一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其方法包括樟芝發(fā)酵全液或發(fā)酵后澄清液或菌絲體經(jīng)過乙醇提取、過濾、減壓濃縮、除色素、除小分子化合物、除脂肪、醇析、離心分離、收集物干燥、收集物粉碎等步驟。本發(fā)明的方法提取的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物對禽流感病毒具有明顯的抑制作用，該方法具有工藝簡便、成本低、效果好的特點。
【專利說明】一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，尤其涉及撞芝(An trodia camphora ta ) AcOO I,已于2005年9月21日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC N0.1460，保藏地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)于抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，經(jīng)檢索到的相關(guān)專利有:中國專利申請?zhí)枮?9112556.8灰樹花發(fā)酵液多糖提取方法，02136517.2灰樹花發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，89105471 —種云芝糖肽(PSP)的生產(chǎn)方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工藝，96109095中國靈芝保健飲料，92111030靈芝營養(yǎng)保健液及其制法，93103116靈芝口服液等專利，這些專利內(nèi)容大多以提取多糖為主要目的，其中灰樹花、云芝和靈芝三種制備的活性物質(zhì)提取物具有抗腫瘤、抗高血壓、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等藥效，但對于抗病毒作用鮮有報道，而對于抗禽流感病毒的報道更是沒有檢索到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的問題是，針對上述抗禽流感病毒的樟芝全液發(fā)酵乙醇提取物的制備方法以及其制備的乙醇提取物的藥理作用所存在的不足，提供一種抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法。利用本發(fā)明的方法提取的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物對禽流感病毒具有抑制作用，并且對正常細(xì)胞具有保護作用，且該方法具有工藝簡便、成本低、具有抗禽流感的特點。
[0004]本發(fā)明的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，包括三種制備形式:其一為直接從樟芝菌發(fā)酵全·液包括菌絲體與澄清液中用乙醇分離出活性物質(zhì)；其二為先將樟芝菌發(fā)酵全液分離成菌絲體與澄清液，再從所得菌絲體中用乙醇分離出活性物質(zhì)；其三為先將樟芝菌發(fā)酵全液分離成菌絲體與澄清液，再從所得澄清液中用乙醇分離出活性物質(zhì)。由以下步驟組成:
所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征是，所述樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物由下述方法制得:
HJ加熱濃縮:取經(jīng)液體發(fā)酵的樟芝菌發(fā)酵全液或澄清液放于容器內(nèi)，在溫度50~70°C，壓力0.2~0.6Kg/cm2，真空度為0.02~0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，使減壓濃縮后的發(fā)酵全液或澄清液是原體積的1/4~1/2。
[0005][2]乙醇提取:經(jīng)濃縮后的樟芝菌發(fā)酵全液或澄清液的溫度降到30°C—下，往容器中加入80%-95%的乙醇，使?jié)饪s后的樟芝菌發(fā)酵全液或澄清液的醇溶液的醇度達(dá)到60~70%左右，然后繼續(xù)加熱，溫度控制在30~70°C，加熱時間是30~240分鐘。
[0006](3)過濾:之后冷卻、以180~200目的篩網(wǎng)過濾樟芝菌發(fā)酵全液或澄清液，收集濾液，濾渣以其4~8倍體積的80%-95%乙醇稀釋，重復(fù)上述操作I~2遍，離心收集濾液；W.1減壓濃縮:過濾后棄去濾渣，合并收集的濾液，在溫度50~70°C，壓力0.2~0.6Kg/cm2,真空度為0.02~0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，回收乙醇，使濾液濃縮至原有體積的 1/5 ~1/10 ；
四收集物干燥:將上述濃縮后的濾液，在50~60°C溫度條件下干燥120~480小時，揮發(fā)多余的乙醇；
(7)收集物粉碎:取上述烘干的收集物，置35°C條件下進(jìn)行粉碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過篩后，即為樟芝菌抗禽流感病毒活性的乙醇提取物。
[0007]其中，步驟[I ]所述的樟芝菌發(fā)酵全液是指樟芝iAntrodia camphorata)發(fā)酵液與菌絲體的集合體。步驟[I ]所述的樟芝澄清液是指樟芝iAntrodia)發(fā)酵后澄清液
所述樟芝菌通過以下步驟進(jìn)行發(fā)酵:
(1)液體種子培養(yǎng):采用500毫升三角瓶，每瓶裝200毫升液體培養(yǎng)基，將10%的樟芝菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，調(diào)節(jié)PH為3-8，培養(yǎng)溫度為20-35°C，搖瓶轉(zhuǎn)速為80-280r/min，培養(yǎng)7_15天，即可得到樟芝液體種子；
(2)發(fā)酵罐發(fā)酵: 先將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌壓力為0.1~0.2公斤/平方厘米，滅菌時間為1-2小時；當(dāng)樟芝液體種子pH值降至2.5-4時，將搖瓶中的樟芝種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，調(diào)整pH為5-8，培養(yǎng)溫度25-35°C，通氣量0.5-1.1vvm,攪拌轉(zhuǎn)速100-250r/min,培養(yǎng)7_30天，發(fā)酵停止時，培養(yǎng)液的顏色為桔黃色。
[0008]所述液體種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉1~3%蔗糖I~5%
蛋白胨0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5%
硫酸鎂0.1~0.3%磷酸二氫鉀 0.05~0.1%
采用本發(fā)明的抗禽流感病毒的樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，具有工藝簡便、、成本低、抗禽流感病毒的特點。該方法采用樟芝菌絲體的發(fā)酵液及其發(fā)酵全液進(jìn)行活性物質(zhì)提取，大大解決了樟芝子實體及菌絲體人工培養(yǎng)的難度、降低了原料成本和生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)率。
[0009]采用本發(fā)明的方法提取的樟芝菌乙醇提取物，經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用真菌研究所在中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心外來病研究中心所作的體外抗禽流感病毒藥物篩選試驗，樟芝菌乙醇提取物對禽流感病毒具有明顯的抑制作用，并對細(xì)胞具有保護作用。
[0010]體外抗禽流感病毒藥物篩選試驗的具體方法如下:
1、實驗材料
1、細(xì)胞:MDCK細(xì)胞
2、病毒:禽流感病毒毒株為H5N1型
3、培養(yǎng)液:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液
I1、實驗條件 生物安全三級實驗室
II1、實驗步驟1、CPE法測定病毒對MDCK細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TCID50)
按Reed-Muench法測定MDCK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞感染物感染劑量(TCID50)。
[0011]2、CPE法結(jié)合MTT法確定藥物對細(xì)胞的無毒濃度
用酶聯(lián)免疫檢測儀測定0D492值，計算出樣品的最大無毒濃度(TCO)和半數(shù)中毒濃度(TC50)。
[0012]3、提取物的最大無毒濃度對禽流感病毒的藥效測定
采用MTT法測定0D492值。當(dāng)加樣組的0D492值顯著大于病毒對照組0D492時，表明此樣液能夠顯著抑制病毒感染MDCK，具有很好的抗病毒的活性。
[0013]IV、實驗結(jié)果
1、病毒的 TCID5。為 10_4。
[0014]2、取樟芝菌乙醇提取物11個濃度即64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25,0.125、和0.0625mg / ml進(jìn)行細(xì)胞毒性測定，每濃度做10個復(fù)孔，同時設(shè)細(xì)胞對照。結(jié)果顯示最大無毒濃度為32mg / ml ο
[0015]3、取32、16、8、0.8mg / ml藥液，做10個復(fù)孔，觀察對禽流感病毒的抑制作用。試驗設(shè)病毒對照和細(xì)胞對照，結(jié)果顯示樟芝提取物4個不同濃度藥物對禽流感病毒具有很好的抑制作用。見下表。
【權(quán)利要求】
1.一種抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征是，所述樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物由下述方法制得: (1)加熱濃縮:取經(jīng)液體發(fā)酵的樟芝菌發(fā)酵全液及菌絲體或澄清液放于容器內(nèi)，在溫度50~70°C，壓力0.2~0.6Kg/cm2，真空度為0.02~0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，使減壓濃縮后的發(fā)酵全液或澄清液是原體積的1/4~1/2 ； (2)乙醇提取:經(jīng)濃縮后的樟芝菌發(fā)酵全液或澄清液的溫度降到30°C以下，往容器中加入80%-95%的乙醇，使?jié)饪s后的樟芝菌發(fā)酵全液或澄清液的醇溶液的醇度達(dá)到60~70%左右，然后繼續(xù)加熱，溫度控制在30~70°C，加熱時間是30~120分鐘； (3)過濾:之后冷卻、以180~200目的篩網(wǎng)過濾樟芝菌發(fā)酵全液或澄清液，收集濾液，濾渣以其4~8倍體積的80%-95%乙醇稀釋，重復(fù)上述操作I~2遍，離心收集濾液； (4)減壓濃縮:離心完畢后棄去濾渣，合并收集的濾液，在溫度50~70°C，壓力0.2~0.6Kg/cm2,真空度為0.02~0.06Mpa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，回收乙醇，使濾液濃縮至原有體積的1/5~1/10 ； (5)收集物干燥:將上述濃縮液，在50~60°C溫度條件下干燥120~480小時，揮發(fā)多余的乙醇和水分； (6)收集物粉碎:取上述烘干的收集物，置35°C條件下進(jìn)行粉碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過篩后，即為樟芝菌抗禽流感病毒活性的乙醇提取物； 其中，步驟(1)所述的 樟芝菌發(fā)酵全液是指樟芝發(fā)酵液與菌絲體的集合體， 步驟(1)所述的樟芝澄清液是指樟芝)發(fā)酵后澄清液。
2.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征在于所述樟芝發(fā)酵全液經(jīng)分離獲得樟芝發(fā)酵菌絲體和樟芝發(fā)酵澄清液。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征在于，所述樟芝發(fā)酵全液通過以下步驟獲得: (1)液體種子培養(yǎng):采用500毫升三角瓶，每瓶裝200毫升液體培養(yǎng)基，將10%的樟芝菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，調(diào)節(jié)pH為3-8，培養(yǎng)溫度為20-35°C，搖瓶轉(zhuǎn)速為80-280r/min，培養(yǎng)7_15天，即可得到樟芝液體種子； (2)發(fā)酵罐發(fā)酵:先將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌壓力為0.1~0.2公斤/平方厘米，滅菌時間為1-2小時；當(dāng)樟芝液體種子pH值降至2.5-4時，將搖瓶中的樟芝種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，調(diào)整pH為5-8，培養(yǎng)溫度25-35°C，通氣量0.5-1.1vvm,攪拌轉(zhuǎn)速100-250r/min，培養(yǎng)7_30天，即可獲得樟芝發(fā)酵全液。
4.如權(quán)利要求2所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征在于，所述液體種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉I~3%蔗糖I~5% 蛋白胨0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5% 硫酸鎂0.1~0.3%磷酸二氫鉀 0.05~0.1%。
5.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征是，所述樟芝菌株名為樟芝iAntrodia camphorata) AcOOl。
6.如權(quán)利要求1所述的抗禽流 感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述濾液為乙醇水溶液，濃度為60-95%。
7.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征在于步驟(6)中所述收集物干燥使用真空干燥，真空度0.02-0.06Mpa，溫度50~60°C，干燥120~480小時。
8.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物的制備方法，其特征在于步驟(7)中所述收集物粉碎時，置35°C條件下進(jìn)行粉碎，采用200目的中藥粉碎機對收集物進(jìn)行粉碎過篩。
9.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物在制備抗禽流感病毒藥物中的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的抗禽流感病毒的樟芝菌發(fā)酵全液乙醇提取物在制備抗禽流感病毒藥物中的用途，其特征在于所述樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物在藥物中的含量為10%-20%。`
【文檔編號】A61P31/16GK103860605SQ201310403703
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】宋愛榮, 趙晨, 孔超, 秦丹, 梁大勇 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)