一種肽的制備方法及其在制備藥物和飼料添加劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明“一種肽的制備方法及其在制備藥物和飼料添加劑中的應(yīng)用”，涉及生物制藥技術(shù)。本發(fā)明的肽具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列，經(jīng)細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證，其具有對(duì)乙肝病毒的明顯抑制作用，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證，其還有全面改善動(dòng)物健康狀態(tài)的作用；本發(fā)明還提供了基因工程方法制備該多肽的方案，能制備得到克級(jí)以上的肽產(chǎn)物。本發(fā)明的肽在抗病毒、全面改善動(dòng)物健康狀態(tài)等方面的作用，使其能夠作為制備人和動(dòng)物都可以使用的治療藥物和保健產(chǎn)品的主要成分，應(yīng)用于治療藥物、健康產(chǎn)品和飼料添加劑中。
【專利說(shuō)明】一種肽的制備方法及其在制備藥物和飼料添加劑中的應(yīng)用 第一部分：【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及一種肽(Mytilin B)及其在制備治療藥物、 健康產(chǎn)品和飼料添加劑中的應(yīng)用、制備方法。 第二部分：【背景技術(shù)】
[0002] 防御素是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，天然免疫物 質(zhì)，分子量在3000?7000左右，由20?60個(gè)氨基酸殘基組成，多個(gè)二硫鍵。這類活性多 肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性、以及廣譜抗菌等特點(diǎn)。天然的防御素分布在從植物、低等動(dòng) 物到哺乳動(dòng)物等幾乎所有的生物類群中，是生物自身防御體系的重要組成部分。
[0003] 多數(shù)防御素能有效殺滅革蘭陰性細(xì)菌和革蘭陽(yáng)性細(xì)菌。在體外濃度為10? IOOmg / L的防御素即對(duì)多種細(xì)菌具有殺傷作用，而防御素在中性粒細(xì)胞中的濃度為g / L 級(jí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)上述數(shù)值，這表明在體內(nèi)防御素可能具有更強(qiáng)的殺菌活性，目前研究發(fā)現(xiàn)防御 素對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的殺傷能力明顯要強(qiáng)于革蘭陰性細(xì)菌。在體外，HBD-2對(duì)大腸桿菌的半數(shù) 致死量（LD50)為0. 46nmol / ml，最小抑菌濃度（MIC)為15yg / ml，而對(duì)綠膿桿菌、金黃 色葡萄球菌的MIC為62yg / mi。體外實(shí)驗(yàn)證明大多數(shù)防御素的MIC范圍為0. 5-ΙΟμπιοΙ / L〇
[0004] 防御素還能殺滅一些被膜病毒,如HIV、皰疹病毒、水泡型口炎病毒，但對(duì)無(wú)衣殼病 毒卻無(wú)效。Θ-防御素還具有抗濾過(guò)性病原體和抗毒素作用。防御素主要通過(guò)與病毒外殼 蛋白結(jié)合從而導(dǎo)致病毒喪失生物活性，這一特殊作用機(jī)理也使得微生物不易對(duì)其產(chǎn)生抵抗 性。防御素可直接抑制病毒，對(duì)病毒的抑制程度依賴于防御素濃度以及分子內(nèi)二硫鍵的緊 密程度，其抗病毒功效同樣受時(shí)間、PH值、離子強(qiáng)度和溫度等因素的影響，在中性及低離子 強(qiáng)度條件下，防御素具有較強(qiáng)的抗病毒活性。
[0005] 防御素不僅可以直接抵抗病原微生物，而且還具有免疫調(diào)節(jié)作用。防御素通過(guò)細(xì) 胞信號(hào)傳遞的作用，增強(qiáng)非特異性免疫細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞的活性和趨化性。防御素還可 以促進(jìn)機(jī)體T細(xì)胞的趨化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力，調(diào)節(jié)特異性免疫，增強(qiáng)生物機(jī)體 主動(dòng)防御功能。防御素能夠作為一種效應(yīng)分子激活巨噬細(xì)胞、DC、氣管上皮細(xì)胞等細(xì)胞表 面受體從而啟動(dòng)獲得性免疫系統(tǒng)，并將先天性免疫和獲得性免疫有機(jī)連接?，F(xiàn)已證明一些 α -防御素 、β -防御素對(duì)T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及未成熟的DC具有趨化活性，可誘導(dǎo)單核細(xì) 胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。人、鼠、豬、兔的中性粒細(xì)胞防御素可以誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒 并釋放組胺。β-防御素還能通過(guò)與人趨化因子受體6 (CCR6)結(jié)合，從而吸引不成熟的樹(shù)突 狀細(xì)胞（DC)和記憶T細(xì)胞（Tm)至炎癥部位，激活細(xì)胞免疫和體液免疫。此外，防御素還可 以直接促進(jìn)感染部位中性粒細(xì)胞的補(bǔ)充和積聚。
[0006] 抗生素添加劑的使用嚴(yán)重破壞了動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡，藥物殘留也影響了畜產(chǎn) 品的品質(zhì)和人類健康，而來(lái)源于貝類、哺乳動(dòng)物的防御素相對(duì)分子質(zhì)量較小，熱穩(wěn)定性和水 溶性均較奸，可以在腸道內(nèi)吸收。由于防御素屬于多肽成分，在體內(nèi)容易被蛋白酶降解為 氨基酸，動(dòng)物采食后在體內(nèi)一般無(wú)殘留。利用基因工程方法生產(chǎn)環(huán)保型防御素飼料添加劑 或通過(guò)日糧添加，都可有效提高免疫、防止疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)，如減少死胎、木乃伊及殘疾；提 高初生重及仔豬出生均勻度；提高仔豬斷奶重、斷奶成活率，降低哺乳期仔豬發(fā)病率；降低 哺乳母豬發(fā)病率，減少母、仔豬各種應(yīng)激；改善母豬亞健康和繁殖障礙，延長(zhǎng)母豬使用年限； 提高保育豬成活率，降低發(fā)病率；提高保育豬日增重、降低料肉比；改善免疫抑制，提高免 疫應(yīng)答能力，抗體水平更整齊。
[0007] 源自地中海貽貝的防御素 Mytilin B氨基酸序列如Seq ID No. 3所示，其由34個(gè) 氨基酸殘基組成，4個(gè)二硫鍵，復(fù)合螺旋和β結(jié)構(gòu)。Mytilin B防御素具有廣譜活性，能抑 制革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌，同時(shí)具有抗病毒的活性。Mytilin B防御素利用N端所帶的正電荷 與原核細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞膜磷脂雙分子層密集的負(fù)電荷靜電相吸，C端柔性的插入疏水區(qū)， 在兩親性α -螺旋作用下，在原核細(xì)胞膜上形成4nm的離子通道，離子通道的形成改變了細(xì) 胞膜內(nèi)外的滲透壓，細(xì)胞膜內(nèi)物質(zhì)大量外滲，致細(xì)菌細(xì)胞死亡，起到殺菌作用。Mytilin B防 御素的抗病毒機(jī)理是與病毒的衣殼特異性結(jié)合，從而抑制病毒的復(fù)制。
[0008] 法國(guó)科學(xué)家在貽貝的防御素 Mytilin研究方面做了大量的工作，天然的貽貝防 御素有 MytiIin A (Seq ID No. 3)，Mytilin B (Seq ID No. 1)，Mytilin C (Seq ID No. 4)， Mytilin D(Seq ID No. 5)和 Mytilin G(Seq ID No. 6)等。由于防御素 Mytilin 分子小，分 離提純存在一定的困難，且天然資源有限，很難產(chǎn)業(yè)化；因?yàn)榉烙氐亩蜴I和多肽空間結(jié) 構(gòu)決定了其基本的特性，化學(xué)合成不可能得到具有良好活性的產(chǎn)品，多方研究表明，化學(xué)合 成的活性產(chǎn)品只有天然產(chǎn)物的百分之一或更低；只有基因工程途徑才能獲得具有良好活性 的防御素，由于高濃度Mytilin防御素多肽可殺滅絕大多數(shù)宿主細(xì)胞，同時(shí)在分泌表達(dá)過(guò) 程中，防御素容易被宿主菌的酶系統(tǒng)所降解，從而產(chǎn)生兩敗俱傷的情形而無(wú)法真正獲得足 量的表達(dá)產(chǎn)物。所以，目前還沒(méi)有Mytilin防御素多肽的工程菌表達(dá)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，也未 見(jiàn)到準(zhǔn)確表達(dá)和獲得足量的該多肽以供試驗(yàn)用的報(bào)道，更未見(jiàn)到其在乙肝治療、免疫藥物、 飼料添加劑等方面的應(yīng)用報(bào)道。 第三部分：
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的空白和需求，提供一種源自地中海貽貝防御素的的生物工 程制備方法及其在制備治療藥物、健康產(chǎn)品和飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0010] 一種肽，其特征在于具有Seq ID No. 1所示的氨基酸序列。
[0011] 編碼上述肽的基因。
[0012] 所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0013] 含有上述基因的表達(dá)載體。
[0014] 所述表達(dá)載體的骨架載體為pKLACl。
[0015] 上述肽的制備方法，其特征在于將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞中，發(fā)酵培養(yǎng)。
[0016] 所述酵母細(xì)胞為蛋白酶缺陷型K. Iactis YCT389, YCT390、YCT569與YCT598。
[0017] 上述肽在制備治療藥物、健康產(chǎn)品和飼料添加劑中的應(yīng)用、制備方法。
[0018] 所述藥物和產(chǎn)品為口服制劑。
[0019] 本發(fā)明根據(jù)源自地中海貽貝的防御素 Mytilin B，由34個(gè)氨基酸組成，分子量為 3981. 7Da，等電點(diǎn)9. 58,疏水比率41%，凈電荷+9。由于絕大多數(shù)多肽，包括Mytilin B在 酵母分泌表達(dá)異源蛋白時(shí)候會(huì)被降解，其主要原因是由于分泌途徑中天冬氨酰蛋白酶作用 引起的，在許多情況下，僅天冬氨酰蛋白酶就可導(dǎo)致大多數(shù)蛋白被破壞性地降解。K. Iactis YCT389、YCT390、YCT569與YCT598菌株均為特異性分泌途徑天冬氨酰蛋白酶基因無(wú)選擇標(biāo) 記刪除型，我們選擇了其作為Mytilin B的宿主菌，獲得了經(jīng)濟(jì)和穩(wěn)定的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化 制造。發(fā)酵過(guò)程我們?nèi)滩捎昧艘嘿|(zhì)聯(lián)用監(jiān)測(cè)分泌表達(dá)出的多肽的降解情況。
[0020] 本發(fā)明提供了 Mytilin B肽的制備方法，本發(fā)明將構(gòu)建得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到酵 母表達(dá)系統(tǒng)中，使其表達(dá)Mytilin B肽，通過(guò)后續(xù)的分離純化干燥步驟的得到Mytilin B肽 純品。本發(fā)明優(yōu)選采用的酵母感受態(tài)細(xì)胞K. Iactis YCT389,蛋白酶缺失型，特異性分泌途 徑天冬氨酰蛋白酶基因無(wú)選擇標(biāo)記刪除型，沒(méi)有遺傳標(biāo)記，適用于線性化PKLAC或pKLMF為 基礎(chǔ)的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化。使用該表達(dá)系統(tǒng)，可確保分泌表達(dá)的Mytilin B肽不會(huì)被降解，同 時(shí)具備活性，該表達(dá)系統(tǒng)也可以工業(yè)化表達(dá)Mytilin A(Seq ID No. 3)，Mytilin C(Seq ID No. 4)，Mytilin D(Seq ID No. 5)和 Mytilin G(Seq ID No. 6)，使其可用于藥物制造、健康 產(chǎn)品和飼料添加劑。
[0021] 試驗(yàn)證明，本發(fā)明采用基因工程方法制備的Mytilin B肽的產(chǎn)率為0. 2%以上（指 純化得到的表達(dá)產(chǎn)物與折干的培養(yǎng)基質(zhì)量相比的比例）。
[0022] 本發(fā)明根據(jù)上述Seq ID No. 1所示的氨基酸序列，設(shè)計(jì)了編碼該氨基酸序列的基 因序列，利用密碼子的兼并性，調(diào)整了核苷酸序列使其符合酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏好 性而得到Seq ID No. 2所示的核苷酸序列，有利于穩(wěn)定高效表達(dá)防御素。
[0023] 本發(fā)明還提供了含有上述基因的表達(dá)載體，所采用的骨架載體為pKLACl或 PKLAC2, pKLAC2的結(jié)構(gòu)見(jiàn)說(shuō)明書附圖1，通過(guò)pKLACl或pKLAC2,其中的重組蛋白可在細(xì)胞 內(nèi)表達(dá)，也可分泌表達(dá)。有利于獲得高產(chǎn)量和純度的防御素。
[0024] 本發(fā)明提供的Mytilin B肽可以作為治療藥物、保健產(chǎn)品和飼料添加劑的主要成 分，制備成各種劑型的藥物和產(chǎn)品。如乙肝藥物、抗病毒藥物、免疫增強(qiáng)產(chǎn)品、睡眠改善產(chǎn) 品、飼料添加劑、功能食品、獸藥、生長(zhǎng)促進(jìn)劑等。體外藥物試驗(yàn)表明，Mytilin B肽對(duì)乙型 肝炎病毒活性有明顯的抑制作用，見(jiàn)實(shí)施例2。動(dòng)物試驗(yàn)表明，其還有全面改善動(dòng)物健康狀 態(tài)的作用，見(jiàn)實(shí)施例3。本發(fā)明優(yōu)先制備成口服制劑。 第四部分：【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1.骨架載體pKLACl結(jié)構(gòu)圖
[0026] New England Biolabs，Inc 提供
[0027] 圖2.本發(fā)明制備的Mytilin B肽的質(zhì)粒測(cè)序報(bào)告
[0028] 將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒PMD19-T的克隆，測(cè)序結(jié)果顯示克隆完全正確。 第五部分：【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例I. Mytilin B肽的制備
[0030] 步驟1.外源DNA合成
[0031] 利用DNA化學(xué)合成儀制備外源基因，得到編碼Mytilin B肽的外源DNA片段，如 Sequence ID No. 2 所不。
[0032] 驗(yàn)證：將酶切鑒定正確的克隆送至北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序 報(bào)告見(jiàn)（圖2)。
[0033] 步驟2.表達(dá)載體的構(gòu)建
[0034] 表達(dá)載體為K. Iactis蛋白質(zhì)表達(dá)試劑盒所提供的pKLACl (購(gòu)于New England Biolabs，Inc)在 pKLACl(9097bp)上，Lac4 啟動(dòng)子（PUC4_PB1)的 5'和 3'端被編碼 β -內(nèi) 酰胺酶的基因（ApR)和pMBl的復(fù)制原點(diǎn)所隔開(kāi)。Κ. Iactis α -結(jié)合因子分泌引導(dǎo)序列 (a -MF)、多克隆位點(diǎn)（MCS)和Lac4轉(zhuǎn)錄終止子（TT)位于3' PUC4_PB1的下游；酵母的Padh2 調(diào)控乙酰胺酶標(biāo)記基因（amdS)的表達(dá)。
[0035] 用Sac II或Bst XI酶切載體pKLACl使其線性化，將外源DNA片段Sequence ID No. 2插入到酵母K. Iactis基因組自身的Lac4啟動(dòng)子位點(diǎn)，獲得重組載體。該重組載體中， 目的基因被克隆到pKLACl上的K. Iactis α結(jié)合因子（a Mating Factor，α-MF)的下游， 見(jiàn)圖1，在酵母K. Iactis的細(xì)胞核中，編碼a-MF結(jié)構(gòu)域和外源重組蛋白的DNA與酵母基因 組整合，編碼的a -MF最終將在高爾基體上被剪切以使目的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)。
[0036] Puc^pbi啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)：一旦融合蛋白質(zhì)開(kāi)始表達(dá)，位于a-MF上的信號(hào)肽就會(huì) 指導(dǎo)融合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)膜上，在此信號(hào)肽酶（SP)將信號(hào)肽切除。分泌小泡（環(huán) 形）將融合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，Kex蛋白酶在此將α-MF結(jié)構(gòu)域切除，釋放成熟的目的 蛋白質(zhì)。隨后，目的蛋白質(zhì)通過(guò)分泌小泡運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜（PM)，從質(zhì)膜分泌到胞外.
[0037] 步驟2.轉(zhuǎn)化
[0038] 使用 K. Iactis YCT389, YCT390、YCT569 與 YCT598 (購(gòu)于 New England Biolabs， Inc)感受態(tài)細(xì)胞。
[0039] 將步驟1構(gòu)建得到的重組載體置于感受態(tài)細(xì)胞溶液中，使重組質(zhì)粒吸附于感受態(tài) 細(xì)胞的表面，冰浴一段時(shí)間，細(xì)胞膜處于收縮狀態(tài)。然后迅速將感受態(tài)細(xì)胞置于42°C，使細(xì) 胞在熱環(huán)境中膜通道開(kāi)放，重組質(zhì)粒由膜外高濃度區(qū)向膜內(nèi)擴(kuò)散，經(jīng)過(guò)45秒時(shí)間后，再將 感受態(tài)細(xì)胞放回冰浴中，膜通道關(guān)閉，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌。
[0040] 酵母轉(zhuǎn)化子用乙酰胺進(jìn)行篩選，將細(xì)胞轉(zhuǎn)化混合物（含有大量被pKLACl轉(zhuǎn)化或 未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞）涂于含有5mM乙酰胺的酵母基本碳源（YCB)培養(yǎng)基上。YCB培養(yǎng)基含有 K. Iactis細(xì)胞生長(zhǎng)所需的所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和碳源，但缺少氮源。只有當(dāng)乙酰胺被乙酰胺酶 (由pKLACl上的amdS基因表達(dá)）降解為氨時(shí)，才能作為氮源而被利用。因此，只有轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞才能長(zhǎng)成菌落。
[0041] 驗(yàn)證：
[0042] 挑取菌落，用搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含38mM硫酸銨的YPGal培養(yǎng)基（1 %酵母提取物， 2%蛋白胨，2%半乳糖），28°C?30°C，培養(yǎng)時(shí)間70小時(shí)。離心3000rpm，取上清液，瓊脂糖 凝膠電泳分析。
[0043] 步驟3.轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)
[0044] 含38mM硫酸銨的YPGal培養(yǎng)基（2%酵母提取物，4%蛋白胨，6%半乳糖），標(biāo)準(zhǔn)發(fā) 酵罐深層通氣培養(yǎng)，120°C濕熱蒸汽滅菌30分鐘，冷卻到28°C，接種，28°C?30°C，發(fā)酵過(guò)程 中再流補(bǔ)半乳糖6%，培養(yǎng)時(shí)間70小時(shí)。
[0045] 步驟4Mytilin B肽的分離純化
[0046] 發(fā)酵液采用陶瓷膜分離掉菌體；然后用納濾濃縮到蛋白質(zhì)含量在5%左右；加熱 到80度，保持20分鐘，冷卻到20度，離心分離去雜，轉(zhuǎn)速lOOOOrpm，30min ;加10倍量PH5 鹽酸溶液稀釋，使蛋白質(zhì)含量〇. 5 %左右，過(guò)DEAE和G50凝膠柱；納濾濃縮蛋白質(zhì)含量在 5%左右，凍干，產(chǎn)物純度為95%，純化產(chǎn)物與折干的培養(yǎng)基質(zhì)量相比，Mytilin B肽的產(chǎn)率 為0. 2%左右
[0047] 產(chǎn)率={(發(fā)酵液表達(dá)產(chǎn)物總質(zhì)量IX納濾濃縮收率X去雜收率X凝膠分離收 率X濃縮收率X凍干收率）/折干的培養(yǎng)基總質(zhì)量} X 100%。
[0048] 步驟5.配制成備用液
[0049] 上步凍干的純化物，用0. IN鹽酸溶解，制成20mg / ml的Mytilin B肽，保存?zhèn)溆谩?br> [0050] 實(shí)施例2. Mytilin B肽抑制乙型肝炎病毒復(fù)制活性試驗(yàn)
[0051] 步驟1.藥物處理
[0052] 取H印G2. 2. 15細(xì)胞一瓶，用0. 25 %胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì) 胞濃度為5X IO4Cell / ml，Iml /孔加入24孔培養(yǎng)板中，置37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)過(guò)夜。第二天吸棄上清，加入含有不同藥物濃度（50, 25,12. 5,6. 25, 3. 13和0 μ M)的DMEM 培養(yǎng)基，每組4復(fù)孔。每次作用4d后換同樣藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，并于第4和8天，收集 各孔上清至I. 5ml離心管中，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0053] 步驟2.細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV表面抗原和E抗原的檢測(cè)
[0054] 采用ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg，具體操作按照試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行。顯色反 應(yīng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測(cè)各孔OD值。
[0055] 步驟3.數(shù)據(jù)處理
[0056] 數(shù)據(jù)表不為means 土 SD。
[0057] IC(Inhibition rate,抑制率）= (1_0D 藥物處理組 / OD 陰性對(duì)照組）X 100%
[0058] 步驟4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用
[0059] H印G2. 2. 15細(xì)胞在24孔板培養(yǎng)過(guò)夜后，加入不同稀釋濃度的藥物，同時(shí)設(shè)定細(xì)胞 對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。在培養(yǎng)4和8d后分別收集細(xì)胞上清，采用ELISA法檢測(cè)HBsAg和 HBeAg的表達(dá)。
[0060] 受試物My t i I in B肽和陽(yáng)性藥3TC使培養(yǎng)液中的HBsAg分泌水平不同程度的下降， 在3. 13?50μ g的濃度范圍內(nèi)具有明顯的劑量相關(guān)性的抑制作用。與同期空白對(duì)照組的 OD值比較，Mytilin B肽各濃度組在第4d和第8d細(xì)胞上清HBsAg含量明顯下降（p〈0. 05 或0. 01)(結(jié)果見(jiàn)表1)。Mytilin B肽對(duì)細(xì)胞上清HBsAg分泌的半數(shù)抑制濃度IC50大約為 3. 0 ?12 μ g / ml。
[0061] 表IMytilin B肽對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用（J 土切）
[0062]
【權(quán)利要求】
1. 一種貽貝肽，其特征在于具有Seq ID No. 1所示的氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的肽的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
4. 含有權(quán)利要求3所述的基因的表達(dá)載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其骨架載體為pKLACl或pKLAC2。 6?如 Seq ID No. 1、Seq IDNo. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6 所示的氨 基酸序列多肽采用本專利所述酵母菌K. lactis YCT389、YCT390、YCT569與YCT598制備，及 類似酵母菌K. lactis YCT284、YCT799、釀酒酵母、面包酵母、乳酸克魯維酵母和啤酒酵母制 備。 7?如 Seq ID No. 1、Seq ID No. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6 所示氨基 酸序列多肽的制備方法，其特征在于將骨架載體為pKLACl或pKLAC2的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到權(quán) 利要求6所述的酵母細(xì)胞中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。 8?如 Seq ID No. 1、Seq ID No. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6 所示的 氨基酸序列多肽在制備治療藥物、健康產(chǎn)品和飼料添加劑中的應(yīng)用，如乙肝藥物、抗病毒藥 物、免疫增強(qiáng)產(chǎn)品、睡眠改善產(chǎn)品、功能食品、飼料添加劑、獸藥、生長(zhǎng)促進(jìn)劑等。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述藥物和產(chǎn)品指口服藥物、注射藥物、固體和液體產(chǎn) 品。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK104418945SQ201310389379
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】鄧立, 丁杰, 劉勇, 鄧韻蕾, 陸洋, 陳尚衛(wèi) 申請(qǐng)人:鄧立