一種復(fù)合種子細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，在Sondell制備法的基礎(chǔ)上，采用改良的酶-低滲-化學(xué)除垢劑三聯(lián)萃取神經(jīng)，在體外構(gòu)建具有生物活性的組織工程周圍神經(jīng)，然后復(fù)合在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和神經(jīng)分化誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明克服了目前較為認(rèn)可的化學(xué)制備方法Sondell法在一定程度上對(duì)神經(jīng)基膜管和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞作用，減少其了對(duì)軸突再生的影響。本發(fā)明所制備的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)可應(yīng)用于制備神經(jīng)移植物，對(duì)周圍神經(jīng)缺損修復(fù)效果良好。
【專利說明】ー種復(fù)合種子細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料的組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及ー種復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]臨床上經(jīng)常遇到因腫瘤切除，創(chuàng)傷等原因造成的周圍神經(jīng)缺損問題，使患者肢體肌肉萎縮，運(yùn)動(dòng)感覺功能受到損害。治療的方法是如果缺損距離較短時(shí)，可以通過解剖游離，做到無張カ縫合，當(dāng)缺損距離過大時(shí)，通常需要進(jìn)行自體神經(jīng)移植。自體神經(jīng)移植雖然有肯定的療效并且作為其他治療方法比較的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在很多難以克服的缺點(diǎn)，最致命的缺點(diǎn)是可供選擇的神經(jīng)供體實(shí)在有限[1]。至今尚沒有ー種合適的替代物能有效的取代自體神經(jīng)移植。
[0003]材料科學(xué)、工程學(xué)和生命科學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和交叉融合產(chǎn)生了再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一門新興學(xué)科——組織工程，即應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理和方法，在正確認(rèn)識(shí)機(jī)體生理和病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)系的基礎(chǔ)上研究開發(fā)用于修復(fù)，維護(hù)，促進(jìn)人體各組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物，它是人類治療組織，器官功能衰退，缺失的一項(xiàng)新技木，與傳統(tǒng)的治療技術(shù)相比有無與倫比的優(yōu)點(diǎn)。這項(xiàng)技術(shù)的基礎(chǔ)是要有合適的細(xì)胞支架，ー種材料作為支架必須具有一下要求:生物相容性，表面相容性，結(jié)構(gòu)相容性，生物降解性，可滅菌性。過去所用的支架一般為合成支架，雖具有支架形態(tài)，結(jié)構(gòu)，強(qiáng)度，降解的可控性，也可批量生產(chǎn)，但也帶來了生物相容性差、感染等問題。
[0004]細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrixc, ECM)是組織中除細(xì)胞外的所有成分,包括均質(zhì)狀態(tài)的基質(zhì)(蛋白多糖和糖蛋白)和細(xì)絲狀的膠原纖維。近年來隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，經(jīng)大量研究表明，ECM是細(xì)胞附著的基本框架和代謝場(chǎng)所，其形態(tài)和功能直接影響所構(gòu)成的組織形態(tài)和功能。完整的ECM內(nèi)可能存在著某些復(fù)合生長因子，可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、繁殖和分化等。細(xì)胞外基質(zhì)在哺乳動(dòng)物的發(fā)育和生理活動(dòng)中起重要的作用，基質(zhì)中的很多成分，如膠原的氨基酸序列在種屬間高度保守，這種同源性也為異種細(xì)胞外基質(zhì)作為生物活性支架奠定了基礎(chǔ)。研究表明[2]，神經(jīng)ECM成分有重要的生物學(xué)功能，不僅對(duì)神經(jīng)再生有明顯的引導(dǎo)和促進(jìn)作用，并且為神經(jīng)再生構(gòu)成了良好的微環(huán)境條件。
[0005]天然神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)成分如層粘連蛋白(LN)、纖維粘連蛋白(FN)、硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)、I型膠原、IV型膠原(Type IV collagen)等大分子物質(zhì)具有促進(jìn)軸突再生的作用。其中對(duì)層粘連蛋白的研究認(rèn)為LN是有A鏈和B1鏈與B2鏈共同構(gòu)成十字架型結(jié)構(gòu)的多機(jī)能蛋白，是軸突生長方向的信息產(chǎn)物和刺激軸突生長作用最強(qiáng)的物質(zhì)，并且對(duì)干細(xì)胞的分化遷移起重要作用。LN的作用機(jī)制可能與其激活轉(zhuǎn)錄因子從而引起基因表達(dá)有夫，存在構(gòu)象改變，突觸識(shí)別及轉(zhuǎn)錄功能。LN促進(jìn)軸突再生的機(jī)制，除加速神經(jīng)突起的生長外，非常重要的是加速了干細(xì)胞的遷移和Buugner帶的形成。人硫酸肝素糖蛋白促成軸突生長的作用與層粘連蛋白和IV膠原形成一種復(fù)合物結(jié)構(gòu)，改變空間構(gòu)想從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能有夫。目前認(rèn)為LN和IV型膠原之所以能夠促進(jìn)突起的生長是因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞表面存在著能與它們功能基團(tuán)相結(jié)合的受體，當(dāng)受體與這些功能基團(tuán)結(jié)合后受體調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲，使其在細(xì)胞的邊緣聚合，受體與收縮的肌動(dòng)蛋白絲相互作用產(chǎn)生張力，調(diào)節(jié)生長錐的型態(tài)和細(xì)胞骨架的動(dòng)カ使得突起得以生長.Carbonetto等M認(rèn)為I型膠原對(duì)神經(jīng)突起的生長存在著一定的促進(jìn)作用ECM中還含有多種神經(jīng)營養(yǎng)因子如:神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠原細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)等都對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)有不同程度的營養(yǎng)活性，其中⑶NF的營養(yǎng)活性最強(qiáng)。
[0006]由此可以看出:生物體細(xì)胞外基質(zhì)是由不同含量的膠原，纖維粘連蛋白，層粘連蛋白，糖蛋白及糖胺聚糖按一定比例和結(jié)構(gòu)建成的復(fù)雜的有機(jī)的統(tǒng)一整體，含有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化遷移的各種生長因子和信號(hào)分子。就目前的技術(shù)水平看，人們還沒有能力制造出完全模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的支架，所以脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)就成為組織工程支架最佳選擇。Kim BSM等用異體的脫細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合NGF (神經(jīng)生長因子)和VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)后修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)其運(yùn)動(dòng)，傷害感受及本體感受均有顯著改善，進(jìn)ー步證實(shí)脫細(xì)胞異體神經(jīng)移植可以功能性的促進(jìn)周圍神經(jīng)再生。國內(nèi)盧世壁等[5]用三硝基甲苯和脫氧膽酸納萃取異體神經(jīng)，可將細(xì)胞及抗原脫去，并且很好的保留了基底膜和層粘連蛋白等促進(jìn)軸突再生的成分和結(jié)構(gòu)，成功得到了粗的長段的脫細(xì)胞異體神經(jīng)。盡管脫細(xì)胞異體神經(jīng)移植在國內(nèi)外已取得了一些進(jìn)展，但異體神經(jīng)來源仍然有限，供給問題還是沒有完全解決。研究表明同種異體的同一組織之間細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)是相同的，在某些不同種群之間，如豬和人的一些細(xì)胞外基質(zhì)也是相似的。
[0007]同時(shí)隨著干細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞可塑性開始受到關(guān)注。最近關(guān)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的非傳統(tǒng)可塑性在周圍神經(jīng)損傷中的應(yīng)用引起了人們的極大關(guān)注te_8]。Dezawa等[9]報(bào)導(dǎo)了在體外通過一系列細(xì)胞因子的作用后，骨髄基質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)P75，S100,等膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志，當(dāng)其移植到大鼠坐骨神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端的盲端管道后可整合入再生生長錐。Cuevas-也描述了將未誘導(dǎo)分化的骨髄基質(zhì)細(xì)胞注射入神經(jīng)損傷部位后的遷移分化和修復(fù)作用。Mel等[n]將骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成雪旺氏細(xì)胞樣細(xì)胞移植入大鼠坐骨神經(jīng)損傷處，發(fā)現(xiàn)對(duì)損傷處的雪旺氏細(xì)胞的増殖起刺激和支持作用。故骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為雪旺細(xì)胞的替代品，彌補(bǔ)了雪旺細(xì)胞的取材來源、增殖純化、抗原特性等問題。
[0008]上述的參考文獻(xiàn)具體如下:
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明解決的問題在于提供一種復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，釆用組織工程的技術(shù)方法構(gòu)建異種脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)，再用經(jīng)過神經(jīng)的誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與之復(fù)合，用于周圍神經(jīng)缺損修復(fù)，以解決周圍神經(jīng)損傷治療的難點(diǎn)。
[0021]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0022]一種復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，包括以下操作:
[0023]1)取離體的異種動(dòng)物的外周神經(jīng)組織，剔除其中的神經(jīng)外血管、脂肪及結(jié)締組織之后，用胰蛋白酶處理；胰蛋白酶處理完成后終止消化，使用低滲處理液對(duì)神經(jīng)組織進(jìn)行低滲處理；
[0024]2)將低滲處理后的神經(jīng)組織在SB-10溶液中震蕩浸泡12h以上，清洗后轉(zhuǎn)入含有Triton X200和SB-16的混合液中震蕩浸泡12h以上，清洗后得到脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)；
[0025]3)用含體積分?jǐn)?shù)10-20%的胎牛血清和1-5 μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)傳代后的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞12-24h，無菌沖洗，然后培養(yǎng)基更換為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1-2% ニ甲基亞砜和體 積分?jǐn)?shù)10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)12 -24h ；
[0026]4)將脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)用DMEM-F12培養(yǎng)基充分浸潤，吸干培養(yǎng)基后37°C孵育，然后接種誘導(dǎo)培養(yǎng)后的神經(jīng)誘導(dǎo)骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞，添加DMEM-F12培養(yǎng)，并補(bǔ)充胎牛血清至體積分?jǐn)?shù)為10-20%，于37°C、5%C02、95%濕度的條件下培養(yǎng)48小時(shí)得到復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)。
[0027]所述的外周神經(jīng)組織是在顯微鏡下仔細(xì)剔除神經(jīng)外血管、脂肪及結(jié)締組織；然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶，37°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴20-30分鐘；
[0028]傾去胰蛋白酶，PBS清洗終止胰蛋白酶消化，然后去離子水，25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴3-4小時(shí)；再將低滲處理后的神經(jīng)組織轉(zhuǎn)入滅菌的PBS溶液中潤洗。
[0029]所述的低滲處理后的神經(jīng)組織是在SB-10溶液、含有Triton X200和SB-16的混合液交替多次循環(huán)處理之后，獲得脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)。
[0030]所述的低滲處理后的神經(jīng)組織是在濃度為100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴12-15小吋，然后轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗；
[0031]清洗后次轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量濃度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴12-24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗；
[0032]清洗后第二次轉(zhuǎn)入濃度為100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴5-10小吋，然后轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗；
[0033]清洗后第二次轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量濃度0.1`4-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴10-15小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗，獲得脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)，4°C保存。
[0034]所述的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的制備及傳代培養(yǎng)為:
[0035]取骨髓組織，使用含青霉素、鏈霉素各100U/ml的DMEM-F12培養(yǎng)基，沖洗吹打制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液和Percoll分離液混合后離心，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細(xì)胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)5X 105個(gè)/ml后即接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次；
[0036]待細(xì)胞長滿瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以1 X 104個(gè)/ml傳代。
[0037]所述的步驟3)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)為:
[0038]用含體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清和3 μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)傳代后的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞24h，以無菌PBS沖洗，然后培養(yǎng)基更換為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%ニ甲基亞砜和體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。
[0039]所述的步驟4)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)為:
[0040]將脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)用DMEM-F12培養(yǎng)基浸潤12小吋，然后將培養(yǎng)基吸干，37°C下孵育5小吋；再將生長良好的神經(jīng)誘導(dǎo)骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，離心后用DMEM-F12培養(yǎng)液重懸，以104/cm2的密度接種在孵育后脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)上，以DMEM-F12為培養(yǎng)基，并補(bǔ)充胎牛血清的體積濃度至20%，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小吋，并在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞生長及污染情況。
[0041]所制備的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)在制備神經(jīng)移植物中的應(yīng)用。[0042]所制備的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)在制備周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
[0043]所制備的神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞在制備雪旺細(xì)胞替代品中的應(yīng)用。
[0044]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0045]本發(fā)明提供的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，在Sondell制備法的基礎(chǔ)上，采用改良的酶_低滲_化學(xué)除垢劑三聯(lián)萃取神經(jīng)，在體外構(gòu)建具有生物活性的組織工程周圍神經(jīng)，然后復(fù)合在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和神經(jīng)分化誘導(dǎo)骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞，用于周圍神經(jīng)缺損修復(fù)。
[0046]由于本發(fā)明采用了酶(胰蛋白酶)_低滲(去離子水)-化學(xué)除垢劑三聯(lián)萃取法，其中Triton X200、SB-10和SB-16三種相對(duì)柔和的化學(xué)萃取劑的聯(lián)合使用，克服了目前較為認(rèn)可的化學(xué)制備方法Sondell法在一定程度上對(duì)神經(jīng)基膜管和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞作用，減少其了對(duì)軸突再生的影響，從而使得本發(fā)明制備的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)具有能夠更加有效地保留神經(jīng)組織天然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)。
[0047]本發(fā)明采用神經(jīng)基質(zhì)復(fù)合分化誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)，具有良好的神經(jīng)修復(fù)效果:經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)干細(xì)胞組縫合神經(jīng)處與周圍組織無明顯粘連，與正常神經(jīng)連接處光滑無斷裂，表面可見微小血管網(wǎng)形成，似正常神經(jīng)；以所制備的骨髄干細(xì)胞為雪旺細(xì)胞的替代品，彌補(bǔ)了雪旺細(xì)胞的取材來源、增殖純化、抗原特性等缺陷，構(gòu)建的脫細(xì)胞組織工程神經(jīng)更加符合神經(jīng)組織的生理構(gòu)成，移植物的修復(fù)效果較單純脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)更加明顯?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0048]圖1是本發(fā)明制備的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)橫切片的HE染色圖片；
[0049]圖2是本發(fā)明制備的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)的Masson三色染色圖片；
[0050]圖3是本發(fā)明制備的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)的掃描電鏡圖片；
[0051]圖4是本發(fā)明制備的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)的透射電鏡圖片；
[0052]圖5是實(shí)例中神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞和脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)共培養(yǎng)后第10天相差顯微鏡下觀察的圖片，可見大量類雪旺細(xì)胞；
[0053]圖6實(shí)例中未誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞和脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)共培養(yǎng)后第10天相差顯微鏡下觀察的圖片，可見大量梭形細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0055]本發(fā)明提供的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，包括以下操作:
[0056]1)取離體的異種動(dòng)物的外周神經(jīng)組織，剔除其中的神經(jīng)外血管、脂肪及結(jié)締組織之后，用胰蛋白酶處理；胰蛋白酶處理完成后終止消化，使用低滲處理液對(duì)神經(jīng)組織進(jìn)行低滲處理；
[0057]2)將低滲處理后的神經(jīng)組織在SB-10溶液中震蕩浸泡12h以上，清洗后轉(zhuǎn)入含有Triton X200和SB-16的混合液中震蕩浸泡12h以上，清洗后得到脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)；
[0058]3)用含體積分?jǐn)?shù)10-20%的胎牛血清和1-5 μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)傳代后的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞12-24h，無菌沖洗，然后培養(yǎng)基更換為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1-2% ニ甲基亞砜和體積分?jǐn)?shù)10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)12 -24h ；
[0059]4)將脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)用DMEM-F12培養(yǎng)基充分浸潤，吸干培養(yǎng)基后37°C孵育，然后接種誘導(dǎo)培養(yǎng)后的神經(jīng)誘導(dǎo)骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞，添加DMEM-F12培養(yǎng)，并補(bǔ)充胎牛血清至體積分?jǐn)?shù)為10-20%，于37°C、5%C02、95%濕度的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，得到復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)。
[0060]本發(fā)明首先對(duì)異種生物神經(jīng)組織進(jìn)行處理，在顯微鏡下仔細(xì)剔除神經(jīng)外血管、月旨肪及結(jié)締組織，使用胰蛋白酶處理神經(jīng)，以協(xié)助破壞在細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)之間的結(jié)合，然后在使用低滲處理液(去離子水)對(duì)神經(jīng)進(jìn)行低滲處理，然后使用中性去細(xì)胞化學(xué)試劑SB-10溶液萃取，將萃取好的神經(jīng)組織用PBS緩沖液清洗后接著使用陰離子處理劑TritonX200和中性去細(xì)胞化學(xué)試劑SB-16溶液萃取，之后再循環(huán)上述化學(xué)除垢劑的處理步驟，但作用時(shí)間減少，最后達(dá)到徹底清除神經(jīng)細(xì)胞的目的以完成脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)的制備。取一定量的骨髄組織，吹打制成單細(xì)胞懸液，注入含Percoll分離液于離心管中離心，收集離心液上層云霧狀細(xì)胞，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，之后定期更換細(xì)胞液。待細(xì)胞長滿瓶底8 0%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將傳代后的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞用含胎牛血清和巰基こ醇(ΒΜΕ)的DMEM-F12培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，PBS沖洗后換成含ニ甲基亞砜(DMS0)和胎牛血清的DMEM-F12誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后分散、點(diǎn)狀注入事先制備好的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)中，置入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
[0061]所述的PBS溶液的pH為7.2-7.4 ;所述的SB-10溶液即ニ甲基硫代こ酸-10，為中性的去細(xì)胞化學(xué)劑；所述的SB-16溶液即ニ甲基硫代こ酸-16，亦為中性去細(xì)胞化學(xué)劑；所述的Triton X200溶液即三硝基甲苯X-100，為陰離子處理劑；所述的DMEM-F12培養(yǎng)基為ー種常用細(xì)胞培養(yǎng)基；所述的Percoll分離液是經(jīng)過聚こ烯卩比咯燒酮(polyvinylpyrolidone,PVP)處理的硅膠顆粒混懸液；所述的胎牛血清為常見的細(xì)胞外培養(yǎng)液，其濃度可根據(jù)不同需要調(diào)整；所述的巰基こ醇和ニ甲基亞砜均為常見的化學(xué)試劑，以上試劑和培養(yǎng)基均可從生物公司購得，0.25%胰蛋白酶消化液可自行配制或者由生物公司購得。
[0062]下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)行說明，其中脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)來源于York豬肋間神經(jīng)；骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞來源于SD大鼠骨髄。
[0063]一種復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，包括以下操作:
[0064]1)取健康York豬的外周神經(jīng)組織(肋間神經(jīng)60mm)，在顯微鏡下仔細(xì)剔除神經(jīng)外血管、脂肪及結(jié)締組織；
[0065]2)取上述處理后的神經(jīng)，加入0.25%胰蛋白酶，37°C中以100次/分鐘的頻率震蕩水浴30分鐘；
[0066]3)傾去上述容器中的胰蛋白酶，PBS清洗3遍，毎次5分鐘以終止胰酶消化，加入低滲溶液(去離子水)，25°C中以100次/分鐘的頻率震蕩水浴4小時(shí)；
[0067]4)將處理后的神經(jīng)組織轉(zhuǎn)入含有滅菌PBS溶液中潤洗；
[0068]5)轉(zhuǎn)入含有濃度為125mmol/L的SB-10處理液中，在25°C中以100次/分鐘的頻率震蕩水浴15小吋；
[0069]6)轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗15分鐘，期間PBS溶液至少更換3次；
[0070]7)轉(zhuǎn)入 0.14%Triton X200 和 0.6mmol/L SB-16 混合處理液中，在 25°C 中以 100次/分鐘的頻率震蕩水浴24小時(shí)；
[0071]8)轉(zhuǎn)入滅菌PBS清洗液中清洗3次，每次5分鐘；
[0072]9)再次轉(zhuǎn)入含有濃度為125mmol/L的SB-10處理液繼續(xù)以先前條件震蕩萃取7小時(shí)；
[0073]10)滅菌PBS溶液清洗15分鐘，每5分鐘更換1次PBS溶液；
[0074]11)再次轉(zhuǎn)入的0.14%Triton X200和0.6mmol/L SB-16混合處理液中，同先前的條件震蕩萃取15小吋；
[0075]12)轉(zhuǎn)入含有滅菌PBS溶液中，4°C保存。
[0076]13)取一定量的骨髓組織，使用無血清DMEM-F12培養(yǎng)基(含青霉素、鏈霉素各100U/ml)沖洗吹打制成單細(xì)胞懸液，按細(xì)胞懸液和Percoll分離液以1:1的比例移至離心管中，將離心半徑調(diào)至8cm，以2000r/min的速率離心20分鐘，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細(xì)胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)5X 105個(gè)/ml后即接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)全過程。待細(xì)胞長滿瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以1 X 104個(gè)/ml傳代；
[0077]具體的，將SD大鼠斷頸處死，70%こ醇消毒，無菌條件下取股骨、脛骨，剔出周圍肌肉組織，剪去兩端骨骺，抽取5ml無血清DMEM-F12培養(yǎng)基(含青霉素、鏈霉素各100U/ml)沖洗骨髄腔，吹打制成單細(xì)胞懸液，注入含有5ml的Percoll分離液的離心管中，將離心半徑調(diào)至8cm，以2000r/min的速率離心20分鐘，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細(xì)胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)5 X 105個(gè)/ml后即接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次。
[0078]14)用含20%胎牛血清和3 μ mol / Lβ-巰基こ醇(ΒΜΕ)的DMEM-F12培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)上述傳代后的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞24小吋，以無菌PBS沖洗3次，然后換成含2%ニ甲基亞砜(DMS0)和20%胎牛血清的DMEM-F12，誘導(dǎo)24小時(shí)。
[0079]15)取制備好的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)，用DMEM-F12培養(yǎng)基浸潤12小時(shí)，然后將培養(yǎng)基吸干，置于37°C的孵箱中5小吋。取生長良好的神經(jīng)誘導(dǎo)骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞，使用0.25%胰酶消化成細(xì)胞懸液，800r/min離心5分鐘，DMEM-F12重懸，以104/cm2的密度接種在自制的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)上，繼續(xù)選用為DMEM-F12培養(yǎng)基，補(bǔ)充20%胎牛血清，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞生長及污染情況。
[0080]參見圖1所示的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)橫切片的HE染色圖片，可以看到圖片中的軸突及神經(jīng)細(xì)胞均消失，代之以紅染的神經(jīng)內(nèi)膜形成的圓形空腔，周邊可見紅染的神經(jīng)束膜及外膜；
[0081]參見圖2所示的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)的Masson三色染色圖片，可以看到脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)只保存大量膠原成分(藍(lán)色);
[0082]參圖3所示的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)的掃描電鏡圖片，可以看到神經(jīng)基底膜保留，而管腔擴(kuò)大；
[0083]參見圖4所示的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)的透射電鏡圖片，可以看到神經(jīng)髓鞘完全被清除。
[0084]由圖1-圖4可知，本發(fā)明所制備的脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)脫細(xì)胞相對(duì)完全，能夠更加有效地保留神經(jīng)組織天然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0085]參見圖5、圖6，神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞和脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)共培養(yǎng)后第10天相差顯微鏡下觀察的圖片，可見大量類雪旺細(xì)胞，能夠作為雪旺細(xì)胞的替代品；而未誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞和脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)共培養(yǎng)后，可見大量梭形細(xì)胞。
[0086]下面給出所制備的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的移植實(shí)驗(yàn):
[0087]1)健康SD大鼠30只，雌雄各半，體重約180-220g/只，分成三組:復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞組、未誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞組和單純脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)組，每組10只。動(dòng)物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(用藥量0.4ml/100g)后，無菌條件下暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，在梨狀肌下緣2_ 處造成長15_的坐骨神經(jīng)缺損，三組將各自脫細(xì)胞神經(jīng)支架與兩斷端用10-0無創(chuàng)線端端吻合，之后依次縫合臀大肌及皮膚。術(shù)后肌注慶大霉素4萬単位3次(1次/4h)，分籠飼養(yǎng)。
[0088]2)術(shù)后各組大鼠精神狀態(tài)可，活動(dòng)良好，傷ロ無感染，復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠術(shù)后平均6天傷ロ愈合，足底皮膚紅腫，但無潰瘍；平均18天后術(shù)側(cè)足趾可著地行走，后蹬カ較好；未經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠術(shù)后平均7天傷ロ愈合，足底皮膚紅腫無潰瘍；平均21天后術(shù)側(cè)足趾可著地行走，后蹬カ亦較好；單純支架組大鼠5d后足底皮膚紅腫潰瘍，4周后皮膚潰瘍及傷ロ基本愈合，術(shù)后6周方可著地行走，有跛行。
[0089]3)術(shù)后3個(gè)月，針刺患肢足底，兩組復(fù)合骨髄干細(xì)胞組均有痛感，尤以符合神經(jīng)分化誘導(dǎo)組為甚，支架組痛覺不明顯；經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)干細(xì)胞組縫合神經(jīng)處與周圍組織無明顯粘連，與正常神經(jīng)連接處光滑無斷裂，表面可見微小血管網(wǎng)形成，似正常神經(jīng)，直徑較正常的神經(jīng)干稍細(xì)，其余兩組較神經(jīng)分化誘導(dǎo)組稍細(xì)，神經(jīng)分化誘導(dǎo)組術(shù)區(qū)未見粘連，手術(shù)側(cè)腓腸肌萎縮不明顯。單純神經(jīng)支架組和未誘導(dǎo)干細(xì)胞組術(shù)區(qū)仍有少量粘連，手術(shù)側(cè)腓腸肌少許萎縮。
[0090]結(jié)果表明本發(fā)明具有良好的神經(jīng)修復(fù)作用，可應(yīng)用于:制備神經(jīng)移植物、制備周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的藥物，將具有良好的神經(jīng)修復(fù)作用:經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)干細(xì)胞組縫合神經(jīng)處與周圍組織無明顯粘連，與正常神經(jīng)連接處光滑無斷裂，表面可見微小血管網(wǎng)形成，似正常神經(jīng)。
[0091]而且本發(fā)明制備的神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠作為雪旺細(xì)胞的替代品，彌補(bǔ)了雪旺細(xì)胞的取材來源、增殖純化、抗原特性等缺陷，構(gòu)建的脫細(xì)胞組織工程神經(jīng)更加符合神經(jīng)組織的生理構(gòu)成，移植物的修復(fù)效果較單純脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)更加明顯。
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，其特征在干，包括以下操作: 1)取離體的異種動(dòng)物的外周神經(jīng)組織，剔除其中的神經(jīng)外血管、脂肪及結(jié)締組織之后，用胰蛋白酶處理；胰蛋白酶處理完成后終止消化，使用低滲處理液對(duì)神經(jīng)組織進(jìn)行低滲處理； 2)將低滲處理后的神經(jīng)組織在SB-10溶液中震蕩浸泡12h以上，清洗后轉(zhuǎn)入含有Triton X200和SB-16的混合液中震蕩浸泡12h以上，清洗后得到脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)； 3)用含體積分?jǐn)?shù)10-20%的胎牛血清和1-5μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)傳代后的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞12-24h，無菌沖洗，然后培養(yǎng)基更換為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1-2% ニ甲基亞砜和體積分?jǐn)?shù)10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)12-24h ； 4)將脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)用DMEM-F12培養(yǎng)基充分浸潤，吸干培養(yǎng)基后37°C孵育，然后接種誘導(dǎo)培養(yǎng)后的神經(jīng)誘導(dǎo)骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞，添加DMEM-F12培養(yǎng)，并補(bǔ)充胎牛血清至體積分?jǐn)?shù)為10-20%，于37°C、5%C02、95%濕度的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，得到復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織 工程神經(jīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，其特征在于，所述的外周神經(jīng)組織是在顯微鏡下仔細(xì)剔除神經(jīng)外血管、脂肪及結(jié)締組織；然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶，37°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴20-30分鐘； 傾去胰蛋白酶，PBS清洗終止胰蛋白酶消化，然后去離子水，25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴3-4小時(shí)；再將低滲處理后的神經(jīng)組織轉(zhuǎn)入滅菌的PBS溶液中潤洗。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，其特征在于，所述的低滲處理后的神經(jīng)組織是在SB-10溶液、含有Triton X200和SB-16的混合液交替多次循環(huán)處理之后，獲得脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，其特征在于，所述的低滲處理后的神經(jīng)組織是在濃度為100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴12-15小吋，然后轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗； 清洗后次轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量濃度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴12-24小吋，然后轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗； 清洗后第二次轉(zhuǎn)入濃度為100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴5-10小吋，然后轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗； 清洗后第二次轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量濃度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴10-15小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入滅菌PBS溶液中清洗，獲得脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)，4°C保存。
5.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，其特征在于，所述的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的制備及傳代培養(yǎng)為: 取骨髓組織，使用含青霉素、鏈霉素各100U/ml的DMEM-F12培養(yǎng)基，沖洗吹打制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液和Percoll分離液混合后離心，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細(xì)胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)5X 105個(gè)/ml后即接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次； 待細(xì)胞長滿瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以1 X 104個(gè)/ml傳代。
6.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟3)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)為: 用含體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清和3 μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)傳代后的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞24h，以無菌PBS沖洗，然后培養(yǎng)基更換為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%ニ甲基亞砜和體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。
7.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)的制備方法，其特征在于，所 述的步驟4)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)為: 將脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)用DMEM-F12培養(yǎng)基浸潤12小時(shí)，然后將培養(yǎng)基吸干，37°C下孵育5小時(shí)；再將生長良好的神經(jīng)誘導(dǎo)骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，離心后用DMEM-F12培養(yǎng)液重懸，以104/cm2的密度接種在孵育后脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)上，以DMEM-F12為培養(yǎng)基，并補(bǔ)充胎牛血清的體積濃度至20%，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小吋，并在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞生長及污染情況。
8.權(quán)利要求1所制備的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)在制備神經(jīng)移植物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所制備的復(fù)合神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程神經(jīng)在制備周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所制備的神經(jīng)誘導(dǎo)的骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞在制備雪旺細(xì)胞替代品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61L27/38GK103446628SQ201310364793
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日
【發(fā)明者】樊立宏, 王坤正, 黨曉謙, 余澤鋒 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)