蓽茇酰胺在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的運(yùn)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及抗腫瘤劑，特別涉及蓽茇酰胺及其藥用鹽在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的運(yùn)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺能夠抑制腫瘤細(xì)胞遷移，為開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物提供了新的思路。
【專(zhuān)利說(shuō)明】蓽茇酰胺在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的運(yùn)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗腫瘤劑，特別涉及蓽茇酰胺及其藥用鹽在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的運(yùn)用。

【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療失敗和患者死亡的主要原因，而轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多途徑、涉及多基因變化的一系列復(fù)雜過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，侵入血管和淋巴管，遷移、黏附于適宜部位誘導(dǎo)腫瘤血管形成，最終在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶。研究表明，腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，不僅有多種基因參與，還有一些相關(guān)因子、酶和蛋白質(zhì)等的共同作用。
[0003]蓽茇是一種多年生草質(zhì)藤本植物，中醫(yī)取其果穗入藥，主治脘腹冷痛、嘔吐、泄瀉、偏頭痛、鼻淵、外治牙痛、冠心病、心絞痛。蓽茇酰胺(piperlongumine)又稱(chēng)蓽茇明堿(piplartine)是從蓽茇中分離到的主要有效成分之一，屬生物堿類(lèi)化合物。在長(zhǎng)柄胡椒(P.sylvaticum Roxb.)及瘤突胡椒(P.tuberculatum)等胡椒科植物中也可分離到蓽發(fā)酰胺。隨著對(duì)其研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)了蓽茇酰胺的許多藥理學(xué)作用。它具有抗血小板凝集、鎮(zhèn)痛、抗真菌、抗血吸蟲(chóng)、抗焦慮以及抗抑郁等諸多藥理活性。尤其是它對(duì)多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒作用，而在相同濃度下對(duì)正常細(xì)胞的毒性非常小，是一種極具潛力的具有選擇毒力的抗腫瘤中藥單體[Raj et al.，2011，Nature475:231-4]。該化合物國(guó)外研究文獻(xiàn)呈增多趨勢(shì)，逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
[0004]研究表明蓽茇酰胺對(duì)多種腫瘤有抑制作用，它能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Bezerra DP等將60只雌性Swiss小鼠(10只/組)移植S180后，蓽茇酰胺腹腔給藥7天，然后對(duì)其腫瘤以及肝、脾、腎等器官進(jìn)行了組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)分析以評(píng)價(jià)蓽茇酰胺的毒理學(xué)性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺抑制了實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，在50mg/Kg/d和10mg/Kg/d的抑制率分別為28.7%和32.3%，其抑制率與劑量之間呈正相關(guān)。其組織病理學(xué)結(jié)果表明:蓽茇酰胺的腎毒性較大，可以導(dǎo)致臨近腎小管和腎小球上皮細(xì)胞水腫和腎小管出血[Bezerra et al., 2006, Braz J Med B1l Res39:801-7]。Bezerra DP 等用蓽發(fā)酸胺處理白血病細(xì)胞HL-60，K562，Jukart，Molt-4，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色表明，給藥12h以?xún)?nèi)，各細(xì)胞系均未出現(xiàn)生存能力的變化，在處理24h后，生存能力均出現(xiàn)明顯下降。蓽茇酰胺lOyg/mL處理24h后，5-Br-U的摻入減少和細(xì)胞致死率的增加呈正相關(guān)。形態(tài)學(xué)的變化同樣印證了這一發(fā)現(xiàn)。而低濃度(2.5μ g/mL)處理則會(huì)引起典型的細(xì)胞凋亡，在2.5μ g/mL濃度下，能夠檢測(cè)到Caspase-3的活性。因此，低濃度蓽茇酰胺可引起白血病細(xì)胞的凋亡，而高濃度則可導(dǎo)致細(xì)胞壞死[Bezerra et al., 2007, Toxicol In Vitro21:1-8]。
[0005]Kong EH等研究發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有抑制作用，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3-30 μ M的蓽茇酰胺顯著抑制了雄性激素依賴(lài)性的PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且在12-48h表現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性。蓽茇酰胺抑制PC-3細(xì)胞增殖的IC5tl值為15 μ M0 24-30 μ M的蓽茇酰胺處理24h，細(xì)胞出現(xiàn)空泡化以及染色體濃集現(xiàn)象，而且會(huì)出現(xiàn)DNA的片段化，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其抑制作用可以導(dǎo)致細(xì)胞在G2/M期停滯以及在Gl期積累。更高濃度的處理會(huì)導(dǎo)致⑶C-2表達(dá)的下調(diào)，以及PARP表達(dá)的上調(diào)，同時(shí)用蓽茇酰胺處理的PC-3細(xì)胞也會(huì)表現(xiàn)出升高的 caspase-3 活性[Kong et al., 2008, Oncol Rep20:785-92]。
[0006]發(fā)明人在研究過(guò)程中驚奇地發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺在低劑量下、在對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較弱的情況下，表現(xiàn)出顯著地抑制腫瘤細(xì)胞遷移的抑制作用。低劑量蓽茇酰胺就對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移有著顯著的抑制作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種蓽茇酰胺的新用途，具體涉及蓽茇酰胺及其藥用鹽在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的運(yùn)用。
[0008]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009]蓽茇酰胺及其藥用鹽在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的運(yùn)用，所述腫瘤包括但不限于肺癌。
[0010]鑒于現(xiàn)在已有研究表明蓽茇酰胺與某些化合物如苯基乙炔磺酰胺(中國(guó)生化藥物雜志2012，V.33 (06) 60-64)聯(lián)用能夠起到協(xié)同抗腫瘤的效果，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到蓽茇酰胺與其他具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的復(fù)配作為組合物同樣能發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，而無(wú)需付出創(chuàng)造性的勞動(dòng)，此類(lèi)組合物也應(yīng)當(dāng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011]優(yōu)選的，本發(fā)明提供的是蓽茇酰胺及其藥用鹽在制備抗非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
[0012]所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的制劑形式為液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、口崩制劑或注射劑。
[0013]本發(fā)明所述的藥用鹽，具體的可列舉上述化合物與鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸的鹽，與甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、甲磺酸、對(duì)甲基苯磺酸等有機(jī)酸和天門(mén)氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸的酸形成的鹽。
[0014]本發(fā)明的有益效果:首次發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺能夠在對(duì)細(xì)胞存活影響不大的情況下，能顯著地抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移。與目前常規(guī)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物實(shí)際上是通過(guò)殺死腫瘤細(xì)胞而間接表現(xiàn)出抗腫瘤轉(zhuǎn)移表型不同，蓽茇酰胺具有不依賴(lài)于細(xì)胞毒作用的、真正的抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移的作用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為蓽撥酰胺處理A549細(xì)胞后劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:圖1_A為A549細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后,用200 μ L的槍頭在中央劃痕，分饑餓組，溶劑對(duì)照組及不同濃度蓽茇酰胺處理細(xì)胞，分別與損傷后0h,12h和24h進(jìn)行顯微鏡(X10倍)下拍攝觀察傷口愈合情況的照片；圖1_B為定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果柱形圖，使用遷移過(guò)標(biāo)志線(xiàn)的細(xì)胞數(shù)量來(lái)反映劃痕的愈合程度，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，*代表差異顯著(P〈0.05)，林代表差異極顯著(p〈0.01);圖1-C為蓽撥酰胺處理A549細(xì)胞后細(xì)胞存活狀態(tài)的定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果柱形圖，使用撥酰胺處理后存活細(xì)胞的活性來(lái)反映細(xì)胞存活狀態(tài)，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，*代表差異顯著(P〈0.05)，**代表差異極顯著(p〈0.01 )。
[0016]圖2為蓽撥酰胺處理A549細(xì)胞后的Trans well實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2-A為接種細(xì)胞于小室內(nèi)，使用溶劑對(duì)照及不同濃度的蓽茇酰胺(5，20，40 μ Μ)作用細(xì)胞24h后，對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定，結(jié)晶紫染色和拍照(20X)所得圖。圖2-B為圖2-A中細(xì)胞數(shù)量的定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果柱形圖，將其與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，*代表差異顯著(P〈0.05)，**代表差異極顯著(ρ〈0.01)。
[0017]圖3為F-actin的分布圖。F-actin在A549細(xì)胞受到無(wú)血清培養(yǎng)基，10%含血清培養(yǎng)基與蓽茇酰胺(5，10 μ Μ)處理后的分布改變。

【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1劃痕實(shí)驗(yàn)
[0019]腫瘤細(xì)胞通過(guò)向周?chē)M織擴(kuò)增遷移，浸潤(rùn)浸入血管內(nèi)皮或淋巴管從而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，然后在新的宿主環(huán)境下，細(xì)胞大量增殖，形成轉(zhuǎn)移灶。劃痕實(shí)驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)成層的細(xì)胞表面進(jìn)行人為劃痕，可以模擬細(xì)胞在體內(nèi)的遷移過(guò)程。我們進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以考察蓽茇酰胺對(duì)Α549細(xì)胞遷移的影響。
[0020]實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備好24孔板，背面用解剖針劃好參考線(xiàn)三條，每條間距0.5cm,紫外照射所需的解剖針，24孔板，直尺。細(xì)胞鋪板后，過(guò)夜，次日觀察細(xì)胞密度達(dá)到90% ;細(xì)胞長(zhǎng)至90%后，使用無(wú)血清F-12k饑餓12h。用200 μ I槍頭比著直尺進(jìn)行劃線(xiàn)，注意槍頭垂直于well的底面，劃痕垂直于參考線(xiàn)。用PBS洗滌兩次后顯微鏡下觀察是否去除干凈劃下細(xì)胞，如果不干凈繼續(xù)洗滌，直至洗凈為止。設(shè)置饑餓對(duì)照組，和無(wú)藥品對(duì)照組以及不同濃度的藥物的實(shí)驗(yàn)組，并加入相應(yīng)的培養(yǎng)液0.5ml/孔，然后在顯微鏡下拍照。藥物處理12h，24h后分別進(jìn)行拍照觀察測(cè)量。結(jié)果如圖1-A所示。當(dāng)使用蓽茇酰胺處理后，與溶劑對(duì)照組相比較，發(fā)生遷移越過(guò)標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)的細(xì)胞數(shù)量隨著給藥濃度的增加而減少。統(tǒng)計(jì)遷移越過(guò)標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)的細(xì)胞數(shù)目，然后將其與對(duì)照組相比較，結(jié)果如圖1-B，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)蓽茇酰胺的濃度為0.625 μ M時(shí)，其發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)目與溶劑對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；當(dāng)蓽茇酰胺濃度達(dá)到1.25 μ M后，細(xì)胞遷移數(shù)目與溶劑對(duì)照組比較差異極顯著(ρ〈0.01)。綜上，蓽撥酰胺在濃度達(dá)到1.25 4 11后，可以對(duì)八549細(xì)胞的遷移有抑制作用。
[0021]實(shí)施例2Trans well 實(shí)驗(yàn)
[0022]為了進(jìn)一步確證蓽撥酰胺對(duì)A549細(xì)胞的遷移具有抑制作用，我們進(jìn)行了 Transwell實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)A549細(xì)胞，收集細(xì)胞并加入無(wú)FBS的F_12k洗滌三次；500g離心5min，力口入含有不同濃度蓽撥酰胺的F-12k，輕輕吹打混勻后加入trans well中。在24孔板中加入含有10%FBS的F-12k培養(yǎng)基。12h后進(jìn)行吉姆薩染色并拍照計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如圖2-A、2-B,由結(jié)果可以結(jié)合劃痕試驗(yàn)的結(jié)果可以得出結(jié)論:在蓽撥酰胺濃度為5μ M的條件下，可以顯著抑制Α549細(xì)胞的遷移。
[0023]實(shí)施例3ΜΤΤ法測(cè)定蓽茇酰胺對(duì)Α549細(xì)胞活性的影響
[0024]MTT [漢語(yǔ)化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]?；罴?xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
[0025]實(shí)驗(yàn)具體操作如下:96孔板中，每孔種植500-10，000個(gè)細(xì)胞，每孔體積200 μ I。留8個(gè)孔不種植細(xì)胞，做空白對(duì)照。37°〇，5%0)2條件下孵育過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。每個(gè)孔中加2μ I蓽茇酰胺(溶解于DMSO中)。放置在漩渦振蕩器上，150rpm震蕩5min，使得樣品完全混入培養(yǎng)液中。37V，5%C02條件下孵育l_5h，使得藥物發(fā)揮作用。每個(gè)96孔板準(zhǔn)備2ml MTT溶液(溶于PBS，濃度為5mg/ml)。每孔加入20 μ I MTT溶液，放置在漩渦振蕩器上，150rpm震蕩5分鐘，使得MTT完全混入培養(yǎng)液中。37°C，5%C02條件下孵育l_5h，使得MTT完全被代謝。倒掉培養(yǎng)基(可以用濾紙吸干96孔板上的殘液)。用200 μ I DMSO重懸甲臜(MTT的代謝產(chǎn)物)。放置在漩渦振蕩器上，150rpm震蕩5分鐘，使得甲臜充分的溶解。560nm處讀取光密度值，減去670nm的背景光密度值。光密度值的高低與細(xì)胞的數(shù)量呈正關(guān)。
[0026]實(shí)驗(yàn)中，我們考察無(wú)血清、血清及不同濃度蓽茇酰胺(5，10 μ M)對(duì)Α549細(xì)胞存活的影響。如圖1c，5 μ M蓽茇酰胺僅導(dǎo)致細(xì)胞的存活下降約7%，10 μ M蓽茇酰胺導(dǎo)致細(xì)胞的存活下降約17%，因此低濃度蓽茇酰胺對(duì)于腫瘤細(xì)胞的存活影響不太，即低濃度蓽茇酰胺對(duì)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用不強(qiáng)，而5 μ M蓽茇酰胺抑制腫瘤細(xì)胞遷移的活性高到35-50%以上。這個(gè)結(jié)果充分說(shuō)明:與通常抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物實(shí)際上是通過(guò)殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，并不是真正地抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，蓽茇酰胺能夠在對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷很弱的情況下，表現(xiàn)出抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的活性。因此，蓽茇酰胺具有真正地抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能，具有開(kāi)發(fā)成抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的應(yīng)用前景。
[0027]實(shí)施例4蓽茇酰胺對(duì)Α549細(xì)胞F_actin的影響
[0028]細(xì)胞的遷移是一動(dòng)態(tài)的過(guò)程，細(xì)胞前端伸出板狀的偽足，細(xì)胞前端的偽足和細(xì)胞外基質(zhì)ECM形成新的細(xì)胞黏著，胞體收縮，細(xì)胞尾端和周?chē)幕|(zhì)黏著解尚，細(xì)胞向如運(yùn)動(dòng)。在細(xì)胞黏附過(guò)程中，伴隨細(xì)胞骨架的改變。我們考察了蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞骨架分子F-actin的影響。同時(shí)由于血清也能刺激細(xì)胞骨架改變，實(shí)驗(yàn)中，我們考察無(wú)血清、血清及不同濃度蓽茇酰胺(5，10 μ M)對(duì)A549細(xì)胞F-actin分布的影響。如圖3，無(wú)血清組細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，引起細(xì)胞骨架?chē)@于核周分布，血清組細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的遷移前緣，蓽茇酰胺(5，10 μ M)減少了板狀偽足在細(xì)胞前緣的出現(xiàn)。
[0029]本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。
【權(quán)利要求】
1.蓽茇酰胺及其藥用鹽在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的運(yùn)用。
2.如權(quán)利要求1所述的運(yùn)用，其特征在于，所述腫瘤為肺癌。
3.如權(quán)利要求1或2所述的運(yùn)用，其特征在于，所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的制劑形式為液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、口崩制劑或注射劑。
【文檔編號(hào)】A61P35/04GK104415035SQ201310360539
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】華子春, 張鵬, 黃啟來(lái) 申請(qǐng)人:江蘇靶標(biāo)生物醫(yī)藥研究所有限公司