一種高效提取綠豆α-淀粉酶抑制劑的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效提取綠豆α-淀粉酶抑制劑的方法，所述方法是采用凝膠柱層析和乙醇沉淀從綠豆中提取并純化出組分均一的α-淀粉酶抑制劑，同時(shí)就綠豆α-淀粉酶抑制劑提取條件對(duì)豬胰α-淀粉酶抑制活性的影響做了分析，確定了綠豆α-淀粉酶抑制劑的最佳提取工藝條件。按照本發(fā)明方法提取的綠豆α-淀粉酶抑制劑對(duì)溫度具有較高的穩(wěn)定性，因此在開(kāi)發(fā)為一種安全、天然的降糖藥物中有廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種高效提取綠豆α-淀粉酶抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種綠豆α-淀粉酶抑制劑的提取方法，具體說(shuō)，是涉及一種以效率高，產(chǎn)物溫度穩(wěn)定性高而著稱(chēng)的綠豆α-淀粉酶抑制劑的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們生活水平的提高和平均壽命的延長(zhǎng)，無(wú)論是發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，肥胖、糖尿病等疾病患者都在逐年增加，減肥、降血糖等相關(guān)研究受到了越來(lái)越高的重視。由于綠豆α-淀粉酶抑制劑(a-Amylase Inhibitor, α -Al)是一種糖苷水解酶抑制劑,它通過(guò)抑制腸道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的消化吸收，選擇性地減少糖分?jǐn)z取，降低血糖和血脂的含量，減少脂肪的合成，進(jìn)而起到降糖、減肥及預(yù)防肥胖的功效。國(guó)外α-Al研究起步較早，早在上世紀(jì)四十年代就有小麥種子中α-Al的報(bào)道。它是一種電遷移率為0.2，分子量為21kDa的蛋白質(zhì)。但在隨后的二十五年間很少有這方面的報(bào)道。直到上世紀(jì)七十年 代，由于它在醫(yī)學(xué)上的價(jià)值，α-Al才成為研究的熱點(diǎn)。
[0003]綠豆(Vigna radiat α )又名青小豆，因其顏色青綠而得名，它是一種豆科、蝶形花亞科豇豆屬植物，根據(jù)營(yíng)養(yǎng)專(zhuān)家分析，綠豆的預(yù)防疾病指數(shù)為245.93，證明綠豆對(duì)疾病的康復(fù)具有相當(dāng)高的價(jià)值。綠豆供食用，亦可提取淀粉，制作豆沙、粉絲等；也可入藥，有清涼解毒、利尿明目之效。常食綠豆，對(duì)高血壓、動(dòng)脈硬化、糖尿病、腎炎有較好的治療輔助作用。此夕卜，綠豆還可以作為外用藥，嚼爛后外敷治療皮膚濕疹。
[0004]當(dāng)前，已經(jīng)從微生物(主要集中在鏈霉菌屬)、小麥、玉米、豆類(lèi)、野生莧屬等植物種子中分尚得到ct-Al,它的分子量大小在9?63kDa。目前國(guó)內(nèi)從小麥中提取α-Al的研究比較多，但從綠豆中提取α -Al，尤其是抑制活性高的，尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0005]此外，現(xiàn)有技術(shù)中α -Al大都采用傳統(tǒng)的加熱溶劑浸提法制備，在提取過(guò)程中加熱至53°C以上，容易導(dǎo)致部分淀粉發(fā)生糊化，溶液粘度增大，給后續(xù)離心分離操作帶來(lái)障礙；并且長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)降低產(chǎn)品的生物活性。提取過(guò)程中，由于工藝限制，原料不能粉碎過(guò)細(xì)，導(dǎo)致細(xì)胞壁的破碎度降低，不利于細(xì)胞中α-ΑΙ完全釋放，需要消耗大量提取溶劑進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間萃取。因此傳統(tǒng)的加熱溶劑浸提法在制備α-Al時(shí)，具有提取時(shí)間長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種以效率高，產(chǎn)品溫度穩(wěn)定性高而著稱(chēng)的綠豆α-淀粉酶抑制劑的提取方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0008]一種高效制備綠豆α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于:采用凝膠柱SephedexG-75層析和乙醇沉淀從綠豆中提取并純化出組分均一的α -淀粉酶抑制劑。
[0009]作為一種優(yōu)選方案，所述的制備方法具體包括如下步驟:
[0010]a)將脫脂綠豆粉在35?50°C溫度范圍浸泡4?20小時(shí)，然后粉碎制成100目以下的細(xì)粉；經(jīng)攪拌，12000g, 4°C，離心30min去渣；
[0011]b)用凝膠柱S印hedexG-75提取，即先以HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將步驟a)離心后取得的上清液加入HAc-NaAc緩沖液至終濃度為0.02mol/L,以0.5mL/min流速上樣，再以HAc-NaAc緩沖液洗脫提取，收集蛋白峰并逐管測(cè)定淀粉酶抑制劑活性，收集活性峰洗脫液，與預(yù)先放置于_20°C的乙醇，按照1:1?1: 3體積比混合，-20°C沉淀，提取時(shí)間即第一次S印hedexG-75提取收集活性峰洗脫液與乙醇沉淀_20°C放置的時(shí)間，范圍為I ?2h。
[0012]c) 12000g,室溫離心20min，去除上清液，清洗并減壓干燥后制得α -Al粗提品；
[0013]d)將α -Al粗提品溶于適量的HAc-NaAc緩沖液中，再使用S印hedex G_75凝膠柱，先利用HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將溶有α -Al粗提品的HAc-NaAc緩沖液上樣，流速為0.5mL/min,以HAc-NaAc緩沖液洗脫,流速為0.5mL/min,得到一蛋白主峰,逐管檢測(cè)淀粉酶抑制活性，進(jìn)而收集活性峰，經(jīng)透析、濃縮后減壓干燥，獲得純度較高的α -Al。
[0014]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述步驟b)中HAc-NaAc緩沖液濃度為0.02mol/L, pH為
4.0。
[0015]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述步驟d)中HAc-NaAc緩沖液濃度為0.02mol/L, pH為
4.0。
[0016]綠豆α -Al化學(xué)構(gòu)成測(cè)定，糖類(lèi)含量測(cè)定采用苯酚-H2S04法，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法，結(jié)果純化后的綠豆α -Al的化學(xué)組成為:蛋白質(zhì)含量為84.7%，多糖類(lèi)含量為15.3%。結(jié)果表明，綠豆α-Al成分主要是由蛋白質(zhì)組成的糖蛋白。
.[0017]綠豆α -Al活性測(cè)定，采用3，5 二硝基水楊酸比色法，即Bernfeld法，通過(guò)3，5 二硝基水楊酸與還原糖反應(yīng)顯示出紅棕色，在波長(zhǎng)546nm處比色，由于α -Al對(duì)淀粉水解有抑制作用，可使A546值下降，從而可計(jì)算待測(cè)物對(duì)淀粉酶活性的抑制率。本發(fā)明制得α-ΑΙ抑制活性為50.1?77.5IU/g。
[0018]本發(fā)明綠豆α -Al提取方法具有簡(jiǎn)單、操作控制容易、提取率高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)；制得綠豆α-ΑΙ對(duì)溫度有一定強(qiáng)度的穩(wěn)定性，安全無(wú)毒，可以有效地預(yù)防和治療糖尿病，作為天然的降糖藥物具有良好的開(kāi)發(fā)前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明的工藝流程圖
[0020]圖2為綠豆粉浸泡時(shí)間對(duì)抑制率的影響曲線(xiàn)圖
[0021]圖3為綠豆粉浸泡溫度對(duì)抑制率的影響曲線(xiàn)圖
[0022]圖4為綠豆粉提取時(shí)間對(duì)抑制率的影響圖曲線(xiàn)
[0023]圖5為原料乙醇添加比例對(duì)抑制率的影響曲線(xiàn)圖
[0024]圖6為綠豆α -淀粉酶抑制劑對(duì)溫度的穩(wěn)定性曲線(xiàn)圖
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明。
[0026]本發(fā)明中所使用試劑與儀器如下:
[0027]脫脂綠豆粉:購(gòu)自河南省信陽(yáng)市綠園食品科技有限公司；粒徑為200目[0028]豬胰α -淀粉酶(PPA)(比活力150U/mg):本實(shí)驗(yàn)室自制；
[0029]SephedexG-75:Whatman 公司；
[0030]藍(lán)淀粉:Sigma公司；
[0031]其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0032]HH-Sl 1-2型電熱恒溫水浴鍋:無(wú)錫建儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司；
[0033]752型分光光度計(jì):江蘇姜堰市光大儀器廠；
[0034]BSZ-100型自動(dòng)部分收集器、紫外檢測(cè)儀:上海青浦滬西儀器廠；
[0035]5415D 型離心機(jī):Eppendorf 公司。
[0036]FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī):天津市泰斯特儀器有限公司
[0037]Sephedex G-75 凝膠柱:規(guī)格:1.0cmx30cm ；Whatman 公司
[0038]實(shí)施例1
[0039]將5 X 0.1kg脫脂綠豆粉在40°C分別浸泡4h、8h、12h、16h、20h，然后分別利用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)制成100目以下的磨粉，經(jīng)攪拌，12000g, 4°C，離心30min去渣；
[0040]凝膠柱S印hedexG-75提取:分別使用0.02mol/L, pH為4.0HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將前一步離心后取得的上清液加入HAc-NaAc緩沖液至終濃度為0.02mol/L,以
0.5mL/min流速上樣，再以0.02mol/L, pH為4.0的HAc-NaAc緩沖液洗脫提取，收集蛋白峰并逐管測(cè)定淀粉酶抑制活性，收集活性峰洗脫液，與預(yù)先放置于_20°C的乙醇，按照1:1體積比混合，-20°C沉淀，提取時(shí)間即第一次S印hedexG-75提取收集活性峰洗脫液與乙醇沉淀_20°C放置的時(shí)間，為1.5h ；
[0041]12000g,室溫離心20min，去除上清液，清洗并減壓干燥后制得α -Al粗提品；
[0042]將五種α -Al粗提品溶于適量的HAc-NaAc緩沖液中，再分別使用S印hedex G_75凝膠柱，先以0.02mol/L pH4.0HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將溶有α -Al粗提品的HAc-NaAc緩沖液上樣，流速為0.5mL/min,以0.02mol/L pH4.0HAc-NaAc緩沖液洗脫，流速為0.5mL/min，得到一蛋白主峰，逐管檢測(cè)淀粉酶抑制活性，進(jìn)而收集活性峰，經(jīng)透析、濃縮后減壓干燥，分別獲得純度較高的α-Al，編號(hào)為α-ΑΙ-tl、a _AI_t2、a _AI_t3、a -AI_t4、 a -AI_t5。
[0043]采用Bernfeld法測(cè)定制得綠豆a -Al抑制劑活性，確定單因素綠豆粉浸泡時(shí)間對(duì)豬胰α-淀粉酶(PPA)抑制率的影響，從圖2中可以看出，12h以?xún)?nèi)抑制率隨著浸泡時(shí)間增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，超過(guò)12h后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率沒(méi)有明顯變化，由此確定單因素最適綠豆粉浸泡時(shí)間為12h。
[0044]實(shí)施例2
[0045]將5X0.11 脫脂綠豆粉分別浸泡在301:、351:、401:、451:、501:條件下12h，然后利用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)制成100目以下的磨粉，經(jīng)攪拌，12000g, 4°C，離心30min去渣；
[0046]凝膠柱S印hedexG-75提取:分別使用0.02mol/L, pH為4.0HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將前一步離心后取得的上清液平均分成五份，各自加入HAc-NaAc緩沖液至終濃度為 0.02mol/L,以 0.5mL/min 流速上樣，再分別以 0.02mol/L, pH 為 4.0 的 HAc-NaAc 緩沖液洗脫提取，收集蛋白峰并逐管測(cè)定淀粉酶抑制劑活性，收集活性峰洗脫液，與預(yù)先放置于_20°C的乙醇，按照1:1體積比混合，_20°C沉淀，提取時(shí)間即第一次S印hedexG-75提取收集活性峰洗脫液與乙醇沉淀_20°C放置的時(shí)間，為1.5h ；[0047]12000g,室溫離心20min,去除上清液,清洗并減壓干燥后制得α -Al粗提品；
[0048]將五種α -Al粗提品溶于適量的HAc-NaAc緩沖液中，再分別使用S印hedex G_75凝膠柱，先以0.02mol/L pH4.0HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將溶有α -Al粗提品的HAc-NaAc緩沖液上樣，流速為0.5mL/min,以0.02mol/L pH4.0HAc-NaAc緩沖液洗脫，流速為0.5mL/min，各得到一蛋白主峰，逐管檢測(cè)淀粉酶抑制活性，進(jìn)而收集活性峰，經(jīng)透析、濃縮后減壓干燥，分別獲得純度較高的a -Al，，編號(hào)為α-ΑΙ-tml、a-AI_tm2、a-AI_tm3、a -AI_tm4、 a -AI_tm50
[0049]采用Bernfeld法測(cè)定制得綠豆a-Al抑制劑活性，確定單因素提取溫度豬胰α-淀粉酶(PPA)抑制率的影響，從圖3中可以看出，綠豆粉浸泡溫度為45°C時(shí)抑制率最高，綠豆粉浸泡溫度為50°C時(shí)，抑制率下降，可能是因?yàn)闇囟冗_(dá)到50°C以上時(shí)，蛋白質(zhì)已經(jīng)開(kāi)始變性，所以抑制率下降，故確定單因素最佳綠豆粉浸泡溫度為45°C。
[0050]實(shí)施例3
[0051]將5X0.1kg脫脂綠豆粉在40°C浸泡12h，然后利用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)制成100目以下的磨粉，經(jīng)攪拌，12000g, 4°C，離心30min去渣；
[0052]凝膠柱S印hedexG-75提取:分別使用0.02mol/L, pH為4.0HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將前一步離心后取得的上清液平均分成五份，各自加入HAc-NaAc緩沖液至終濃度為 0.02mol/L,以 0.5mL/min 流速上樣，再分別以 0.02mol/L, pH 為 4.0 的 HAc-NaAc 緩沖液洗脫提取，收集蛋白峰并逐管測(cè)定淀粉酶抑制劑活性，收集活性峰洗脫液，與預(yù)先放置于-20°C的乙醇，按照1:1體積比混 合，_20°C沉淀，提取時(shí)間即第一次S印hedexG-75提取收集活性峰洗脫液與乙醇沉淀_20°C放置的時(shí)間，分別為0.5h、l.0h、1.5h、2.0h,2.5h ；
[0053]12000g,室溫離心20min，去除上清液，清洗并減壓干燥后制得α -Al粗提品；
[0054]將五種α -Al粗提品溶于適量的HAc-NaAc緩沖液中，再分別使用Sephedex G_75凝膠柱，先以0.02mol/LpH4.0HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將溶有α -Al粗提品的HAc-NaAc緩沖液上樣，流速為0.5mL/min,以0.02mol/L pH4.0HAc-NaAc緩沖液洗脫，流速為0.5mL/min，各得到一蛋白主峰，逐管檢測(cè)淀粉酶抑制活性，進(jìn)而收集活性峰，經(jīng)透析、濃縮后減壓干燥，分別獲得純度較高的α-Al,編號(hào)為α-ΑΙ-etl、a _AI_et2、a _AI_et3、a -AI_et4、 a -AI_et5。
[0055]采用Bernfeld法測(cè)定制得綠豆a -Al抑制劑活性，確定單因素提取時(shí)間即第一次SephedexG-75提取收集活性峰洗脫液與乙醇沉淀_20 V放置的時(shí)間，對(duì)抑制率的影響，從圖4中可以看出，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，提取液對(duì)胰蛋白酶的抑制率上升，當(dāng)達(dá)到1.5h后抑制率無(wú)明顯變化，表明已經(jīng)提取完全，因此，確定單因素最佳提取時(shí)間為1.5h。
[0056]實(shí)施例4
[0057]將5X0.1kg脫脂綠豆粉在40°C條件下浸泡12h，然后利用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)制成100目以下的磨粉，經(jīng)攪拌，12000g, 4°C，離心30min去渣；
[0058]凝膠柱S印hedexG-75提取:分別使用0.02mol/L, pH為4.0HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將前一步離心后取得的上清液平均分成五份，各自加入HAc-NaAc緩沖液至終濃度為 0.02mol/L,以 0.5mL/min 流速上樣，再分別以 0.02mol/L, pH 為 4.0 的 HAc-NaAc緩沖液洗脫提取，收集蛋白峰并逐管測(cè)定淀粉酶抑制活性，收集活性峰洗脫液，與預(yù)先放置于-20°C的乙醇，按照分別為1: 1、1: 2、1: 3、1: 4、1: 5的體積比混合，_20°C沉淀，提取時(shí)間即第一次S印hedexG-75提取收集活性峰洗脫液與乙醇沉淀_20°C放置的時(shí)間，為
1.5h ；
[0059]12000g,室溫離心20min,去除上清液,清洗并減壓干燥后制得α -Al粗提品；
[0060]將五種α -Al粗提品溶于適量的HAc-NaAc緩沖液中，再分別使用S印hedex G_75凝膠柱，先以0.02mol/L pH4.0HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將溶有α -Al粗提品的HAc-NaAc緩沖液上樣，流速為0.5mL/min,以0.02mol/L pH4.0HAc-NaAc緩沖液洗脫，流速為0.5mL/min，各得到一蛋白主峰，逐管檢測(cè)淀粉酶抑制活性，進(jìn)而收集活性峰，經(jīng)透析、濃縮后減壓干燥，分別獲得純度較高的α-Al，編號(hào)為α-ΑΙ-vrl、a _AI_vr2、a _AI_vr3、a -AI_vr4、 a _AI_vr5 ；
[0061]采用Bernfeld法測(cè)定制得綠豆a -Al抑制劑活性，確定原料單因素乙醇添加比例對(duì)抑制率的影響，從圖5中可以看出，乙醇添加比例為1: 2時(shí)，抑制率最大，故確定單因素最佳原料乙醇比例為1: 2體積比。
[0062]實(shí)施例5
[0063]本實(shí)施例為綠豆a -Al提取的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:
[0064]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在平行操作條件下，選用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，以抑制a -淀粉酶活性大小為衡量指標(biāo)，進(jìn)行9次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I和表2。
[0065]由表I中R值可以看出:各單因素對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響順序?yàn)樘崛r(shí)間c>綠豆粉浸泡溫度b>綠豆粉浸泡時(shí)間a>乙醇添加比例d。由表I中K值可以確定正交試驗(yàn)最佳的提取條件為c3b2a3dl，.即浸泡時(shí)間為16h，提取溫度為45°C，提取時(shí)間為2h，乙醇添加比例為1:1，此提取工藝最好。以此工藝條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，制得α -Al抑制率為98.5%，是所有實(shí)驗(yàn)中抑制率最高的。由表2方差分析可以看出，其中因素c為差異極顯著，因素b為差異顯著，而因素d和a對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小。
[0066]表中，K表示各因子的相同水平所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)值之和，R表示極差；
[0067]比較R值大小，可以看出某因子在這些試驗(yàn)中起主要作用或起次要作用；比較K值大小，可以知道該因子不同水平對(duì)試驗(yàn)影響的程度。
[0068]表IL9 (34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種高效制備綠豆α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于:采用凝膠柱SephedexG-75層析和乙醇沉淀從綠豆中提取并純化出組分均一的α -淀粉酶抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備綠豆α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于，所述的制備方法包括如下步驟: a)將脫脂綠豆粉在35?50°C溫度范圍浸泡4?20小時(shí)，然后粉碎制成100目以下的細(xì)粉；經(jīng)攪拌，12000g, 4°C，離心30min去渣； b)用凝膠柱SephedexG-75提取，即先以HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱,再將步驟a)離心后取得的上清液加入HAc-NaAc緩沖液至終濃度為0.02mol/L,以0.5mL/min流速上樣，再以HAc-NaAc緩沖液洗脫提取，收集蛋白峰并逐管測(cè)定淀粉酶抑制劑活性，收集活性峰洗脫液，與預(yù)先放置于-20°C的乙醇，按照1:1?1: 3體積比混合，-20°C沉淀，提取時(shí)間即第一次S印hedexG-75提取收集活性峰洗脫液與乙醇沉淀_20°C放置的時(shí)間，范圍為I?2h ； c)12000g，室溫離心20min，去除上清液，清洗并減壓干燥后制得α -Al粗提品； d)將α-Al粗提品溶于適量的HAc-NaAc緩沖液中，再使用S印hedex G_75凝膠柱，先利用HAc-NaAc緩沖液平衡凝膠柱，再將溶有α -Al粗提品的HAc-NaAc緩沖液上樣，流速為0.5mL/min,以HAc-NaAc緩沖液洗脫,流速為0.5mL/min,得到一蛋白主峰,逐管檢測(cè)淀粉酶抑制活性，進(jìn)而收集活性峰，經(jīng)透析、濃縮后減壓干燥，獲得純度較高的α -Al。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效制備綠豆α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于:所述步驟b)中使用HAc-NaAc 緩沖液濃度為0.02mol/L, pH為4.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效制備綠豆α-淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于:所述步驟d)中使用HAc-NaAc緩沖液濃度為0.02mol/L, pH為4.0。
【文檔編號(hào)】A61K36/48GK103432190SQ201310381655
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】王 琦, 王榮, 侯沁文, 雷海英 申請(qǐng)人:王 琦