具有降低的抗體或細胞反應的任何病況，所述個體包括(但不限于)因藥物(例如化療)治療而具有降低的免疫性的小脾臟的個體。患有免疫病癥的實例個體包括(例如)，老年患者；經(jīng)歷化學療法或輻射療法的個體；從重大疾病恢復或?qū)⒁M行手術的個體；患AIDS的個體；患有諸如低丙種球蛋白血癥、普遍變化的無丙種球蛋白血癥和選擇性免疫球蛋白不足(例如，IgA不足)的先天和后天B細胞不足的患者；感染諸如狂犬病的病毒，而潛伏時間比患者的免疫反應短的患者；和患有諸如迪格奧爾格綜合癥(diGeorge syndrome)的遺傳病癥的個體。
[0424]hGH拮抗劑多肽可用于治療巨人癥和肢端肥大癥、糖尿病和由糖尿病引起的并發(fā)癥(糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病變)、眼睛血管疾病(例如，涉及增生性新血管形成)、腎病和GH反應性惡性腫瘤。
[0425]眼睛血管疾病包括(例如)視網(wǎng)膜病(例如由早產(chǎn)兒貧血病或鐮刀形紅細胞貧血病引起)和黃斑變性。
[0426]GH反應性惡性腫瘤包括(例如)，威爾姆氏腫瘤(Wilm’ s tumor)、肉瘤(例如，骨源性肉瘤)、乳癌、結腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌和表達GH受體mRNA的組織的癌癥(意即，胎盤、胸腺、腦、唾液腺、前列腺、骨髓、骨骼肌、氣管、脊髓、視網(wǎng)膜、淋巴結的癌癥和來自伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’ s lymphoma)、結腸直腸癌瘤、肺癌瘤、成淋巴細胞的白血病和黑素瘤
的癌癥)。
[0427]本發(fā)明的GH (例如hGH)激動劑多肽可用于(例如)治療慢性腎衰竭、與慢性腎功能不全(CRI)有關的生長不良、與特納氏綜合癥(Turner Syndrome)有關的身材矮小、兒科帕德維利綜合癥(Prader-Willi Syndrome, PWS)、具有消瘦或惡病體質(zhì)的HIV患者、小于孕齡出生的兒童(SGA )、肥胖和骨質(zhì)疏松癥。
[0428]hGH的平均量可變化且尤其應基于有資質(zhì)的醫(yī)師的推薦和處方。hGH的確切量優(yōu)先對以下所述因素進行考慮:所治療的病況的確切類型、所治療的患者的病況以及組合物中的其它成分。待給予的量可容易地由所屬領域的技術人員基于使用hGH的療法加以確定。
[0429]本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以常規(guī)方式來制造。
[0430]XI1.制造物品
[0431]在本發(fā)明的另一實施例中，提供含有本發(fā)明配方的制造物品，并且提供有關其使用的說明。制造物品包含容器。制造物品可含有本發(fā)明的配方，包括(但不限于)其凍干、液體、噴霧干燥或其它形式的配方，且視需要含有有關其制備或復水的說明。適當容器包括(但不限于)例如瓶、小瓶、注`射器、自動注射裝置和測試管。所述容器可由多種材料(諸如玻璃或塑料)形成。所述容器保存配方，且所述容器上或與其關聯(lián)的標記可(視需要)指示有關凍干配方復水和/或使用的指導。舉例而言，標記可指示將所述配方復水至特定蛋白質(zhì)濃度。標記可另外指示，所述配方可用于或希望用于皮下投與。保存配方的容器可為一次性或多次使用的小瓶。在一實施例中，保存配方的容器為一次性小瓶。制造物品可另外包含第二容器，其包含適當稀釋劑。在一實施例中，適當稀釋劑為注射用(USP)無菌水或抑菌水。將稀釋劑與凍干配方混合時，視需要，所述配方中最終蛋白質(zhì)的濃度一般可在約2mg/ml與約50mg/ml之間。將稀釋劑與凍干配方混合時，視需要，所述配方中最終蛋白質(zhì)的濃度一般可在約2mg/ml與約25mg/ml之間。配方中最終蛋白質(zhì)濃度一般可在約2mg/ml與約25mg/mL之間。在一實施例中,最終蛋白質(zhì)濃度為約8mg/ml。制造物品可另外包括從商業(yè)和使用者立場看合乎需要的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器和有關使用說明的包裝插頁。
[0432]實例
[0433]提供以下實例進行說明，但并非限制本發(fā)明。
[0434]實例I用于調(diào)配Met_Y35pAF hGH的材料和方法
[0435]本實例描述一項配方研究，其鑒別并評定在與PEG接合之前于儲存期間保持Met-Y35pAF hGH的蛋白質(zhì)結構和活性的適當條件和賦形劑。hGH的液體配方為冷凍配方，其含有(1)2.5g/L碳酸氫鈉、20g/L甘氨酸、2g/L甘露糖醇、2g/L乳糖，pH7.3 ;或2 )檸檬酸鈉、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇，pH6.0。加入估計劑量的0.5-4mg/mlPEG-hGH作為活性成分。當前在_20°C下儲存這些配方。需要研發(fā)包含非天然編碼的氨基酸的單劑量PEG化hGH凍干配方，或包含非天然編碼的氨基酸的PEG化hGH液體配方。
[0436]方法
[0437]實施多種方法以表征Met_Y35pAF hGH的物理和化學穩(wěn)定性。這些方法可用于有關PEG化hGH的配方研究中。
[0438]以還原性凝膠進行的SDS-PAGE (SDS-PAGE-R)專門基于分子量使hGH分離，從而使任何潛在的降解產(chǎn)物顯現(xiàn)，這是因為這項技術導致所有二硫鍵完全裂解，且引起多肽完全伸展。以非還原性凝膠進行的SDS-PAGE (SDS-PAGE-NR)是基于分子量使分子分離，從而能夠鑒別潛在的hGH 二聚體，這是由于蛋白質(zhì)在無還原劑的情況下伸展，因此存留完整的二硫鍵。
[0439]差示掃描量熱法(DSC)用于測量因熱變性而伸展的肽的ΛΗ (焓)。這一技術通過蛋白質(zhì)全部熔解溫度(Tm)的增加或降低反映評定不同溶液條件和賦形劑對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。所使用的另一技術為基于相對疏水性分離分子的反相HPLC (RP-HPLC)0具體說來，本方法是基于疏水性與和結構修飾(諸如脫酰胺化和氧化)有關的保持行為的微小差異分離hGH。
[0440]基質(zhì)和溶液
[0441]以U.S.P (美國藥典)級或高分析級賦形劑設計具有四十八種基質(zhì)的組合配方。所使用的基質(zhì)、樣本制劑和程序如下(表1):
[0442]
【權利要求】
1.一種聚乙二醇化的人生長激素(hGH)多肽的醫(yī)藥制劑，所述多肽為具有對乙酰苯丙氨酸的人生長激素，其中所述對乙酰苯丙氨酸于選自由下列所組成群組中的位置處對hGH進行取代:SEQ ID N0:2的第35、92、131、134、143以及145位；其中所述對乙酰苯丙氨酸通過一個肟鍵與一個線性聚乙二醇相連，且所述聚乙二醇的分子量為20kDa~40kDa ;其中，所述制劑為冷凍液體；其中，所述經(jīng)聚乙二醇化的hGH多肽的血清半衰期為天然未經(jīng)聚乙二醇化的hGH多肽的至少兩倍。
2.根據(jù)權利要求1 所述的醫(yī)藥制劑，其中所述制劑的濃度為每毫升14毫克hGH多肽。
【文檔編號】A61P13/12GK103520735SQ201310350030
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2005年12月21日 優(yōu)先權日:2004年12月22日
【發(fā)明者】安娜-瑪麗亞·A·海斯·普特南, 英·布徹勒, 戴維·C·利青格 申請人:Ambrx公司