制備范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制備范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法,所述方法包括:利用附著體載體將重編程因子OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的編碼核酸以及針對人p53基因的shRNA轉(zhuǎn)入具有突變的范可尼貧血癥相關(guān)基因的范可尼貧血癥患者體細(xì)胞中;之后,在丁酸鈉(NaBT)的存在下培養(yǎng)所述體細(xì)胞。本發(fā)明還涉及制備用于移植治療范可尼貧血癥的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞的方法。另外,本發(fā)明還提供用于治療范可尼貧血癥的小分子化合物。
【專利說明】制備范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法及其應(yīng) 用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及制備范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法,本發(fā)明還涉及制 備用于移植治療范可尼貧血癥的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞的方法,另外,本 發(fā)明還提供用于治療范可尼貧血癥的小分子化合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 范可尼貧血癥(Fanconi Anemia, FA)屬于先天再生障礙性貧血,是一種嚴(yán)重的常 染色體隱性遺傳疾病,其致病突變基因攜帶率約為1/180?1/300,發(fā)病率約為10?50/10 萬,其臨床特征性表現(xiàn)為進行性骨髓衰竭,多發(fā)性先天畸形以及惡性腫瘤易患性等重大致 死性癥狀。FA在世界各人群中均有發(fā)現(xiàn),在某些種族人群中發(fā)病率異常增高,例如德系猶 太人和荷裔南非人中的FA基因攜帶率為1/90,而西班牙吉普賽人中的FA基因攜帶率高達(dá) 1/64?1/70。近年來隨著對FA臨床表現(xiàn)和發(fā)病機理的深入了解,我國FA患者的檢出率逐 年增高,尤其是3-14歲兒童病例屢見報道,由于FA致殘致死率極高,同時尚無便捷有效的 治療手段,給患兒及其家庭帶來巨大的痛苦和經(jīng)濟負(fù)擔(dān),因此急需針對FA建立有效的診斷 和治療技術(shù),以及高效的藥物篩選平臺。
[0003] 目前已發(fā)現(xiàn)15個FA相關(guān)致病突變基因(分別為FANCA、B、C、D1、D2、E、F、G、I、 J、L、M、N、0和P),并且所有FA相關(guān)基因都參與一個重要的DNA修復(fù)途徑(FA/BRCA途徑)。 已有研究表明,通過在FA/BRCA通路缺陷的細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)相應(yīng)的正常FA基因,可以糾正基 因缺陷,恢復(fù)細(xì)胞正常的生理功能,提示了未來可以通過基因治療來治愈FA。然而,目前造 血干細(xì)胞移植是臨床治療FA的唯一手段,但同時造血干細(xì)胞的來源以及免疫排斥反應(yīng)限 制了該治療手段的臨床應(yīng)用。近年來,誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為疾病的藥物篩選、基因治療和細(xì)胞治療提供了廣闊前景。iPSC 是通過將特定轉(zhuǎn)錄因子(如0CT4, S0X2, KLF4, cMYC等)導(dǎo)入體細(xì)胞,使其轉(zhuǎn)變成為的具備 胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞,進一步定向分化為疾病累及細(xì)胞類型,為該類疾病藥物篩選提供 具有顯著優(yōu)勢的基于人類細(xì)胞的藥物篩選平臺。事實上,許多公司已經(jīng)開始致力于建立 iPSC疾病模型用于藥物發(fā)現(xiàn)研究。羅氏(Roche)與歐洲創(chuàng)新藥物計劃(IMI) 2012年聯(lián)合 宣布推出StemBANCC,旨在以人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞為研究工具,開發(fā)人類疾病模型,促進藥物 開發(fā),該計劃研究包括糖尿病和老年癡呆癥在內(nèi)的一系列疾病。此外,Cellular Dynamics 和AstraZeneca公司也宣布將合作開發(fā)人類iPSC體外疾病模型,特別的是利用MyCell技 術(shù)將特定病人的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為體外疾病模型進行藥物篩選。這種突破性的新技術(shù)將為人類疾 病機理研究和藥物篩選實現(xiàn)新的跨越。另外,iPSC并非源于胚胎組織,不會受到倫理問題 的限制,結(jié)合現(xiàn)有的基因打靶技術(shù)對患者自體來源的iPSC進行基因突變的基因組原位矯 正,在基因水平清除內(nèi)源性致病因素,為血液病的移植細(xì)胞治療提供良好的移植材料,在個 性化治療和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中巨大的應(yīng)用前景。
[0004] 針對FA,目前可用雄激素,糖皮質(zhì)激素和造血生長因子進行治療,但是只能改善癥 狀,療效難以持續(xù),更無法根除。其原因在于目前范可尼病的疾病模型和藥物篩選平臺不 能滿足進行藥物篩選的需求。利用iPSC這一前沿技術(shù),對范可尼病人體細(xì)胞進行重編程, 并定向分化為范可尼疾病累積的細(xì)胞類型,可建立新型范可尼藥物篩選平臺。另外,通過 IPSC技術(shù)平臺,利用基因打靶技術(shù)對患者自體iPSC中的致病基因突變進行基因矯正,再 將其定向分化為無致病突變的正常造血干細(xì)胞,繼而用于治療血液系統(tǒng)疾病。因此,建立 高效的范可尼患者體細(xì)胞重編程體系至關(guān)重要。然而與其他遺傳性貧血癥相比,范可尼貧 血癥患者的體細(xì)胞重編程研究具有更大的困難和挑戰(zhàn)性。已有研究表明,F(xiàn)A涉及的FANC/ BRCA信號通路在發(fā)育和DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,患者體細(xì)胞本身存在DNA損 傷和不穩(wěn)定性,而重編程過程中又會進一步引發(fā)活性氧(ROS)增加、DNA斷裂和細(xì)胞死亡 (Senescence)等細(xì)胞事件嚴(yán)重阻礙體細(xì)胞重編程的過程,因此針對FA患者攜帶致病突變 細(xì)胞的體細(xì)胞重編程研究困難重重,國內(nèi)外鮮見成功實施的案例。
[0005] 盡管近年來已有若干研究組利用不同策略獲得FA患者來源的iPSC,但是仍然存 在各種問題和不足。例如2009年本專利發(fā)明人在首先過表達(dá)野生型FANCA基因?qū)颊唧w 細(xì)胞系進行基因補償之后,才利用慢病毒介導(dǎo)的體細(xì)胞重編程方法順利對4例FANCA患者 體細(xì)胞(上皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞)完成重編程過程并獲得患者自體iPSC。然而慢病毒載體 介導(dǎo)的重編程方法會導(dǎo)致外源基因發(fā)生不可控的基因組整合,不但會進一步加劇攜帶FA 致病基因突變細(xì)胞的DNA不穩(wěn)定性,而且也無法實現(xiàn)安全的臨床應(yīng)用。此外,經(jīng)過基因補償 的細(xì)胞也無法作為疾病模型用于藥物篩選。(A. Raya, I. Rodriguez-Piza, G. Guenechea, R. Vassena, S. Navarro, M. J. Barrero, A. Consiglio, M. Castella, P. Rio, E. Sleep, F. Gonzalez, G. Tiscornia, E. Garreta, T. Aasen, A. Veiga, I. M. Verma, J. Surralles, J. Bueren,J. C. Izpisua Belmonte, Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells, Nature. 2009,460:53-59)〇 2012 年 美國哈佛醫(yī)學(xué)院的Daley研究組改進了體細(xì)胞重編程技術(shù),利用低氧條件(Hypoxia)誘 導(dǎo),同時結(jié)合慢病毒介導(dǎo)重編程因子表達(dá),產(chǎn)生了 FA-A和FA-C患者自體iPSC。然而,該研 究同樣利用慢病毒載體產(chǎn)生外源基因整合型iPSC,因而無法實現(xiàn)安全的臨床應(yīng)用。同時 盡管獲得了攜帶FA致病突變的iPSC,但是該研究并未利用其開展可能的FA藥物篩選工 作。(L. U. Muller, M. D. Milsom, C. E. Harris, R. Vyas, K. M. Brumme, K. Parmar, L. A. Moreau, A. Schambach, I. H. Park, ff. B. London, K. Strait, T. Schlaeger, A. L. Devine, E. Grassman, A. D ' Andrea, G. Q. Daley, D. A. Williams, Overcoming Reprogramming Resistance of Fanconi Anemia Cells. Blood. 2012, 119:5449-5457.)由此可見,現(xiàn)有報道產(chǎn)生的 FA 患者 來源的iPSC存在重編程效率低下和宿主基因組隨機整合等嚴(yán)重不足,無法滿足臨床應(yīng)用 的要求。同時,現(xiàn)有報道均未利用產(chǎn)生的FA-iPSC有效模擬疾病表型,建立藥物篩選平臺, 因而未能開展高效的藥物篩選工作。此外目前各研究機構(gòu)和制藥公司主要利用疾病的動物 模型進行針對FA等重大疾病的藥物篩選,但是動物模型存在與人的種屬差異、無法完全重 現(xiàn)疾病表現(xiàn)以及無法進行高通量藥物篩選等無法克服的缺陷,因而無法實現(xiàn)真正意義的高 效高通量藥物篩選。綜上所述,目前急需一種體外產(chǎn)生FA患者自體來源的iPSC的安全高 效技術(shù),以及利用該FA-iPSC及其衍生細(xì)胞產(chǎn)生安全的可移植材料和高效高通量的藥物篩 選平臺。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明涉及一種體外產(chǎn)生范可尼貧血癥患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(FA-iPSC)以及造 血干細(xì)胞等衍生細(xì)胞的方法,并且在此基礎(chǔ)上建立的高效高通量藥物篩選平臺以及利用該 平臺篩選出的一種針對FA疾病表型具有治療效果的天然化合物。所述方法包括在化學(xué)小 分子丁酸鈉(NaBT)誘導(dǎo)下,利用非基因組整合的附著體載體(Episomal vector)將0CT4, S0X2, KLF4, cMYC,LIN28等因子以及shRNA-p53導(dǎo)入FA患者體細(xì)胞,將其重編程為無外源 基因整合的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,再通過定向分化獲得多種患者自體來源的細(xì)胞系來模擬FA 疾病表型,繼而建立針對FA的高通量藥物篩選平臺,以及利用其進行篩選出的具有治療效 果的天然小分子備選藥物。
[0007] 首先,本發(fā)明提出結(jié)合非基因組整合型附著體載體(Episomal vector)介導(dǎo)的 體細(xì)胞重編程技術(shù)和非整合型腺病毒載體介導(dǎo)的基因矯正技術(shù),產(chǎn)生FA患者自體來源 的無致病基因突變的非基因組整合型iPSC,并進一步將其定向分化為造血干細(xì)胞。在重 編程過程中,本發(fā)明在化學(xué)小分子NaBT誘導(dǎo)下,采用一種新型的非基因組整合附著體載 體(Episomal vector)技術(shù)(附著體載體可以在細(xì)胞內(nèi)長時間復(fù)制,但是并不整合到基 因組中,在重編程過程中,隨著細(xì)胞分裂,附著體逐漸被稀釋掉,因此該方法避免了由于病 毒載體整合入宿主細(xì)胞基因組而引起的潛在致癌性等應(yīng)用風(fēng)險),將p53 shRNA和經(jīng)典的 四種重編程因子共同導(dǎo)入體細(xì)胞,同時給予NaBT處理,使在正常氧壓條件下獲得FA-iPSC 成為可能。由于附著體載體可以在宿主細(xì)胞內(nèi)長期復(fù)制,但并不整合到宿主基因組中, 并且隨著宿主細(xì)胞分裂,附著體會被逐步稀釋,因此該方法避免了由于病毒載體產(chǎn)生的 外源基因整合所引起的潛在致癌性。此后,本發(fā)明采用新型第三代非整合型腺病毒載體 (Helper-cbpendent Adenovirus,HDAdV)作為基因打靶工具對FA-iPSC進行基因矯正。該 載體攜帶正常功能的野生型FANCA基因(Genbank登錄號:NM_000135)組片段,通過與患者 基因組進行同源重組,實現(xiàn)針對突變位點的原位基因矯正。HDAdV載體不具有病毒復(fù)制和基 因組整合元件,無法整合到宿主基因組中,從而提高基因矯正的安全性,是目前最安全有效 的基因矯正技術(shù),同時超大片段同源重組方法保證了基因矯正的精確性,與其他基因打靶 技術(shù)(如鋅指核酶等)相比,無脫IE (Off-Target)和誘變效應(yīng)。結(jié)合上述兩種技術(shù),本發(fā) 明對FA-A患者成纖維細(xì)胞依次進行重編程和基因矯正,繼而再定向分化為造血干細(xì)胞,從 而為臨床FA患者移植治療提供了患者自體來源的、比現(xiàn)有方法更安全的造血干細(xì)胞。
[0008] 其次,本發(fā)明產(chǎn)生的范可尼貧血癥患者自體來源的非整合型iPSC,可以體外定向 分化為攜帶致病基因突變的血液細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞等衍生細(xì)胞,能夠有效模 擬各種疾病相關(guān)表型,因此本發(fā)明利用上述FA相關(guān)iPSC及其衍生細(xì)胞建立高效高通量的 個性化藥物篩選平臺,并在此基礎(chǔ)上已篩選出一種天然化合物,可有效改善FA疾病表型。
[0009] 綜上所述,本發(fā)明所含技術(shù)既能夠為臨床治療FA提供大量安全的移植材料,還能 夠用于建立篩選FA治療藥物的個性化藥物篩選平臺,同時也為其他人類重大疾病和罕見 病的治療、診斷和藥物篩選等提供了參考模式。
[0010] 更具體地,本發(fā)明提供以下各項:
[0011] 1. 一種制備范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法,所述方法包括:利用 附著體載體將重編程因子0CT4、S0X2、KLF4、cMYC和LIN28的編碼核酸以及針對人p53基 因的shRNA轉(zhuǎn)入具有突變的范可尼貧血癥相關(guān)基因的范可尼貧血癥患者體細(xì)胞中;之后, 在丁酸鈉(NaBT)的存在下培養(yǎng)所述體細(xì)胞。
[0012] 2.根據(jù)1所述的方法,其中所述范可尼貧血癥患者體細(xì)胞是范可尼貧血癥患者成 纖維細(xì)胞。
[0013] 3.根據(jù)1所述的方法,其中所述重編程因子0CT4、S0X2、KLF4、cMYC和LIN28的編 碼核酸以及所述針對人P53基因的shRNA的核酸序列如SEQ. ID. NO: 1-6所示。
[0014] 4.根據(jù)1所述的方法,其中丁酸鈉的工作濃度為50-200 μ M。
[0015] 5.根據(jù)1所述的方法,其中所述附著體載體是Episomal質(zhì)粒載體。
[0016] 6.根據(jù)1所述的方法,其中所述突變的范可尼貧血癥相關(guān)基因是FANCA基因。
[0017] 7.利用根據(jù)1-6中任一項所述的方法制備的范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干 細(xì)胞。
[0018] 8. -種制備用于藥物篩選或移植治療范可尼貧血癥的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞 或神經(jīng)干細(xì)胞的方法,所述方法包括:
[0019] 對根據(jù)7所述的范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的突變的范可尼貧血 癥相關(guān)基因進行基因矯正,優(yōu)選采用非整合型腺病毒載體作為基因打靶載體;
[0020] 將所述經(jīng)基因矯正的范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為造血干 細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞。
[0021] 9. Doramapimod在制備用于治療范可尼貧血癥的藥物中的用途。
[0022] 10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途,其中所述范可尼貧血癥是由范可尼貧血癥相關(guān) 基因 FANCA基因的突變引起的。
[0023] 11. 一種用于治療范可尼貧血癥的組合物,所述組合物包含Doramapimod作為活 性成分。
[0024] 12. Doramapimod用于治療范可尼貧血癥的用途。
[0025] 13. Tremulacin在制備用于治療范可尼貧血癥的藥物中的用途。
[0026] 14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途,其中所述范可尼貧血癥是由范可尼貧血癥相關(guān) 基因 FANCA基因的突變引起的。
[0027] 15. -種用于治療范可尼貧血癥的組合物,所述組合物包含Tremulacin作為活性 成分。
[0028] 16. Tremulacin用于治療范可尼貧血癥的用途。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029] 圖1顯示本發(fā)明的總體技術(shù)方案。
[0030] 圖2顯示非基因組整合的FA-iPSC的產(chǎn)生。
[0031] 圖3顯示針對FA-iPSC的原位靶向基因矯正。
[0032] 圖4顯示FA-iPSC造血前體細(xì)胞的定向分化以及疾病表型模擬。
[0033] 圖5顯示FA-iPSC間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞的定向分化以及疾病表型模擬。
[0034] 圖6顯示FA-iPSC神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化以及疾病表型模擬。
[0035] 圖7顯示利用針對FA的個性化藥物篩選平臺進行高效高通量藥物篩選。
【具體實施方式】
[0036] 材料:
[0037] 1)用于流式細(xì)胞術(shù)的熒光標(biāo)記抗體:
[0038] 熒光素 APC標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD45抗體(555485),BD Biosciences
[0039] 熒光素 APC標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD43抗體(560198),BD Biosciences
[0040] 熒光素 FITC標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD43抗體(555475),BD Biosciences
[0041] 熒光素 PE標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD34抗體(555822),BD Biosciences
[0042] 熒光素 FITC標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD31抗體(555445),BD Biosciences
[0043] 熒光素 FITC標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD90抗體(555595),BD Biosciences
[0044] 熒光素 PE標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD73抗體(550257),BD Biosciences
[0045] 突光素 APC標(biāo)記同型對照抗體(555751),BD Biosciences
[0046] 突光素 PE標(biāo)記同型對照抗體(555749),BD Biosciences
[0047] 熒光素 FITC 同型對照抗體(555742),BD Biosciences
[0048] 熒光素 APC標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD34抗體(130-090-954),Miltenyi Biotec
[0049] 熒光素 APC標(biāo)記抗人細(xì)胞表面識別分子CD105抗體(17-1057-42),eBioscience
[0050] 熒光素 APC 標(biāo)記抗人 Tra-1-85 抗體(FAB3195A),R&D Systems
[0051] 2)用于免疫熒光的抗體:
[0052] 抗人 0CT-3/4 抗體(sc-5279),Santa Cruz Biotechnology
[0053] 抗人 S0X2 抗體(sc-17320),Santa Cruz Biotechnology
[0054] 抗人 Lamin BI 抗體(sc-6217),Santa Cruz Biotechnology
[0055] 抗人 FANCD2 抗體(sc-20022),Santa Cruz Biotechnology
[0056] 抗人 WRN 抗體(sc-5629),Santa Cruz Biotechnology
[0057] 抗人 GAPDH 抗體(sc-25778),Santa Cruz Biotechnology
[0058] 抗人 NANOG 抗體(ab2l624),Abeam
[0059] 抗人 Emerin 抗體(ab 14208),Abeam
[0060] 抗人 Ki67 抗體(abl6667),Abeam
[0061] 抗人 FANCD2 抗體(ab2187),Abeam
[0062] 抗人 NESTIN 抗體(MB5326),Millipore
[0063] 抗人 Tra-1-60 抗體(MAB4360),Millipore
[0064] 抗人 β-Tubulin III/Tujl 抗體(T2200),Sigma
[0065] 抗人 PAX6 抗體(PRB-278P),Covance
[0066] 抗人 Ku80 抗體(2753),Cell Signaling Technology
[0067] 抗人 FANCA 抗體(A301-980A),Bethyl Laboratories
[0068] 本發(fā)明涉及的質(zhì)粒:
[0069] pCXLE-h0CT3/4、pCXLE-h0CT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL 和 pCXLE-EGFP 均購自 Addgene (貨號分別為:27076、27077、27078、27080 和 27082)。
[0070] 本發(fā)明涉及培養(yǎng)基配方:
[0071] CDF12 培養(yǎng)基:
[0072] DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen,11320-033)
[0073] 0· ImM 非必需氨基酸(Invitrogen,11140-050)
[0074] ImM GlutaMAXTM 二肽(Invitrogen,35050-061)
[0075] 2〇%Knockout 血清替代物(Invitrogen,Nl〇828_〇28)
[0076] 1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen,15070-063)
[0077] 55 μ M β -疏基乙醇(Invitrogen,21985-023)
[0078] 10ng/ml Human FGF2(Joint Protein Central)
[0079] 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基配方如下:
[0080] DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen,11965118),
[0081] 15% 胎牛血清(Invitrogen,10091148),
[0082] 0· ImM 非必需氨基酸(Invitrogen,11140-050),
[0083] ImM GlutaMAX? 二肽(Invitrogen,35050-061)
[0084] 1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen,I5O7O-O63)。
[0085] 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基成分:
[0086] a MEM 培養(yǎng)基(Invitrogen,12571071),
[0087] 10% 胎牛血清(Invitrogen,IOO9Il48),
[0088] 1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen,15070-063),
[0089] 10ng/ml重組人成纖維細(xì)胞生長因子(JPC,bFGF),
[0090] 5ng/ml TGF β (Humanzyme, HZl 131) 〇
[0091] MSC細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基:
[0092] a MEM 培養(yǎng)基(Invitrogen,12571071),
[0093] 10% 胎牛血清(Invitrogen,IOO9Il48),
[0094] 1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen,15070-063),
[0095] 10M β-glycerolphosphate(Santa Cruz Biotech. , CAS 13408-09-8),0. 2mM ascorbate-2-phosphate(Sigma, A4034),
[0096] 0. OlmM dexamethasone(Sigma, D4902)〇
[0097] MSC細(xì)胞軟骨分化培養(yǎng)基:
[0098] DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen,11965118),
[0099] 1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen,15070-063),
[0100] 10ng/ml TGF-β 3(R&D Systems, AB-100-NA)
[0101] 50mg/ml ITS+Premix(BD,354351)
[0102] 50g/ml proline(Sigma, P5607)
[0103] 50g/ml ascorbate-2-phosphate(Sigma, A4034)
[0104] 0· IM dexamethasone(Sigma, D4902)。
[0105] MSC脂肪分化培養(yǎng)基:
[0106] a -MEM 培養(yǎng)基(Invitrogen,12571071),
[0107] 10% 胎牛血清(Invitrogen,10091148),
[0108] 1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen,15070-063),
[0109] 50 μ M indomethacin(Sigma, 17378)
[0110] 0. 5mM IBMX (Sigma, 17018)
[0111] 1 μ M dexamethasone(Sigma, D4902)
[0112] 造血分化培養(yǎng)基:
[0113] 90% a-MEM 培養(yǎng)基(Invitrogen,12571071)
[0114] 10% 胎牛血清(Invitrogen,IOO9Il48)
[0115] 神經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基-1 :
[0116] 50%Advanced DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen,12634)
[0117] 5〇%Neurobasal 培養(yǎng)基添加劑(Invitrogen,211〇3〇49)
[0118] 1%N_2 添加劑(Invitrogen,175〇2_〇48)
[0119] 2%B-27 添加劑(Invitrogen,0080085-SA)
[0120] 2mM GlutaMAX? 二肽(Invitrogen,35O5O-O6I)
[0121] 10ng/mL 重組人白血病抑制因子(hLIF,Millipore,LIF1050)
[0122] 4μ M CHIR99021 (Cellagen tech,C2447)
[0123] 3μΜ SB431542(Cellagentech, C7243)
[0124] 2 μ M Dorsomorphin(Sigma, Ρ5499)
[0125] 0. 1 μ M Compound E(EMD Chemicals Inc. ,565790)
[0126] 神經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基-2:
[0127] 50%Advanced DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen,12634)
[0128] 5〇%Neurobasal 培養(yǎng)基添加劑(Invitrogen,211〇3〇49)
[0129] 1%N_2 添加劑(Invitrogen,I75O2-O48)
[0130] 2%B-27 添加劑(Invitrogen,0080085-SA)
[0131] 2mM GlutaMAX? 二肽(Invitrogen,35050-061)
[0132] lOng/mL 重組人白血病抑制因子(hLIF,Millipore,LIF1050)
[0133] 4μΜ CHIR99021 (Cellagen tech, C2447)
[0134] 3μΜ SB431542(Cellagentech, C7243)
[0135] 0. I μ M Compound E(EMD Chemicals Inc. ,565790)
[0136] NSMM 培養(yǎng)基:
[0137] 50%Advanced DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen,12634)
[0138] 5〇%Neurobasal 培養(yǎng)基添加劑(Invitrogen,2ll〇3〇49)
[0139] 1%N_2 添加劑(Invitrogen,I75O2-O48)
[0140] 2%B-27 添加劑(Invitrogen,0080085-SA)
[0141] 2mM GlutaMAX? 二肽(Invitrogen,35050-061)
[0142] lOng/mL 重組人白血病抑制因子(hLIF,Millipore,LIF1050)
[0143] 4μΜ CHIR99021 (Cellagen tech, C2447)
[0144] 3 μ M SB431542(Cellagentech,C7243)
[0145] 2 μ M Dorsomorphin(Sigma, P5499)
[0146] 神經(jīng)元自發(fā)分化培養(yǎng)基SDW :
[0147] DMEM/F12(Invitrogen,11320-033)
[0148] 1%N_2 添加劑(Invitrogen,I75O2-O48)
[0149] 2%B-27 添加劑(Invitrogen,0080085-SA)
[0150] 400μΜ N6,2,-0-二丁酰基腺苷 3' ,5'-環(huán)磷酸鈉鹽(dbcAMP,Sigma,D0260)
[0151] 200 μ M L-抗壞血酸(Ascorbic acid,Sigma,A5960)
[0152] 10ng/ml 重組人神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF (P印rotech,450-20)
[0153] 10ng/ml重組人神經(jīng)營養(yǎng)因子⑶NF(P印rotech,450_10)
[0154] 本發(fā)明涉及的細(xì)胞系:
[0155] 人范可尼成纖維細(xì)胞(FA123)(來自攜帶FANCA C295T純合子突變的19歲男性 患者,具體見 Call6n E,et al.,A common founder mutation in FANCA underlies the world' s highest prevalence of Fanconi anemia in Gypsy families from Spain. Blood. 2005. 105 (5) : 1946-1949,并由第一發(fā)明人所在實驗室妥善保藏。
[0156] 人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系,購自WiCell公司。
[0157] 實施例I :FA患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立及鑒定
[0158] 本發(fā)明涉及的FA患者成纖維細(xì)胞FA123可利用人類成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基在37攝氏 度和5%二氧化碳條件下進行培養(yǎng)。
[0159] 本發(fā)明針對基因組不穩(wěn)定的FA患者體細(xì)胞優(yōu)化了實現(xiàn)重編程條件。通過哺乳動 物細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀將表達(dá)重編程因子的Episomal質(zhì)粒載體pCXLE-h0CT3/4-shp53-F(含重編程 因子0CT3/4 (其也被稱為0CT4),shp53 (針對人p53基因的shRNA)可以消除重編程過程中 細(xì)胞死亡的障礙),pCXLE-hSK(含重編程因子S0X2,KLF4 ),pCXLE-hUL(含重編程因子cMyc和 Lin28)和pCXLE-EGFP (含報告基因 EGFP)各1. 5 μ g共同電轉(zhuǎn)導(dǎo)入FA患者體細(xì)胞。電轉(zhuǎn)后 將細(xì)胞在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。將細(xì)胞用胰蛋白酶(美國Invitrogen公司,貨號 : 25200056)消化,隨后接種至預(yù)先培養(yǎng)了經(jīng)過絲裂霉素(購自美國Sigma公司,貨號:M0503) 滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs,購自美國Invitrogen公司,貨號:S1520-100)的培養(yǎng) 板中,次日換用添加了丁酸鈉(NaBT,為組蛋白去乙?;种苿?,工作濃度為50-200μΜ)的 CDF12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4天后,將培養(yǎng)基更換為無 NaBT的CDF12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至克隆樣 細(xì)胞出現(xiàn)。40天后成功實現(xiàn)范可尼貧血癥患者成纖維細(xì)胞FA123細(xì)胞的重編程,獲得FA患 者自體來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(FA-iPSC)(圖2A-C)。如圖2所示,本發(fā)明對產(chǎn)生的克隆 樣細(xì)胞進行干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog染色鑒定,證明FA成纖維細(xì)胞可以有效地被重編程成為表 達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog陽性的細(xì)胞,即誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。將范可尼誘導(dǎo)多能干細(xì)胞FA-iPSC 進行連續(xù)傳代后,仍可保持良好的克隆樣形態(tài)(圖2A)。本發(fā)明確定只有通過導(dǎo)入p53基因 的shRNA使p53基因沉默后,F(xiàn)A體細(xì)胞才可實現(xiàn)高效重編程,產(chǎn)生FA-iPSC(圖2B),同時重 編程生成的FA-iPSC仍然攜帶體細(xì)胞突變C253T (圖2C)。
[0160] 利用免疫熒光技術(shù)可以確認(rèn)FA-iPSC能夠表達(dá)干細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物0CT4和 NANOG (圖2D),同時FA-iPSC已能夠表現(xiàn)出FA信號通路缺陷的疾病特征,例如G2/M周期停 滯(圖3C)以及對DNA交聯(lián)劑敏感和染色體的不穩(wěn)定性等(圖3D)。
[0161] 實施例2 :FA-iPSC的基因矯正
[0162] 產(chǎn)生非基因組整合型FA-iPSC后,本發(fā)明繼續(xù)利用非整合型腺病毒載體介導(dǎo)的基 因矯正技術(shù),原位修復(fù)了 FA-iPSC基因組中的致病基因突變位點。本發(fā)明涉及的FA患者, 其致病基因突變?yōu)槲挥贔ANCA4號外顯子的點突變(圖2C)。本發(fā)明首先設(shè)計并通過分子克 隆方法獲得跨FANCA基因1-8號外顯子的正常野生型基因片段,然后將其構(gòu)建成為非整合 型腺病毒載體并感染FA-iPSC,利用同源重組原理將正常FANCA基因?qū)隖A-iPSC中并替換 突變基因,從而完成原位修復(fù)。后續(xù)經(jīng)過抗性篩選,最終獲得經(jīng)過基因矯正的FA-iPSC,即 cFA-iPSC。具體方法如下:
[0163] 1、基因矯正輔助腺病毒載體構(gòu)建:
[0164] 將 BAC 文庫中的人 FANCA locus 克隆(CTD-2327D14, Invitrogen)通過同源重組 構(gòu)建入輔助腺病毒載體pCIHDAdGT8_4(關(guān)于該腺病毒載體,詳見An HSV amplicon-based helper system for helper-dependent adenoviral vectors. Shuji Kubo,et al. BBRC. 2003. 307 (4) : 826-830),產(chǎn)生的 FANCA-c-HDAdV 質(zhì)粒用 PI-SceI (NEB)酶切并純化 后,轉(zhuǎn)染116細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞(293細(xì)胞)的衍生細(xì)胞系,既能貼壁生長也能懸浮生長, 詳見 Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Palmer D. and Ng P. Molecular Therapy. 2003. 8 (5) :846-52.),同時用輔助病毒 AdHPBGF35(詳 見 Genome Size and Structure Determine Efficiency of Postinternalization Steps and Gene Transfer of Capsid-Modified Adenovirus Vectors in a Cell-Type-Specific Manner. Dmitry M. Shayakhmetov, et al. , Journal of Virology. 2004. 78(18):10009-1002 2.)感染細(xì)胞以便包裝非基因組整合的輔助腺病毒載體FANCA-c-HDAdV。收集培養(yǎng)上清,并 通過超高速離心純化病毒顆粒。
[0165] 2、FA-iPSC的原位基因矯正:
[0166] 利用FANCA-c-HDAdV病毒載體感染FA-iPSC (I X IO7個細(xì)胞)。感染后第2-4天, 加入G418(25_450yg/ml,Invitrogen)進行陽性篩選。感染后第10-13天,加入4μΜ Ganciclovir (GANC,Invitrogen)進行陰性篩選。將所得細(xì)胞克隆挑入96孔板備用,并進 行基因組鑒定。
[0167] 基因組鑒定所需引物序列為:
[0168] P1,5,-GGAACCCACTGGTCATGTTTGCTTTTGCCCAT-3,;
[0169] P2,5, -CCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCA-3,;
[0170] P3,5 ' -CTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATC-3 ' ;
[0171] P4,5 ' -TACCAGGTTATAGTAGCTCAGGAATGCTAAGTCGCTCA-3 ' ;
[0172] 構(gòu)建成功克隆的測序引物為:
[0173] 5 ' -TTGCCCACCGTTTCTCACTTTATTGAATGCAGACC-3 '
[0174] 5 ' -AGGCAACCATCCCGGCTGAGAGAATACCCA-3 '
[0175] 3、移除基因組中用于篩選的Neo抗性基因表達(dá)盒:
[0176] 將 pCAG-Flpo_2A-puro 質(zhì)粒(購自美國 Addgene 公司,貨號:20733)用 FuGENE HD(美國Promega公司,貨號:E2311)轉(zhuǎn)染至cFA-iPSC。因為該質(zhì)粒攜帶表達(dá)Flpo 重組酶,所以可將基因組中整合的外源片段攜帶的Neo基因切除。轉(zhuǎn)染2天后,加入 PuromycinQ μ g/ml ;Invitrogen,貨號:1113803)進行篩選以富集陽性細(xì)胞。Puromycin篩 選兩天后,加入未添加 Puromycin的CDF12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10天。將細(xì)胞消化成單細(xì)胞后, 接種至預(yù)先培養(yǎng)了經(jīng)過絲裂霉素(購自美國Sigma公司,貨號:M0503)滅活的小鼠胚胎成 纖維細(xì)胞(MEFs,購自美國Invitrogen公司,貨號:S1520-100)的培養(yǎng)板中。繼續(xù)培養(yǎng)14 天后挑取單克隆并擴增培養(yǎng),同時用PCR方法鑒定是否成功移除Neo抗性基因。
[0177] DNA測序引物為:
[0178] 5 ' -GCCCACCGTTTCTCACTTTATTGAATGCAGACCA-3 '
[0179] 5, -TGCCTCCATCCAGATCAACAGAACATTGCC-3, ·
[0180] 經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn),基因矯正不影響干細(xì)胞干性基因的表達(dá)和細(xì)胞的核型,同時并且 基因矯正能夠有效改善細(xì)胞在細(xì)胞周期、染色體DNA斷裂和DNA損傷修復(fù)功能等方面的缺 陷(圖 3C-E)。
[0181] 實施例3 :FA_iPSC定向分化以及疾病表型模擬
[0182] 人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞已被證實可在體外定向分化為造血干細(xì)胞及前體細(xì)胞。本發(fā) 明利用實施例2中獲得的FA-iPSC,進行了造血干細(xì)胞和前體細(xì)胞的體外定向分化,我們發(fā) 現(xiàn)FA-iPSC定向分化形成的造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞等都能夠表現(xiàn)出典 型的FA癥狀。
[0183] I. FA-iPSC的造血細(xì)胞定向分化及疾病模擬
[0184] 挑取FA-iPSC單克隆至0P9滋養(yǎng)層細(xì)胞(購自美國ATCC公司,貨號:CRL-2749)上, 利用造血分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)共培養(yǎng)12-14天。分化的細(xì)胞用Accutase (購自美國Innovative Cell Technologies公司,貨號:01-0006)消化后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選獲得造血前體細(xì)胞,用 于下一步實驗分析。
[0185] 定向分化效率檢測:
[0186] 利用流式細(xì)胞術(shù),我們發(fā)現(xiàn)FA-iPSC分化為造血前體細(xì)胞的效率大大低于野生 型,尤其是可以產(chǎn)生粒細(xì)胞,B細(xì)胞,NK細(xì)胞以及T細(xì)胞等重要血液細(xì)胞的⑶34hi/⑶431ow 的細(xì)胞類群。而經(jīng)過基因矯正的cFA-iPSC則有明顯改善(圖4A-C)。
[0187] 克隆集落形成實驗?zāi)MFA血液疾病表型:
[0188] 將分選的CD34+細(xì)胞接種于半固體培養(yǎng)基MethoCult GF+H4435(Stem Cell Technologies)。培養(yǎng)15天后即可見集落出現(xiàn),并進行計數(shù)。選取相應(yīng)集落,用Wright stain(Millipore)染色鑒定細(xì)胞類型。
[0189] FA-iPSC分化的造血干細(xì)胞只能產(chǎn)生CFU-GM(粒細(xì)胞,巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞),卻 不能產(chǎn)生紅系細(xì)胞和巨核細(xì)胞。而經(jīng)過基因矯正的cFA-iPSC分化的造血干細(xì)胞則能產(chǎn)生 全部類型的細(xì)胞(圖4D,E)。
[0190] 體內(nèi)移植實驗檢驗基因矯正FA細(xì)胞用于移植治療:
[0191] 將5X IO5個造血前體細(xì)胞注射入半致死劑量(325cGy)照射的NSG小鼠 (NOD scid gamma(NSG)小鼠,購自美國Jackson Lab公司,貨號:005557)股骨,分別在注射4周和7周 后通過眼眶采血檢測干細(xì)胞的體內(nèi)分化情況,并于7周后處死小鼠,收集其骨髓樣品用于 移植效率的雜合性分析。
[0192] 移植效率雜合性分析:
[0193] 分離小鼠的骨髓細(xì)胞,用Qiagen DNeasy blood and tissue kit提取DNA樣品。 利用qPCR鑒定其中的人基因組比例。
[0194] 經(jīng)過基因矯正的cFA-iPSC分化的造血干細(xì)胞可以用于移植治療,將細(xì)胞移植進 入輻射照射過的免疫缺陷鼠,細(xì)胞可以成功定植,并開始發(fā)揮正常的造血分化功能,提示以 此細(xì)胞類群進行對FA進行造血干細(xì)胞治療的可能性(圖4F)。
[0195] 2.利用間充質(zhì)干細(xì)胞模擬范可尼病中胚層缺陷
[0196] 研究表明FA患者中普遍存在中胚層細(xì)胞缺陷,本發(fā)明可以利用FA-iPSC定向分化 模擬中胚層的病理損傷:
[0197] 1)間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)生和鑒定。
[0198] 首先將FA-iPSC進行擬胚體(EB)分化,分化14天,將EB接種于matrigel包被的 6孔板中進行培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)2周至纖維狀細(xì)胞出現(xiàn)。再經(jīng)過一次傳代后,利用流式細(xì)胞術(shù) 分選其中的⑶73,⑶90,⑶105陽性細(xì)胞類群,即為間充質(zhì)干細(xì)胞(圖5A),繼續(xù)傳代培養(yǎng)。 FA-iPSC可定向分化為間充質(zhì)干細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)其在分化效率上與野生型iPSC存在明顯的差 異。
[0199] 2)FA間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)提前衰老癥狀。
[0200] FA-iPSC衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞提前出現(xiàn)了衰老癥狀。利用細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)FA-iPSC 衍生的間充質(zhì)細(xì)胞只能在體外擴增3代(圖5B);利用Beta-gal染色顯示FA-iPSC衍生的 間充質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重衰老(圖5C);利用qPCR檢測到細(xì)胞提前表達(dá)衰老基因 pl6和p21(圖OT)。
[0201] 3)FA-iPSC衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞模擬FA患者的間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的缺陷
[0202] FA-iPSC衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞喪失了分化的能力,無法進一步分化為脂肪、成骨、 和軟骨細(xì)胞。
[0203] 成骨分化:MSC細(xì)胞培養(yǎng)于成骨分化培養(yǎng)基中,von Kossa(IHC world)染色鑒定
[0204] 軟骨分化:MSC細(xì)胞培養(yǎng)與軟骨分化培養(yǎng)基中,Alcian blue (IHC world)染色鑒 定。
[0205] 脂肪分化:MSC加入脂肪分化培養(yǎng)基,Oil red 0(IHC world)染色鑒定。
[0206] 4)經(jīng)過基因矯正的cFA-iPSC細(xì)胞可消除上述由于FA通路缺陷帶來的間充質(zhì)干細(xì) 胞損傷(圖5B-E)。提示基因矯正的FA間充質(zhì)干細(xì)胞可用于移植間充質(zhì)細(xì)胞治療。
[0207] 3.定向分化模擬FA患者神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀
[0208] 研究表明FA患者會并發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)異常,例如腦圍過小和智力障礙等。然而由于 神經(jīng)組織取材技術(shù)的限制,針對FA對于神經(jīng)系統(tǒng)的影響機制無法開展。本發(fā)明創(chuàng)造的 FA-iPSC體外定向分化技術(shù),首次建立了范可尼神經(jīng)系統(tǒng)疾病模擬體系:
[0209] I) FA-iPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞的產(chǎn)生和鑒定:
[0210] 將FA-iPSC接種于MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞,加入"神經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基-1"培養(yǎng)2天,再 換用"神經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基-2"繼續(xù)培養(yǎng)5天。將細(xì)胞消化為單細(xì)胞后接種于Matrigel 包被的平板上,培養(yǎng)于NSMM培養(yǎng)基中。經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn):FA-iPSC可成功定向分化為神經(jīng)干 細(xì)胞,并且與基因矯正的cFA-iPSC細(xì)胞相比,其神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)無明顯差異。然而 FA-iPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞能夠明顯表現(xiàn)出FA信號通路的缺陷,如招募FANCD因子能力(圖 6C)以及對MMC敏感性(圖6D,E)等疾病相關(guān)表型。
[0211] 2) FA-iPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化:
[0212] 將FA-iPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞接種于Matrigel包被的6孔板中,用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 基NSMM維持培養(yǎng)3-5天。換為自發(fā)分化培養(yǎng)基SDNM繼續(xù)培養(yǎng)14天后,進行神經(jīng)元特異標(biāo) 記物Tujl的染色鑒定,發(fā)現(xiàn)FA-iPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的能力大幅降低(圖 6F)。
[0213] 3)FA-iPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞顯示明顯的腫瘤發(fā)生傾向,通過microarray和qPCR檢 測發(fā)現(xiàn)FA-iPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞中的抑癌基因和神經(jīng)分化基因大幅下調(diào),而原癌基因的表 達(dá)則大幅上調(diào)(圖6G,I)。
[0214] 4) cFA-iPSC衍生神經(jīng)干細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞表型均得到一定程度的糾正(圖 6)。
[0215] 實施例4 :針對FA的個性化藥物篩選平臺的建立以及備選藥物的篩選
[0216] 目前市場上還沒有針對FA的特效藥物。本發(fā)明首創(chuàng)的高效FA-iPSC產(chǎn)生技術(shù)以 及FA-iPSC定向分化產(chǎn)生的各種衍生細(xì)胞為針對FA的個性化藥物篩選提供了最佳的細(xì)胞 模型?;诖似脚_,本發(fā)明篩選了多種信號通路的作用分子,如Sirtl通路激動劑、P38激 酶抑制劑、抗炎性分子以及激素受體激動劑等涉及造血機能的小分子化合物庫。
[0217] FA-iPSC進行造血定向分化的第6天,向培養(yǎng)基中分別添加待篩選小分子:1 μ M白 藜蘆醇(購自美國Sigma公司,貨號:R5010_100MG),50ng/ml Danazol (購自美國Sigma公 司,貨號:D8399-100MG),5yM DoramapimocK分別購自美國BIRB公司,貨號:796以及美國 LC Laboratories 公司,貨號:D_2444),5 μ M Dasatinib(美國 LC Laboratories 公司,貨 號:D-3307)和 5nM tremulacin(購自美國 Santa Cruz Biotech 公司,貨號:sc_237233)。 隔天換液。分化完成后,對產(chǎn)生的細(xì)胞進行流式細(xì)胞術(shù)分析(熒光素 PE標(biāo)記的抗人細(xì)胞表 面抗原分子CD34抗體,熒光素 FITC標(biāo)記的抗人細(xì)胞表面抗原分子CD43抗體以及熒光素 APC標(biāo)記的抗人細(xì)胞表面抗原分子Tra-1-85抗體),比較其分化效率。
[0218] 對于集落形成實驗,將分選的CD34+細(xì)胞接種于含待測藥物(相同體積待測藥物的 作濃度分另Ij為:50ng/ml danazol,5uM doramapimod, 5 μ M dasatinib,5nM tremulacin, 并以相同體積的DMSO作為處理對照組)的Methocult (Stem Cell Technologies,Η4435)培 養(yǎng)基上,培養(yǎng)至集落出現(xiàn)。比較小分子處理組與對照組的差異。
[0219] 本發(fā)明通過在FA-iPSC造血分化的過程中分別添加各種小分子,并且利用流式細(xì) 胞術(shù)檢測分化形成的造血前體細(xì)胞中CD34和CD43雙陽性細(xì)胞的比例,來衡量小分子待測 藥物對攜帶致病基因突變的FA-iPSC造血分化過程的治療效果(如圖7A,B所示)。研究發(fā) 現(xiàn):1)參與Sirt信號通路的白藜蘆醇對造血干細(xì)胞生成沒有促進作用;2) -種用于血液 病廣譜治療的一線藥物,Dazazol,針對FA-iPSC衍生細(xì)胞,cFA-iPSC衍生細(xì)胞以及正常的 血液細(xì)胞均能夠表現(xiàn)出一定的改善作用,說明其對FA沒有特異性的治療效果;3) -種特異 性P38抑制劑,Doramapimod,能夠顯著提高FA-iPSC衍生細(xì)胞中⑶34+/⑶43+細(xì)胞類群分 化效率,尤其是對于提高CD34high/CD431ow類群的細(xì)胞分化效率的作用更為突出。更重要 的是,由Doramapimod處理的FA-iPSC細(xì)胞分化形成的⑶34+造血前體細(xì)胞,開始具有進一 步分化為CFU-GM的能力,說明對Doramapimod對FA疾病表型的明顯的治療效果(圖7C)。 此外,發(fā)明人利用該藥篩平臺還篩選出一種新型抗炎性天然小分子化合物,tremulacin,該 分子能夠通過抑制INF γ、TNF和IL6等細(xì)胞因子,特異性提高FA-iPSC衍生的造血干細(xì)胞 進一步分化的能力(圖7D)。
【權(quán)利要求】
1. 一種制備范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法,所述方法包括:利用附著 體載體將重編程因子0CT4、S0X2、KLF4、cMYC和LIN28的編碼核酸以及針對人p53基因的 shRNA轉(zhuǎn)入具有突變的范可尼貧血癥相關(guān)基因的范可尼貧血癥患者體細(xì)胞中;之后,在丁 酸鈉(NaBT)的存在下培養(yǎng)所述體細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述范可尼貧血癥患者體細(xì)胞是范可尼貧血癥患 者成纖維細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述重編程因子0CT4、S0X2、KLF4、cMYC和LIN28 的編碼核酸以及所述針對人P53基因的shRNA的核酸序列如SEQ. ID. NO: 1-6所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中丁酸鈉的工作濃度為50-200 iiM。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述附著體載體是Episomal質(zhì)粒載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述突變的范可尼貧血癥相關(guān)基因是FANCA基因。
7. 利用根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法制備的范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多 能干細(xì)胞。
8. -種制備用于移植治療范可尼貧血癥的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞的 方法,所述方法包括: 對根據(jù)權(quán)利要求7所述的范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的突變的范可尼 貧血癥相關(guān)基因進行基因矯正,優(yōu)選采用非整合型腺病毒載體作為基因打靶載體; 將所述經(jīng)基因矯正的范可尼貧血癥患者自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為造血干細(xì)胞、 間充質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞。 9. Doramapimod在制備用于治療范可尼貧血癥的藥物中的用途。 10. Tremulacin在制備用于治療范可尼貧血癥的藥物中的用途。
【文檔編號】A61K31/5377GK104419683SQ201310409527
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】劉光慧, 曲靜, 胡安·卡洛斯·伊斯畢華·貝爾蒙特, 李默, 鈴木敬一郎, 徐秀玲, 張維琦, 任若通 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所