噻加賓在制備治療多巴胺能神經(jīng)元損傷藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學中神經(jīng)病學、老年醫(yī)學及神經(jīng)藥理學領(lǐng)域，具體涉及抗癲癇藥噻加賓（Tiagabine）的新的藥用用途，本發(fā)明基于帕金森病的病理特征和GABA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的抑制性作用，在神經(jīng)毒素誘導的帕金森病小鼠模型中進行試驗，結(jié)果顯示，噻加賓（Tiagabine，γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運體拮抗劑）通過增強γ-氨基丁酸（GABA）能系統(tǒng)活性，抑制神經(jīng)炎癥，從而保護多巴胺能神經(jīng)元，對帕金森病具有治療作用?？芍苽渲委煻喟桶纺苌窠?jīng)元損傷藥物以及治療帕金森病的藥物。
【專利說明】噻加賓在制備治療多巴胺能神經(jīng)元損傷藥物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學中神經(jīng)病學、老年醫(yī)學及神經(jīng)藥理學領(lǐng)域，具體涉及抗癲癇 藥噻加賓（Tiagabine)的新的藥用用途,更具體地,涉及噻加賓在制備治療多巴胺能神經(jīng)元 損傷藥物中的用途以及在帕金森病中的保護效應。

【背景技術(shù)】
[0002] 研究顯示了帕金森?。≒D)是一種慢性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病率隨年 齡的增加而增大，據(jù)報道，在我國65歲以上的人群中ro的發(fā)病率約為1. 5%，隨著人口老齡 化進程的發(fā)展，帕金森病病人的人數(shù)呈逐年增多趨勢。目前帕金森病的確切致病原因尚不 清楚，業(yè)界普遍的觀點認為其病因有環(huán)境因素，也有遺傳因素，或是由兩者共同引發(fā)（Vila Mand Przedborski S. Nature Medicine 2004; 10Suppl:S58_62)。研究顯不帕金森病表現(xiàn) 為中腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失，神經(jīng)興奮性毒、神經(jīng)炎癥等可以導致多巴 胺能神經(jīng)元的凋亡，是ro重要的病理機制。
[0003] 臨床針對ro的治療主要包括兩大治療策略：1)以左旋多巴（L-DOPA)為主的藥物 治療；2)基于深部腦刺激（DBS)的物理治療。實踐顯示，這些治療策略均存在局限性，其中， 左旋多巴使用6年左右之后，療效會下降，并且多數(shù)ro患者常伴發(fā)出現(xiàn)"開關(guān)"現(xiàn)象、運動 障礙等嚴重并發(fā)癥；而深部腦刺激（DBS)治療存在一定的手術(shù)風險，且費用昂貴。
[0004] 噻加賓（Tiagabine)是一種哌陡衍生物，其通過拮抗Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)運體的功能 從而增強Y -氨基丁酸（GABA)能神經(jīng)傳導；Y _氨基丁酸（GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要 的抑制性遞質(zhì)。癲癇是一類電活動異常為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在臨床上噻加賓被 用于治療癲癇，其機制在于加強GABA能系統(tǒng)的活性。近來有研究表明，GABA在免疫系統(tǒng) 中同樣具有抑制性功能（Fontainhas A etal.PLoS 0ne2011;6 (l):el5973;BhatRetal. ProcNatlAcadSciUSA, 2010. 107 (6):p.2580-5;LeeMetal. Glia, 2011. 59 (I):p. 152-65)。
[0005] 本申請的發(fā)明人擬提供抗癲癇藥噻加賓的新的藥用用途，具體地，涉及噻加賓在 制備治療多巴胺能神經(jīng)元損傷藥物中的用途以及在帕金森病中的保護效應。
[0006] 與本發(fā)明先關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有：
[0007] Bhat R. et al. , Inhibitory role for GABA in autoimmune inflammation. ProcNatlAcadSci USA, 2010;107(6):p. 2580-5.
[0008] Bocchini V, Mazzol la R, Barluzzi R, Blasi E, Sick P, Kettenmann H. An immortali zed cell line expresses properties of activated microglial cells. JNeurosci Res. 1992;31(4):616-21.
[0009] Fontainhas AM, Wang M, Liang KJ, Chen S, Mettu P, Damani M, Fariss RN, Li ff, Wong WT. Microglial morphology and dynamic behavior isregulated by ionotropic glutamatergic and GABAergic neurotransmission. PLoS One. 2011;6(I):e15973.
[0010] Lee M1Schwab C1McGeer PL. Astrocytes are GABAergic cells that modulatemicroglial activity. Glia. 2011;59(I):152-65.
[0011] Vila M, Przedborski S. Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson' sdisease. NatMed. 2004;lOSuppl:S58-62. 〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是提供噻加賓在制備治療多巴胺能神經(jīng)元損傷藥物中的用途，本發(fā) 明的進一步目的是提供噻加賓在制備治療帕金森病的藥物中的用途。
[0013] 本發(fā)明基于帕金森病的病理特征和GABA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的抑制性 作用，在神經(jīng)毒素誘導的帕金森病小鼠模型中進行試驗，結(jié)果顯示，噻加賓（Tiagabine， Y _氨基丁酸轉(zhuǎn)運體拮抗劑）通過增強Y _氨基丁酸（GABA)能系統(tǒng)活性，抑制神經(jīng)炎癥，從 而保護多巴胺能神經(jīng)元，對帕金森病具有治療作用。
[0014] 在本發(fā)明的第一方面，提供了抗癲癇藥噻加賓的一種抑制小膠質(zhì)細胞激活的新功 能，包括離體實驗和在體實驗兩個方面。
[0015] 離體部分包括步驟：
[0016] (i)培養(yǎng)永生化的小鼠小膠質(zhì)細胞（BV2) (BocchiniVetal. Journal of Neuroscience Research 1992;31 (4):616_621)，實驗分為四組：對照組；Tiagabine 給藥 組；LPS 給藥組（I ii g/ml)和 Tiagabine (50 ii M)與 LPS 共給藥組；
[0017] (ii) LPS可激活（i)中BV2細胞，表現(xiàn)為：1)核轉(zhuǎn)錄因子NF-K B入核增加；2)核 轉(zhuǎn)錄因子NF-k B的活性增大，Tiagabine自身對（i)中BV2細胞的NF-k B定位沒有影響， 而Tiagabine可抑制（i)中LPS刺激的BV2細胞內(nèi)NF-k B的活性。
[0018] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中還包括給予不同濃度的Tiagabine (1，5,10,50,100， 500 u M)
[0019] 在體部分包括步驟：
[0020] (i) 10-14周齡雄性C57BL/6,實驗分為三組：對照組；MPTP給藥組（20mg/kg體 重，4次腹腔注射，每次間隔2小時）；Tiagabine (lmg/kg體重，第一次MPTP給藥前1小時 腹腔注射）與MPTP共給藥組；
[0021] (ii) MPTP可激活（i)中的黑質(zhì)-紋狀體通路中的小膠質(zhì)細胞，表現(xiàn)為：1)胞體變 大；2)突起增多；而Tiagabine可以抑制（i)中MPTP刺激下黑質(zhì)-紋狀體通路中小膠質(zhì)細 胞的活化。
[0022] 在另一優(yōu)選例中包括步驟：
[0023] (i) 10-14周齡雄性C57BL/6,實驗分為三組：對照組；LPS給藥組（0. 5 ill黑質(zhì)內(nèi) 注射，濃度為5 ii g/ yl) Jiagabine (lmg/kg體重，LPS給藥前1小時腹腔注射，LPS黑質(zhì) 內(nèi)注射后每日1次，連續(xù)3日）與LPS共給藥組；
[0024] (ii) LPS可激活（i)中的黑質(zhì)-紋狀體通路中的小膠質(zhì)細胞，表現(xiàn)為：1)胞體變 大；2)突起增多；而Tiagabine可以抑制（i)中LPS刺激下黑質(zhì)-紋狀體通路中小膠質(zhì)細 胞的活化。
[0025] 在本發(fā)明的第二方面，用上述方法獲得Tiagabine抑制小膠質(zhì)細胞的模型后，對 多巴胺能細胞具有保護作用，包括離體實驗和在體實驗兩個方面。
[0026] 離體部分包括步驟：
[0027] ( i )收集本發(fā)明的第一方面離體部分（i )中BV2細胞培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)的人多巴胺 能細胞系SH-SY5Y細胞；
[0028] (ii)分析（i)中各組細胞的活力，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后BV2細胞的培養(yǎng)液具有神經(jīng)毒 性，表現(xiàn)為減少了 SH-SY5Y細胞的存活；LPS與Tiagabine共給藥后BV2細胞培養(yǎng)液的神經(jīng) 毒性明顯降低。
[0029] 在另一優(yōu)選例中還包括給予不同濃度的Tiagabine。5,10, 50,100 U M Tiagabine 均具有保護作用。
[0030] 在體部分包括步驟：
[0031] (i)分析本發(fā)明的第一方面的在體部分（i)中黑質(zhì)-紋狀體通路的多巴胺能系 統(tǒng)，MPTP誘導紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶（TH)蛋白水平下降、TH陽性神經(jīng)末梢減少和黑質(zhì)致密 部多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量降低；而Tiagabine則顯著保護了黑質(zhì)-紋狀體通路的多巴胺能系 統(tǒng)；
[0032] (ii) Tiagabine在（i)中的保護作用還表現(xiàn)在行為學分析上，MPTP損害了小鼠的 協(xié)調(diào)運動的能力，在滾軸實驗中表現(xiàn)為整體運動水平的降低；而Tiagabine則顯著保護了 小鼠的協(xié)調(diào)運動能力。
[0033] 在另一優(yōu)選例中包括LPS可損傷黑質(zhì)-紋狀體通路的多巴胺能系統(tǒng)，表現(xiàn)為黑質(zhì) 致密部多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量降低；而Tiagabine則顯著保護了黑質(zhì)-紋狀體通路的多巴胺 能系統(tǒng)。
[0034] 在本發(fā)明的第三方面，基于上述方面獲得的結(jié)果，提供了噻加賓在制備治療多巴 胺能神經(jīng)細胞損傷相關(guān)疾病的的藥物中的用途；所述的多巴胺能神經(jīng)細胞損傷相關(guān)疾病優(yōu) 選帕金森病。
[0035] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：抗癲癇藥Tiagabine已在臨床上應用多年，本發(fā)明經(jīng)過 深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)Tiagabine具有抗小膠質(zhì)細胞激活的新功能，而且可以保護多巴 胺能神經(jīng)細胞，進一步提供了噻加賓在制備治療帕金森病的藥物中的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1顯示，培養(yǎng)BV2細胞，給予藥物處理，分析細胞中NF- K B的活性
[0037] 其中，圖IA顯示：靜息狀態(tài)下，NF-k B (p65亞單位）主要定位于細胞漿內(nèi)；給予 LPS刺激后1小時，NF-k B核定位增加，表明該通路處于激活狀態(tài)；
[0038] 圖IB顯示：給予LPS后6小時Luciferase報告基因表達明顯上升，表明NF-K B 活性增加。
[0039] 圖2顯示，LPS刺激組中條件性培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞活性明顯下降；而在LPS刺激 前預先給予不同劑量的Tiagabine (5, 10, 50, 100 ii M)可以明顯改善條件性培養(yǎng)的SH-SY5Y 細胞活性。
[0040] 圖3A，B顯示，MPTP腹腔注射后1天，紋狀體區(qū)和黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)明顯激活狀 態(tài)，數(shù)量增多，胞體變大，突起變粗；而預給予Tiagabine能夠明顯減輕小膠細胞的激活；
[0041] 圖3C顯示小鼠黑質(zhì)立體定位注射藥物后，小膠質(zhì)細胞活化情況。
[0042] 圖4顯示了小鼠模型中黑質(zhì)-紋狀體通路的特征
[0043] 圖4A顯示，MPTP給藥組紋狀體TH蛋白含量及多巴胺能神經(jīng)末梢明顯下降，黑質(zhì) 部位多巴胺能神經(jīng)元胞體明顯減少；而Tiagabine可以明顯減輕MPTP所引起的黑質(zhì)紋狀體 通路多巴胺能神經(jīng)元和末梢的丟失，Bar=IOO Ii m。；
[0044] 圖4B顯示，MPTP注射組小鼠運動能力明顯下降，而Tiagabine則可改善MPTP所 引起的小鼠運動能力的下降，*P〈〇. 05，**p〈0. 01。

【具體實施方式】
[0045] 實施例1 :培養(yǎng)BV2細胞，給予藥物處理，分析細胞中NF- K B的活性
[0046] I) NF- K B核定位研究：BV2小膠質(zhì)細胞于DMEM/F12+5%胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 根據(jù)分組分別給予 PBS ;LPS( I y g/ml);Tiagabine(50 y M);Tiagabine 預給藥 1 小時 +LPS ; LPS給藥后I小時，通過細胞免疫熒光染色及激光共聚焦成像技術(shù)，觀察NF- K B (p65亞單 位）核定位情況；如圖IA所示：靜息狀態(tài)下，NF-kB (p65亞單位）主要定位于細胞漿內(nèi)；給 予LPS刺激后1小時，NF-k B核定位增加，表明該通路處于激活狀態(tài)；預先給予Tiagabine 可以減少NF- K B的入核，抑制炎癥通路的激活；而單給予Tiagabine則對NF- K B的核定位 沒有影響。
[0047] 2)通過熒光素酶（Luciferase)報告基因系統(tǒng)檢測細胞NF-K B活性：BV2小膠質(zhì)細 胞于DMEM/F12+5%胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當細胞匯合度達90%左右時，將NF- K B螢火蟲 酶報告基因質(zhì)粒（PNFk B-Luc)與作為內(nèi)參的海腎酶基因質(zhì)粒（pCMV-Renilla)通過脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染法(Lipofectamine? 2000)共轉(zhuǎn)染入BV2細胞；轉(zhuǎn)染后24小時更換培液并將細胞移入 96孔突光檢測培養(yǎng)板；轉(zhuǎn)染后48小時，根據(jù)分組分別給予PBS ;LPS (I ii g/ml) Jiagabine (50 u M) ;Tiagabine 預給藥 1 小時 +LPS ;LPS 給藥后 6 小時檢測 Luciferase 與 Renilla 熒光素表達，如圖IB所示：給予LPS后6小時Luciferase報告基因表達明顯上升，表明 NF- K B活性增加；預給Tiagabine可明顯降低LPS引起的NF- K B激活；而單給Tiagabine 對NF-k B的激活沒有明顯影響，*p〈0. 05，#p〈0. 01與對照組相比；#p〈0. 05,與LPS組相比 較。
[0048] 實施例2 :收集BV2細胞的條件培液，加入培養(yǎng)的人多巴胺能細胞系SH-SY5Y細 胞，分析SH-SY5Y細胞的活力
[0049] 分別給予 BV2 小膠質(zhì)細胞 PBS ;LPS (I U g/ml);Tiagabine (50 U M);Tiagabine 預 給藥1小時+LPS，24小時后將各組培養(yǎng)基分別加入SH-SY5Y細胞中進行條件性培養(yǎng)，24小 時后通過MTT法檢測SH-SY5Y細胞活性；如圖2所示，LPS刺激組中條件性培養(yǎng)的SH-SY5Y 細胞活性明顯下降；而在LPS刺激前預先給予不同劑量的Tiagabine (5, 10, 50, 100 ii M)可 以明顯改善條件性培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞活性，但500 ii MTiagabine則對細胞顯示出明顯毒 性作用，#P〈〇. 01與對照組相比；#P〈〇. 05, ##p〈0. 01與LPS組相比。
[0050] 實施例3 :腹腔注射MPTP或黑質(zhì)立體定位注射LPS，結(jié)合Tiagabine預給藥，分析 小膠質(zhì)細胞的活化
[0051] 1)小鼠腹腔注射藥物后，小膠質(zhì)細胞活化情況：實驗中使用10-14周齡C57BL/6小 鼠，實驗分為三組：生理鹽水對照組；MPTP組；Tiagabine與MPTP共給藥組。MPTP急性模型 建立方法：每間隔2小時經(jīng)腹腔注射給予MPTP ? HCl (20mg/kg)，共4次；生理鹽水對照組 腹腔注射相同體積的生理鹽水；而Tiagabine預給藥組則在首次注射MPTP前1小時腹腔注 射Tiagabine(lmg/kg)。模型建立后第2天小鼠灌流取腦，固定，脫水，冰凍切片，通過免疫 熒光染色進行紋狀體和黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細胞標記物Ibal染色，觀察分析小膠質(zhì)細胞活化 情況。如圖3A，B所示，MPTP腹腔注射后1天，紋狀體區(qū)和黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)明顯激活狀 態(tài)，數(shù)量增多，胞體變大，突起變粗；而預給予Tiagabine能夠明顯減輕小膠細胞的激活。
[0052] 2)小鼠黑質(zhì)立體定位注射藥物后，小膠質(zhì)細胞活化情況：本實驗中使用10-14 周齡的C57BL/6小鼠，實驗分為三組：生理鹽水對照組；LPS組；Tiagabine與LPS共給藥 組。根據(jù)分組通過腦立體定位注射生理鹽水（0.5 ill)或LPS (0.5 iil，濃度為5 iig/iil)， Tiagabine組則在LPS給藥前1小時腹腔注射Tiagabine (lmg/kg)，并術(shù)后每日給藥1次， 連續(xù)3日，術(shù)后第4天小鼠灌流取腦，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，通過免疫 組織化學進行黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細胞標記物Ibal染色，觀察分析小膠質(zhì)細胞活化情況，如圖 3C所示。
[0053] 實施例4 :在上述小鼠模型中分析黑質(zhì)-紋狀體通路的特征
[0054] 1)通過對上述實施例3的1)中各組小鼠紋狀體、黑質(zhì)部位腦片樣本進行TH免疫 組化染色以觀察紋狀體多巴胺神經(jīng)末梢數(shù)量和黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量與形態(tài)，并通 過抽提紋狀體蛋白進行免疫印記實驗定量紋狀體中TH蛋白含量。由圖4A可見，MPTP給藥 組紋狀體TH蛋白含量及多巴胺能神經(jīng)末梢明顯下降，黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元胞體明顯 減少；而Tiagabine可以明顯減輕MPTP所引起的黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺能神經(jīng)元和末梢的 丟失，Bar=IOO u m。
[0055] 2)小鼠腹腔注射MPTP后，運動能力的行為學觀察：小鼠經(jīng)上述實施例3的1)中 所述方法進行MPTP腹腔注射建模，8天后進行滾輪實驗觀察其運動能力。Tiagabine預給 藥組則繼續(xù)每日腹腔注射1次Tiagabine(lmg/kg)，直至行為學實驗前一天，其余組則注射 相同體積生理鹽水，由圖4B所示，MPTP注射組小鼠運動能力明顯下降，而Tiagabine則可 改善MPTP所引起的小鼠運動能力的下降，*p〈0. 05, #p〈0. 01。
[0056] 3)通過對上述實施例3的2)中各組小鼠黑質(zhì)部位腦片樣品進行多巴胺能神經(jīng)元 標志物TH的免疫熒光染色觀察多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)。
[0057] 本申請實驗結(jié)果表明，LPS對黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元具有損傷作用，而 Tiagabine則保護多巴胺能神經(jīng)元。
【權(quán)利要求】
1. 噻加賓在制備神經(jīng)細胞損傷保護藥物中的用途；所述的噻加賓是氨基丁酸轉(zhuǎn)運 體拮抗劑。
2. 噻加賓在制備治療多巴胺能神經(jīng)元損傷藥物中的用途。
3. 噻加賓在制備治療多巴胺能神經(jīng)細胞損傷相關(guān)疾病的藥物中的用途。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的多巴胺能神經(jīng)細胞損傷相關(guān)疾病是 帕金森病。
5. 如權(quán)利要求1-3所述的任一項的用途，其特征在于，噻加賓通過增強氨基丁酸能 系統(tǒng)活性，抑制神經(jīng)炎癥，保護多巴胺能神經(jīng)兀。
【文檔編號】A61P25/16GK104415037SQ201310380332
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】黃芳, 劉杰 申請人:復旦大學