漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其能降低缺血心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：漆黃素作為制備抗凝血藥物的應(yīng)用，為抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、抑制血小板釋放、降低血清Fg和vWF含量而產(chǎn)生抗凝血作用。漆黃素作為制備抗血栓形成藥物的應(yīng)用，為顯著延長(zhǎng)CT、PT、TT和APTT，間接起到抗血栓形成作用。漆黃素作為制備對(duì)缺血/再灌注心肌細(xì)胞起保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，通過抑制炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、MMP-9和NF-kB的表達(dá)、NF-kB核轉(zhuǎn)移、心肌細(xì)胞凋亡等途徑降低缺血心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少損傷心肌的梗死面積，產(chǎn)生對(duì)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
【專利說明】漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用
[0001]一、【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用。
[0002]二、【背景技術(shù)】 :
心肌缺血 / 再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)是冠心病、心肌梗死等疾病發(fā)病和防治的主要因素，如何減輕MIRI已成為防治缺血性心臟病和心臟介入治療方面的重要課題。再灌注后細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一，抑制凋亡可增加心臟射血分?jǐn)?shù)，減少再灌注心臟發(fā)生心功能不全的可能性。冠心病是導(dǎo)致人類死亡的主要病因之一，平均每年約380萬男性和340萬女性死于該病，據(jù)統(tǒng)計(jì)因?yàn)樾募≡俟嘧p傷導(dǎo)致患者死亡或心力衰竭的發(fā)生率分別為10%和25%[1-3]，因此，尋找MIRI病因，探究其發(fā)病機(jī)制，尋找其治療方案，研制有效藥物有著非常重要的意義。
[0003]三、
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的在于提供一種漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其能降低缺血心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少損傷心肌的梗死面積，產(chǎn)生對(duì)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
漆黃素作為制備抗凝血藥物的應(yīng)用，為抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、抑制血小板釋放、降低血清Fg和vWF含量而產(chǎn)生抗凝血作用。
[0005]漆黃素作為制備抗血栓形成藥物的應(yīng)用，為顯著延長(zhǎng)CT、PT、TT和APTT，間接起到抗血栓形成作用。
[0006]漆黃素作為制備對(duì)缺血/再灌注心肌細(xì)胞起保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，通過抑制炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、MMP-9和NF-kB的表達(dá)、NF-kB核轉(zhuǎn)移、心肌細(xì)胞凋亡等途徑降低缺血心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少損傷心肌的梗死面積，產(chǎn)生對(duì)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
[0007]漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其特征在于:漆黃素的劑量范圍大鼠為為5~45 mg/kg，換算為人劑量為0.8~7.2 mg/kg。
[0008]漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其特征在于:漆黃素的制成品為藥品制劑或保健食品。
[0009]漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其特征在于:漆黃素的劑型為經(jīng)口、肌肉、靜脈、透皮吸收的制劑及外用制劑。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下:
本發(fā)明涉及15mg/kg~45mg/kg的漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。所述的漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠有抗血栓活性，具有抗血小板聚集活性，其機(jī)制可能為顯著延長(zhǎng)CT、PT、TT、APTT，降低血清vWF含量，其15mg/kg~45mg/kg劑量效果與槲皮素或阿司匹林效果相當(dāng)。漆黃素通過抑制炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、MMP-9和NF-kB的表達(dá)、NF-kB核轉(zhuǎn)移、心肌細(xì)胞凋亡等途徑降低缺血心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少損傷心肌的梗死面積，產(chǎn)生對(duì)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。通過對(duì)比試驗(yàn)研究表明，本發(fā)明具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用。
[0011]四、【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1可見假手術(shù)組大鼠的心電圖變化正常。
[0012]圖2可見冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后，心電圖ST段高抬/T波高聳，標(biāo)志造模成功。
[0013]圖3為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血時(shí)間的影響(
i±SEM, n=12，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0014]圖4為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠凝血酶原時(shí)間的影響(i 土SEM，n=12，與模型組比較，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0015]圖5為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠凝血酶時(shí)間的影響(X ±SEM, η=12,
與模型組比較，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0016]圖6為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠白陶土部分凝血活酶時(shí)間的影響G±SEM, n=12，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0017]圖7為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠血漿vWF的影響(數(shù)據(jù)用? 土SEM表示，η=12，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05。與正常組相比，~Ρ〈0.05, 一Ρ〈0.01)。
[0018]圖8為漆黃素對(duì)ADP誘導(dǎo)的人血小板聚集率的影響(η=12，**Ρ<0.01，*Ρ<0.05)。
[0019]圖9為在20 μ M ADP和2 μ M NE誘導(dǎo)人血小板聚集下漆黃素和槲皮素的濃度抑制曲線。
[0020]圖10為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的影響(i 土 SEM，n=4，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0021]圖11為為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響(i 土SEM，n=8，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0022]圖12為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞NF-kB核轉(zhuǎn)移細(xì)胞總數(shù)和比率的影響 G 土SEM，n=8，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0023]圖13為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞NF-kB表達(dá)的影響(χ 土SEM，η=8，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0024]圖14為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞梗塞面積的影響(i 土SEM，n=8，與模型組比較，**ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0025]圖15為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞炎癥細(xì)胞總數(shù)及炎癥細(xì)胞百分率的影響(i ±SEM, n=8，與模型組比較，**Ρ〈0.01，*Ρ〈0.05)。
[0026]五、【具體實(shí)施方式】:
本發(fā)明為一種漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用。具體體現(xiàn)在:
漆黃素作為制備抗凝血藥物的應(yīng)用，為抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、抑制血小板釋放、降低血清Fg和vWF含量而產(chǎn)生抗凝血作用。
[0027]漆黃素作為制備抗血栓形成藥物的應(yīng)用，為顯著延長(zhǎng)CT、PT、TT和APTT，間接起到抗血栓形成作用。
[0028]漆黃素作為制備對(duì)缺血/再灌注心肌細(xì)胞起保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，通過抑制炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、MMP-9和NF-kB的表達(dá)、NF-kB核轉(zhuǎn)移、心肌細(xì)胞凋亡等途徑降低缺血心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少損傷心肌的梗死面積，產(chǎn)生對(duì)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
[0029]在實(shí)際應(yīng)用中，漆黃素的劑量范圍為5~45 mg/kg ;漆黃素的制成品為藥品制劑或保健食品；漆黃素的劑型為經(jīng)口、肌肉、靜脈、透皮吸收的制劑及外用制劑。
[0030]漆黃素具有抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn):
方法: 84只SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為七組，分別為假手術(shù)組(Shame operation)，模型組(Model),漆黃素(Fisetin)45 mg/kg、15 mg/kg、5 mg/kg 組,槲皮素組(Quercetin)和阿司匹林腸溶片組(Aspirin)陽性對(duì)照組。前兩組用0.5%的CMC-Na溶液以10 ml/kg灌胃，其它各組分別用相應(yīng)藥物的0.5%CMC-Na溶液灌胃。7 d后，在10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)下，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前室間支30 min再灌注2 h，制備心肌缺血/再灌注損傷模型。隨后，大鼠斷尾，采血測(cè)全血凝血時(shí)間(CT) ；3.8%枸櫞酸鈉抗凝采集腹主動(dòng)脈血，分離血漿，按試劑盒說明書檢測(cè)血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)和凝血活酶時(shí)間(APTT)；ELISA法檢測(cè)血漿中血管性假性血友病因子(vWF)水平。取缺血心肌，采用Annexinv/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡情況；TTC染色法測(cè)定心肌梗死面積；HE染色法測(cè)定心肌細(xì)胞的病理性病變；免疫組化方法測(cè)定NF-kB和MMP-9的表達(dá)。結(jié)果:與模型組相比較，漆黃素各劑量組、槲皮素和阿司匹林組均顯著延長(zhǎng)了心肌缺血/再灌注大鼠CT、PT、TT和APTT時(shí)間(P〈0.01或P〈0.05)。模型組血漿vWF的含量均顯著高于假手術(shù)組、漆黃素45mg/kg 和 15 mg/kg 劑量組、槲皮素(15 mg/kg)組和阿司匹林(47 mg/kg)組(Ρ〈0.05, P〈0.01 )。與假手術(shù)組比較，模型組心肌細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞壁損壞、細(xì)胞腫脹、甚至細(xì)胞核破裂、細(xì)胞顏色深淺不一以及吞噬細(xì)胞聚集。模型組心肌細(xì)胞的炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)率、凋亡率方面，ΜΜΡ-9表達(dá)、NF-kB表達(dá)和NF-kB核轉(zhuǎn)移百分率均升高(P〈0.01或Ρ〈0.05)。漆黃素45 mg/kgU5mg/kg組、陽性對(duì)照組與缺血再灌注組比較，可維持心肌纖維完整性、細(xì)胞核正常性，可降低心肌細(xì)胞凋亡百分率、抑制MMP-9和NF-kB表達(dá)以及降低NF-kB核轉(zhuǎn)移百分率(P〈0.01或P〈0.05)，其作用介于假手術(shù)組和模型組之間。漆黃素對(duì)缺血再灌損傷心肌的保護(hù)作用呈劑量依賴性。
[0031]結(jié)論:漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠有抗血栓活性，其機(jī)制可能為顯著延長(zhǎng)CT、PT、TT、APTT,降低血清VWF含量，其大、中劑量效果與槲皮素或阿司匹林效果相當(dāng)。漆黃素通過抑制炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、MMP-9和NF-kB的表達(dá)、NF-kB核轉(zhuǎn)移、心肌細(xì)胞凋亡等途徑降低缺血心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少損傷心肌的梗死面積，產(chǎn)生對(duì)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
[0032]材料和方法 1.1動(dòng)物
SD大鼠，雌雄各半，體重180-220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK (陜)2007-001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK (陜)2007-003。所有動(dòng)物均按照陜西省動(dòng)物養(yǎng)護(hù)和使用委員會(huì)提供的指導(dǎo)原則進(jìn)行對(duì)待。動(dòng)物房室溫(26±3)°C，相對(duì)濕度(30-70)%，每日人工照明12 h，每天上下午各換氣0.5 h按性別分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂顆粒飼料。[0033]1.2藥品和試劑
阿司匹林腸溶片，洛陽奧吉娜藥業(yè)有限公司，批號(hào)121004 ；
95%乙醇，西安化學(xué)試劑廠，批號(hào):120612 ；
枸櫞酸鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20121108 ；
硫酸氫氯吡格雷片，濟(jì)南樂康信藥業(yè)有限公司，批號(hào)080301 ；
雙嘧達(dá)莫注射液，山西亞保藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào):216126 ；
鹽酸腎上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)070412 ；
PT試劑盒，上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2001092 ；
APTT試劑盒，上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2011102 ；
TT試劑盒，上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號(hào):2021036。
[0034]阿司匹林，Sigma，美國(guó)，貨號(hào)A 2093-100G ;
漆黃素，陜西昌岳植物技術(shù)有限公司，批號(hào)121016 ；
阿司匹林腸溶片，華東醫(yī)藥(西安)博華制藥有限公司，批號(hào)1103009 ；
槲皮素，陜西昌岳植物技術(shù)有限公司，批號(hào)121116 ；
水合氯醛，上海山浦化工有限公司，批號(hào)121004 ；
福爾馬林，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120708 ；
75%酒精，寶雞市康利工貿(mào)有限公司，批號(hào)20130103 ；
二甲苯，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，批號(hào)20081001 ；
磷酸氫二鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，20121108 ；
磷酸二氫鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，20121108 ；
生理鹽水，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110508 ；
2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美國(guó)Sigma公司)，中國(guó)華東師范大學(xué)化工廠，
批號(hào) 20121122 ；
5%牛血清蛋白(BSA)，武漢博士德生物工程有限公司；
SABC，武漢博士德生物工程有限公司；
一抗(大鼠)，武漢博士德生物工程有限公司；
生物素化山羊抗大鼠IgG，武漢博士德生物工程有限公司；
鏈霉素親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物免疫組化試劑(SABC)，武漢博士德生物工程有限公司；
二氨基苯甲氨(DAB)，武漢博士德生物工程有限公司；
免疫組化試劑盒NF-kB、MMP-9，武漢博士德生物工程公司；
凱基Annexin V-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；
1.3主要儀器
SC-2000型四通道血小板聚集儀型，上海天呈科技有限公司；
LDZ5-2尚;1_1、機(jī)，北點(diǎn)醫(yī)用尚;1_1、機(jī)/)^ ；
BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；
FCR0502-UF除熱原型超純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司；
動(dòng)物人工呼吸機(jī)DH- 150，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠；
AB 135-S型電子分析天平，Mettler Toledo,瑞士；NICHIRYO自動(dòng)移液器，日本；
XW-80A漩渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；
CQ-120超聲波清洗機(jī)，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠；
10 μ L、20 μ L微量進(jìn)樣器，上海安亭微量進(jìn)樣器廠；
HHS電熱恒溫水浴鍋，江蘇省醫(yī)療器械廠；
FACS Calibur 流式細(xì)胞儀，Becton Dickinson,美國(guó)；
Powerlab/8sp數(shù)據(jù)記錄和分析系統(tǒng)，ADInstruments, Austrilia,澳大利亞；
Leica RM 2235型徠卡手動(dòng)轉(zhuǎn)輪切片機(jī)，德國(guó)徠卡；
Microm GmbH HM 505E Cryostat, Walldrof, Gernany,德國(guó)；
BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都臺(tái)盟科技有限公司；自動(dòng)移液槍，NICHIRYO,日本；NIKON ECLIPSE BOI 顯微鏡，日本，分析系統(tǒng) Image-Pro Plus 6.1 Windows S/N ;手術(shù)器械、
秒表等。
[0035]2試驗(yàn)方法
2.1心肌缺血/再灌注模型的制備
84只SD大鼠雌雄各半，隨機(jī)分為七組。分別為:假手術(shù)組，模型組，漆黃素大、中、小劑量組，槲皮素組及阿司匹林腸溶片陽性對(duì)照組，手術(shù)組和缺血再灌注組每天用0.5% CMC-Na溶液灌胃，其它各組用相應(yīng)藥物的0.5% CMC-Na溶液灌胃。7 d天后，用10%水合氯溶液(4ml/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，用電極插入大鼠四肢皮下記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖。氣管切開，插氣管插管。再于胸骨左緣3~4肋間開胸，暴露心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈干間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前室間支，同時(shí)在結(jié)扎線與血管之間穿一段直徑1.5 mm,長(zhǎng)0.5 cm的硅膠管,結(jié)扎30min，結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色發(fā)紺，心電圖表現(xiàn)ST段抬高或T波高聳為結(jié)扎成[14]。剪斷縫合線，取出硅膠管，缺血部位心肌顏色恢復(fù)，抬高的ST段下降50%以上外圍模型成功，再灌注
2h，假手術(shù)組僅分離前室間支，不結(jié)扎。
[0036]2.2全血凝血時(shí)間(CT)試驗(yàn)
大鼠心肌缺血/再灌注造模成功后，剪大鼠尾(據(jù)末端0.5~1cm)，取血2滴血分開滴于玻璃片上(直徑4~5mm)，自血液滴在玻片上開始計(jì)時(shí)，每隔30s用Iml注射器針頭通過血滴，并挑血液一次，如見針尖挑起纖維蛋白絲，停止計(jì)時(shí)，記錄全血凝血(CT)時(shí)間。再挑動(dòng)另一滴未挑過的血液作對(duì)照，并以前一滴血作為結(jié)果報(bào)告。
[0037]2.3 PT、TT、APTT 和 vWF 檢測(cè)
大鼠心肌缺血/再灌注造模成功后,腹主動(dòng)脈采血,將4ml注入放有3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中(抗凝劑和全血的比例為1:9),輕度混勻,3000r/min離心15min。首先,收集上層血漿0.8ml，放置于1.5mLEP管中，常溫下，按試劑盒說明書操作，測(cè)定凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)及活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT);其次，收集上層血漿0.8ml，放置于1.5mLEP管中，按照vWF試劑盒說明書測(cè)定的水平。
[0038]2.4血小板聚集抑制試驗(yàn)
2.4.1采血及血小板制備
人抗凝血采自健康志愿者肘前靜脈，以3.8%枸櫞酸鈉:全血為1: 9抗凝。上下顛倒試管混勻，1000r/min離心IOmin,制備富血小板血衆(zhòng)(PRP);吸取上清后,3000r/min離心lOmin，制備貧血小板血漿(PPP)，取無溶血現(xiàn)象的血漿備用。用PPP調(diào)節(jié)PRP中血小板數(shù)，使達(dá)到250個(gè)/nL。為了避免血小板被激活，以上操作均在室溫下進(jìn)行。
[0039]2.4.2藥物溶液配制 漆黃素(6X10_3mol/L):稱取漆黃素固體1.72mg，加l%Na2C03溶液127 μ L，超聲溶解，加生理鹽水至lmL，并調(diào)節(jié)PH至7.0。槲皮素(6X 10_3mol/L):稱取槲皮素固體1.81mg，加1% Na2CO3溶液159 μ L，超聲溶解，加生理鹽水至lmL，并調(diào)節(jié)PH至7.0。雙嘧達(dá)莫(120父10-611101/1):取雙嘧達(dá)莫注射液(21^: 10mg)12.1 μ L，加生理鹽水至lmL。阿司匹林(3mg/mL):取3mg阿司匹林溶于適量l%Na2C03水溶液中，調(diào)PH至7.0,總體積為lmL。氯吡格雷(360 μ g/mL):稱取0.36mg固體，加生理鹽水至lmL。3.8%枸櫞酸鈉:取1.9g枸櫞酸鈉固體，加生理鹽水溶解至50mL。NE (120 μ mol/L)的配制:取鹽酸腎上腺素注射液(lmg/mL) 13.2 μ L，加生理鹽水至500mL。阿司匹林臨用前溶于適量l%Na2C03水溶液中，以0.9%氯化鈉稀釋，以HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0。ADP用生理鹽水配制成3 000 μ mo I/L的溶液分裝備用，臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。
[0040]2.4.3血小板聚集實(shí)驗(yàn)步驟
取含血小板數(shù)為250個(gè)/nL的血漿300 μ L，置四通道血小板聚集儀的測(cè)定樣品方杯中，分別加入生理鹽水、漆黃素(終濃度分別為I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T8和 I X l(T10mol/L)、槲皮素(終濃度分別為 I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T8 和lXl0.mol/L)、氯吡格雷(終濃度為3 X Kr5 mol/L)、和雙嘧達(dá)莫(終濃度為2X1(T6 mol/L)和阿司匹林(終濃度為2.8X10_4 mol/L)，37°C培育20 min后，用PRP調(diào)節(jié)透光率為0%，用PPP調(diào)節(jié)透光率為100%。各受試管分別加入ADP (終濃度為20 μ mol/L)和腎上腺素(終濃度為2 μ mol/L)、誘導(dǎo)血小板活化，同時(shí)加入磁子攪拌后，開始計(jì)時(shí)，記錄血小板抑制率。并計(jì)算血小板聚集抑制率(%)=(對(duì)照組血小板聚集率-給藥組血小板聚集率)/對(duì)照組血小板聚集率X 100%。
[0041]2.5心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定
Annexinv/PI雙染，流式細(xì)胞儀測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡水平:再灌注后取缺血區(qū)心肌組織5mm3約70 mg,步驟:(I)將左心室肌至于5-6 mL D-Hanks液中剪碎洗凈,后棄去D-Hanks液體；(2)加入0.08%胰蛋白酶10 mL、室溫、輕搖消化5 min ; (3)過200目尼龍網(wǎng)并收集濾液，加含小牛血清的培養(yǎng)液10 mL終止消化；(4)于1800 r/min離心10 min,棄去上清液,加含小牛血清的培養(yǎng)液5 mL，吹散細(xì)胞、于1800 r/min再離心10 min，棄去上清液；(5)加PBS ImL，吹散細(xì)胞，取200 μ L細(xì)胞懸液做流式，將細(xì)胞重懸于300 μ L Binding Buffer，加入3μ L Annexin V-EGFP 和 3 μ L Propidium 1dide (PI)，混勻，室溫避光反應(yīng) 20 min,上機(jī)檢測(cè)，自動(dòng)計(jì)算凋亡心肌細(xì)胞的百，結(jié)果判斷:Annexin V —/PI —為正常細(xì)胞，Annexin V VPI 一為凋亡細(xì)胞，Annexin V +/PI+為壞死細(xì)胞；(6)取200 μ L做流式；(7)按照AnnexinV-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書方法加試劑；(8)上機(jī)檢測(cè)[15_17]。
[0042]2.6 NF-kb 和 MMP-9 表達(dá)的測(cè)定
免疫組化方法測(cè)定NF-kB和MMP-9的表達(dá):①M(fèi)MP-9:取材同上，石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H202室溫20 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次。用0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0)進(jìn)行抗原熱修復(fù)。磷酸鹽緩沖液(PBS) (pH7.2)洗滌2次。滴加5%牛血清蛋白(BSA)封閉，室溫放置20 min。甩去多余液體，滴加1: 100稀釋的一抗(大鼠)，4°C放置過夜。PBS (pH7.2)洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗大鼠IgG，37°C反應(yīng)20 min。PBS (pH7.2)洗3次，每次2 min。滴加鏈霉素親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物免疫組化試劑(SABC)，37 °C反應(yīng)30 min。PBS (pH7.2)洗4次，每次5 min。二氨基苯甲胺(DAB)顯色劑室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，HE輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察MMP-9表達(dá)情況
[18]。②NF-kB:再灌注2 h后，取左心室前壁的部分肌肉組織，10%福爾馬林固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化染色按試劑盒說明書采用SABC法、DAB顯色、蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。鼠抗NF-kB p65單克隆抗體與NF-kB結(jié)合后理論上顯棕黃色顆粒。每組取8個(gè)樣本，于高倍顯微鏡(400倍)下，每個(gè)樣本取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)NF-kB表達(dá)及其核轉(zhuǎn)移百分率[19】]。實(shí)驗(yàn)設(shè)備，Olympus BX51 Positive Position FluorescenceMicroscope, Japan。圖像分析軟件，Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)。
[0043]2.7心肌細(xì)胞梗死面積
TTC染色法測(cè)定心肌梗死面積:再灌注2 h后，經(jīng)主動(dòng)脈根部注入0.1~0.2 mL 1%TTC緩沖液，每組4例，將心臟置于37 °C恒溫箱孵化30 min后，再放置于_20°C冰箱冷凍20 min。用生理鹽水清洗，去除附著的血管和脂肪，從心尖到心基底平行切取I mm厚心肌片。正常心肌組織將被染成紅色，梗死區(qū)為灰白色，照相，用Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)梗死面積[21_24]。
[0044]2.8心肌細(xì)胞病理變化測(cè)定
HE染色法測(cè)定心肌細(xì)胞的病理性變化:再灌注2 h后，每組8例，取左心室前壁70大小心肌肉組織塊，10%福爾馬林固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化[25’26]。
[0045]2.9統(tǒng)計(jì)分析方法
用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件spssl3.0處理數(shù)據(jù)，結(jié)果均用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(土 SEM )表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P〈0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P〈0.01表示有顯著性差異。用GraphPad Prism
5.0軟件繪圖。
[0046]3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1動(dòng)態(tài)心電圖監(jiān)測(cè)
圖1可見，假手術(shù)組大鼠的心電圖變化正常。圖2可見，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后，心電圖ST段聞抬/T波聞聳，標(biāo)志造|旲成功。
[0047]3.2心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血時(shí)間
圖3可見，與模型組相比較，漆黃素各劑量組、槲皮素和阿司匹林組均顯著延長(zhǎng)了心肌缺血/再灌注大鼠CT時(shí)間(P〈0.01或Ρ〈0.05)，漆黃素45mg/kg、15mg/kg延長(zhǎng)CT效果與阿司匹林(47mg/kg)劑量組或槲皮素(15mg/kg)沒有顯著性差異。結(jié)果表明，漆黃素可明顯延長(zhǎng)心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血時(shí)間。
[0048]圖3為漆黃素對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠全血凝血時(shí)間的影響(χ土SEM，n=12，與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05)
3.3心肌缺血/再灌注大鼠PT、TT、APTT
由圖4、圖5和圖6可見，同模型組相比，漆黃素45mg/kg、15mg/kg和5mg/kg三個(gè)劑量組PT、TT和APTT顯著延長(zhǎng)(P〈0.01或P〈0.05)，且對(duì)PT的影響呈劑量相關(guān)性。與模型組比較，槲皮素(15mg/kg)組和阿司匹林(47mg/kg)組可延長(zhǎng)ΡΤ(Ρ〈0.05)。結(jié)果表明，漆黃素可延長(zhǎng)心肌缺血再灌大鼠PT、TT和APTT值，具有抗凝血作用，且延長(zhǎng)TT和APTT的效果優(yōu)于槲皮素和阿司匹林。
[0049]3.4心肌缺血/再灌注大鼠vWF因子
圖7可見，模型組血漿vWF的含量均顯著高于假手術(shù)組、漆黃素45mg/kg和15mg/kg劑量組、槲皮素(15mg/kg)組和阿司匹林(47mg/kg)組(P〈0.05，P〈0.01)。與假手術(shù)組相比較，阿司匹林顯著降低了血漿vWF的含量(P〈0.01)。結(jié)果表明，漆黃素可降低心肌缺血再灌大鼠血漿vWF的含量，具有抗血小板聚集作用。
[0050]3.5血小板聚集試驗(yàn)
圖8可見，I X KT9M~I X KT5M漆黃素、雙嘧達(dá)莫(終濃度為2X10—6 mol/L)、氯比格雷(終濃度為3X10_5 mol/L)和阿司匹林(終濃度為2.8X10_4 mol/L)同模型組相比有顯著性差異(P〈0.01)。圖9可見，使用Scott比值法計(jì)算漆黃素的IC5tl為4.54XlO-7M,槲皮素IC502.71 X IO-7M,漆黃素和槲皮素對(duì)人血小板聚集的影響呈劑量相關(guān)性。結(jié)果表明漆黃素能顯著抑制血小板聚集率，且比雙嘧達(dá)莫、氯比格雷和阿司匹林作用效果明顯。
[0051]3.6心肌細(xì)胞凋亡率
圖10可見，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexinv-EGFP標(biāo)記的心肌細(xì)胞調(diào)亡情況，模型組與假手術(shù)組比較，心肌細(xì)胞凋亡率升高(P〈0.05)。45mg/kg和15mg/kg漆黃素組、槲皮素組和阿司匹林組，與模型組比較，可顯著抑制缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡(P〈0.01或P〈0.05)，漆黃素抑制缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的凋亡有劑量依賴關(guān)系。
[0052]3.7 MMP-9 和 NF_kb 的表達(dá)
MMP-9參與炎癥反應(yīng)，主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，染色呈淡黃色顆粒。圖11可見，模型組與假手術(shù)組比較表達(dá)有顯著差異(P〈0.01)，45mg/kg漆黃素組、15mg/kg漆黃素組及槲皮素組與模型組比較，抑制MMP-9表達(dá)(P〈0.01)，其分布和密度都減少。15mg/kg漆黃素組和15mg/kg槲皮素組效果相當(dāng)。
[0053]NF-kb具有逆轉(zhuǎn)錄功能的結(jié)構(gòu)蛋白，表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)中。模型組與假手術(shù)組比較，黃色顆粒密度大、分布廣、核轉(zhuǎn)移顯著(p〈0.01)。漆黃素各組及槲皮素組與模型組比較，可明顯抑制其表達(dá)和核轉(zhuǎn)移(P〈0.01)。槲皮素組較15mg/kg漆黃素組抑制其表達(dá)作用接近。見圖12和圖13。
[0054]3.8心肌細(xì)胞梗死面積
圖14可見，大鼠心肌缺血再灌注后TTC染色，選擇染色紅色的正常心肌，進(jìn)行灰度統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，各組正常心肌面積，模型組與正常組比較，有較大面積梗死(P〈0.01);漆黃素各劑量組、槲皮素、阿司匹林與模型組比較，顯著降低了心肌梗死面積(p〈0.01或P〈0.05)，且漆黃素各組有劑量依賴性。結(jié)果表明，漆黃素可抑制心肌缺血再灌大鼠的缺血心肌的壞死。
[0055]3.9心肌細(xì)胞病理變化
模型組與假手術(shù)組(p〈0.01)比較心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化明顯，心肌肌絲排列紊亂，橫紋模糊不清楚，肌原纖維明暗帶清晰；模型組心肌細(xì)胞嚴(yán)重水腫，大量吞噬細(xì)胞聚集，細(xì)胞膜模糊，細(xì)胞核腫脹、變淡、破裂溶解，肌絲斷裂、溶解；漆黃素各劑量組、槲皮素組與模型組比較心肌纖維結(jié)構(gòu)損傷程度明顯減輕，心肌肌絲排列整齊，橫紋清楚，細(xì)胞、細(xì)胞核膜完整，肌原纖維明暗清晰(p〈0.01或P〈0.05)。見圖15。
【權(quán)利要求】
1.漆黃素作為制備抗凝血藥物的應(yīng)用，為抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、抑制血小板釋放、降低血清vWF含量而產(chǎn)生抗凝血作用。
2.漆黃素作為制備抗血栓形成藥物的應(yīng)用，為顯著延長(zhǎng)CT、PT、TT和APTT，間接起到抗血栓形成作用。
3.漆黃素作為制備對(duì)缺血/再灌注心肌細(xì)胞起保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，通過抑制炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、MMP-9和NF-kB的表達(dá)、NF-kB核轉(zhuǎn)移、心肌細(xì)胞凋亡途徑降低缺血心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少損傷心肌的梗死面積，產(chǎn)生對(duì)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其特征在于:漆黃素的劑量范圍為5~45 mg/kg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其特征在于:漆黃素的制成品為藥品制劑或保健食品。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的漆黃素作為制備抗凝血、抗血栓形成和心肌保護(hù)作用藥物的應(yīng)用，其特征在于: 漆黃素的劑型為經(jīng)口、肌肉、靜脈、透皮吸收的制劑及外用制劑。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK103536587SQ201310384907
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】龍麗輝, 李亞軍, 劉凱歌, 曹永孝, 郭增軍, 馬星明, 劉琳潔 申請(qǐng)人:西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院