自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，尤其是表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑引起的多藥耐藥。本發(fā)明提供了自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，該自噬抑制劑可有效增加肺癌細(xì)胞對(duì)于EGFR靶向藥物的敏感性，對(duì)臨床有著重要的借鑒價(jià)值，在通過藥物治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)輔以自噬作用的抑制劑，可能將會(huì)增加人類癌癥治療的成功率。
【專利說明】自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及自自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]肺癌已成為發(fā)病率和死亡率增長最快，嚴(yán)重危害人類健康和生命的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，因此化療仍是肺癌的主要治療方法。但10多年來化療的療效并未獲得突破性進(jìn)展，靶向治療的出現(xiàn)，讓肺癌病人獲得了新的希望。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑在肺癌的治療中取得了巨大的成功，其代表藥物為吉非替尼及埃羅替尼。這兩類分子靶向藥物都已在臨床上廣泛地使用，成為非小細(xì)胞肺癌的重要治療藥物，但是由于該類祀向藥物價(jià)格昂貴，且有不少患者治療一開始即對(duì)這類藥物不敏感，或者有些患者對(duì)該類藥物初始有效但很快產(chǎn)生耐藥，患者在接受治療的不同時(shí)期內(nèi)出現(xiàn)對(duì)EGFR抑制劑不同程度的耐藥現(xiàn)象，從而使得該類治療藥物的臨床使用受到很大的限制。因此，提高EGFR抑制劑治療敏感性方法顯得尤為重要。
[0003]目前發(fā)現(xiàn)EGFR抑制劑耐藥的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面:EGFR激酶區(qū)域特異性繼發(fā)突變；酪氨酸受體高表達(dá)，下游效應(yīng)蛋白活化；非依賴于EGFR的血管生成增加；下游區(qū)介質(zhì)活化，信號(hào)途徑異常激活，如其中可能與自噬作用密切相關(guān)的PI3K-Akt信號(hào)通路的異常激活。III型PI3K家族成員屬于原`癌基因，其與蛋白激酶B(Akt)組成的PI3K-Akt信號(hào)通路，在細(xì)胞的增殖和存活中起著重要的作用。PI3K激活可導(dǎo)致Akt的完全活化，激活的Akt再通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的作用。PI3K組成性活化在EGFR耐藥的發(fā)展和維持中起到關(guān)鍵作用。PI3K組成性活化的原因有:基因擴(kuò)增、下游效應(yīng)蛋白過度表達(dá)(如Akt蛋白)，以及PTEN丟失或失活。Kokubo等的研究顯示EGFR抑制劑耐藥的亞組人群的Akt磷酸化表達(dá)增加，PTEN蛋白表達(dá)減少，而PTEN的再引入或PI3K-Akt途徑激活的藥理學(xué)下調(diào)可以作為治療耐藥的一種方案。Qin等報(bào)道Ras和Src活化可以通過激活A(yù)kt和/或Erk信號(hào)途徑而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)EFGR抑制劑耐藥。
[0004]細(xì)胞自噬是依賴溶酶體途徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種過程，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞器的自噬體為特征，自噬過程由一系列基因控制，其中關(guān)鍵的基因包括LC3和ATG7等。許多化療藥物可以引起腫瘤細(xì)胞自噬，在某些情況下，自噬的持續(xù)激活最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自噬性死亡，但相反，適度的自噬在大多情況下可以幫助腫瘤細(xì)胞面對(duì)各種死亡刺激,此時(shí)自噬表現(xiàn)為一種腫瘤細(xì)胞自我調(diào)整的生存方式，所以自噬在腫瘤治療中的作用存在兩面性。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上提出一種新的增敏肺癌靶向治療方法，即EGFR-TKI聯(lián)合抑制自噬的方法。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。[0008]具體的，所述自噬抑制劑用于逆轉(zhuǎn)表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑引起的多藥耐藥。
[0009]發(fā)明人用EGFR-TKIs吉非替尼及埃羅替尼處理肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299等細(xì)胞后，從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)水平觀察藥物處理后細(xì)胞內(nèi)的自噬現(xiàn)象，用免疫印跡的方法檢測(cè)自噬相關(guān)的信號(hào)通路，揭示其誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬的分子機(jī)理。再使用小分子抑制劑或者小RNA干擾自噬必需基因的方法抑制肺癌細(xì)胞自噬，證實(shí)抑制自噬可以增加肺癌細(xì)胞對(duì)于EGFR-TKI的敏感性。
[0010]優(yōu)選的，所述自噬抑制劑為氯喹。
[0011]優(yōu)選的，所述表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑為吉非替尼或埃羅替尼。
[0012]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，該自噬抑制劑可有效增加肺癌細(xì)胞對(duì)于EGFR靶向藥物的敏感性，對(duì)臨床有著重要的借鑒價(jià)值，在通過藥物治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)輔以自噬作用的抑制劑，可能將會(huì)增加人類癌癥治療的成功率。(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為EGFR-TKIs呈濃度(A)和時(shí)間(B)依賴性地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞LC3-1I表達(dá)。
[0014]圖2為吉非替尼誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體形成。圖中綠色熒光信號(hào)表示自噬標(biāo)志蛋白LC3-1I (LC3)，紅色熒光信號(hào)為標(biāo)記的溶酶體(Lysosome)，綠色與紅色信號(hào)共定位后出現(xiàn)的黃色信號(hào)表不自曬溶酶體(Merge)。
[0015]圖3為透射電鏡顯示吉非替尼或者埃羅替尼可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。A:對(duì)照細(xì)胞；B、C:吉非替尼處理細(xì)胞；D、E:埃羅替尼處理細(xì)胞。圖中白色箭頭為典型的自噬體及自噬溶酶體。
[0016]圖4為EGFR-TKIs可以誘導(dǎo)自噬關(guān)鍵基因ATG5及ATG7表達(dá)升高。A:Real timeRT-PCR方法檢測(cè)ATG5/7mRNA水平；RQ:用GAPDH校正后的相對(duì)定量。B:western blot方法檢測(cè)Atg5或者Atg7水平。
[0017]圖5為EGFR-TKI通過抑制Akt/mT0R/p70S6K信號(hào)通路誘導(dǎo)A549及H1299細(xì)胞自曬。
[0018]圖6為抑制自噬增加EGFR-TKIs誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞死亡。A為自噬抑制劑和溶劑處理后用MTT方法測(cè)定細(xì)胞的生長抑制曲線；B為westernblot方法檢測(cè)siRNA方法有效地下調(diào)A549細(xì)胞ATG5及ATG7基因(左側(cè))和siRNA敲除目的基因后用MTT方法測(cè)定細(xì)胞的生長抑制曲線(右側(cè))。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0020]實(shí)施例1:
[0021]EGFR-TKI吉非替尼(Gef itinib)及埃羅替尼(Erlotinib)分別處理肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299等細(xì)胞后，從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)水平證實(shí)藥物處理后細(xì)胞內(nèi)有自噬現(xiàn)象:
[0022](I)用不同濃度的吉非替尼或者埃羅替尼處理A549細(xì)胞及NC1-H1299細(xì)胞24小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取蛋白，western blot方法檢查LC3的表達(dá)變化；另外用25 μ M吉非替尼或者埃羅替尼處理Α549細(xì)胞及NC1-H1299細(xì)胞不同時(shí)間段后，收集細(xì)胞，提取蛋白，western blot方法檢查LC3的表達(dá)變化；用GAPDH作為內(nèi)參定量。用western blot方法檢測(cè)EGFR-TKIs處理后細(xì)胞內(nèi)LC3I/II的變化，結(jié)果見圖1。
[0023](2)用25 μ M吉非替尼處理Α549或者NC1-H1299細(xì)胞24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用lyso-tracker標(biāo)記溶酶體，用FITC熒光二抗標(biāo)記LC3抗體后，激光共聚焦顯微鏡成像，結(jié)果見圖2。圖中紅色表示Iyso tracker標(biāo)記的溶酶體,綠色表示FITC標(biāo)記的LC3;藍(lán)色表示DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。最右邊的一欄為重疊后照片。細(xì)胞內(nèi)桔黃色部分表示LC3與溶酶體共定位，即形成自噬溶酶體。
[0024](3)用25 μ M吉非替尼或者埃羅替尼處理Α549細(xì)胞24小時(shí)后，用用透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬現(xiàn)象的發(fā)生，結(jié)果見圖3。圖中顯示大量具有典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡形成，自噬泡內(nèi)具有各種損傷破裂的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，既為自噬體(圖中白色箭頭顯示)，Bar=I μ m。
[0025](4)用25 μ M吉非替尼處理A549細(xì)胞6小時(shí)后用Real time RT-PCR方法檢測(cè)ATG5/7mRNA水平；另外用不同濃度吉非替尼或者埃羅替尼處理A549細(xì)胞24小時(shí)后，用western blot方法檢測(cè)Atg5或者Atg7水平,結(jié)果見圖4。圖中數(shù)據(jù)用mean土SD表示,用Student’ s t test 檢驗(yàn)分析，**Ρ〈0.01。
[0026]結(jié)果:
[0027](I) EGFR-TKIs呈時(shí)間和濃度依賴性地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞LC3-1I表達(dá)。
[0028](2)吉非替尼可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞內(nèi)自曬溶酶體形成。用lyso-tracker標(biāo)記溶酶體，用FITC熒光二抗標(biāo)記LC3抗體后，激光共聚焦顯微鏡成像。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)LC3與溶酶體的共定位(綠色與紅色共定位后成黃色)，即形成自噬溶酶體。
[0029](3)透射電鏡顯示吉非替尼及埃羅替尼可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成，即藥物處理后出現(xiàn)大量具有典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，自噬泡內(nèi)具有各種損傷破裂的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。
[0030](4)EGFR-TKIs可以誘導(dǎo)自噬關(guān)鍵基因ATG5及ATG7基因在mRNA及蛋白水平表達(dá)升高。
[0031]實(shí)施例2:
[0032]EGFR-TKI誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬的機(jī)理研究，用25 μ M吉非替尼或者埃羅替尼處理肺癌細(xì)胞系Α549、Η1299細(xì)胞不同時(shí)間后，western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) phospho-(S2448)-mTOR, total mTOR,phospho-(S473)-Akt, total Akt,andphospho- (T389) -p70s6k水平變化,結(jié)果見圖5。
[0033]結(jié)果:EGFR-TKI通過抑制Akt/mT0R/p70S6K信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549及H1299自噬。
[0034]實(shí)施例3:
[0035]用小分子自噬抑制劑Chloroquine (CQ)或者RNA干擾方法敲除ATG5/7基因阻斷肺癌細(xì)胞自噬后，分析肺癌細(xì)胞對(duì)于兩種EGFR抑制劑治療的敏感性變化:
[0036]5μΜ Chloroquine(CQ)(溶劑為無菌水)或者對(duì)應(yīng)溶劑(無菌水)處理后，用12.5μ M吉非替尼或者埃羅替尼處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(Α549，Η1299及SK-MES-1 )48小時(shí)，用MTT方法測(cè)定細(xì)胞的生長抑制曲線，結(jié)果見圖6Α。[0037]siRNA敲除ATG5/7基因后，用12.5 μ M吉非替尼或者25 μ M埃羅替尼處理A549細(xì)胞48小時(shí)，用western blot檢測(cè)A549細(xì)胞ATG5及ATG7基因表達(dá)量，結(jié)果見圖6B(左側(cè))，并用MTT方法測(cè)定細(xì)胞的生長抑制曲線，結(jié)果見圖6B (右側(cè))。圖中數(shù)據(jù)用mean±SD表示，用 Student’ s t test 檢驗(yàn)分析。*Ρ〈0.05, **P〈0.01。[0038]結(jié)果:自噬小分子抑制劑CQ可以增加吉非替尼或者埃羅替尼引起的肺癌細(xì)胞毒性。siRNA方法敲除自噬必需基因ATG5或者ATG7可以顯著增加吉非替尼或者埃羅替尼引起的肺癌細(xì)胞毒性。
【權(quán)利要求】
1.自噬抑制劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述自噬抑制劑用于逆轉(zhuǎn)表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑引起的多藥耐藥。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述自噬抑制劑為氯喹。
4.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑為吉非替尼或埃羅替尼。
【文檔編號(hào)】A61K31/4706GK103505458SQ201310380007
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】韓衛(wèi)東, 潘宏銘 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)