一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑的制作方法
【專利摘要】一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，屬于凍干保護(hù)劑【技術(shù)領(lǐng)域】。該凍干保護(hù)劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30～100g、中藥黃酮20～60g、維生素6～10g、法氏囊素2～16mg、明膠4～6g和蔗糖40～70g，所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到：生地、懷牛膝、桑白皮、茯苓、蘆根、淫羊藿、生甘草和問荊。該凍干保護(hù)劑能夠大幅度提高了機(jī)體的免疫力，提高體液免疫能力，刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的中和抗體，提高了機(jī)體預(yù)防疾病的能力。
【專利說明】一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于凍干保護(hù)劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑。
【背景技術(shù)】
[0002]豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome, PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以妊娠母豬發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔和木乃伊胎，仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道癥狀的疾病。PRRS難以有效的防制，首先是PRRSV以肺巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞，具有抗體依賴性增強(qiáng)作用(ADE)造成了一定的免疫抑制，其次是PRRSV不斷的發(fā)生著變異，并且PRRS沒有有效的治療藥物，免疫接種是目前控制該病的最主要措施。
[0003]豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗具有免疫效果好，免疫期長等優(yōu)點(diǎn)，而且弱毒疫苗還可以用來對母豬免疫接種而使幼仔獲得被動免疫。研究表明，活疫苗的使用在臨床疾病的發(fā)生和嚴(yán)重性、病毒血癥持續(xù)期和排毒等情況都有積極的影響?；钜呙绲拿庖呖梢砸鸺?xì)胞免疫，可抵抗病毒血癥，防止病毒在肺部繁殖并引起呼吸系統(tǒng)和繁殖系統(tǒng)損害。但是，弱毒疫苗所引起體液免疫的能力低下，產(chǎn)生中和抗體的水平低下，影響了機(jī)體抵御病毒攻擊的能力。活疫苗免疫后，PRRSV抗體約在免疫2周后出現(xiàn)，在免疫后四周時達(dá)到高峰，但這些抗體沒有中和活性。通常情況下，PRRSV特異性中和抗體產(chǎn)生大約出現(xiàn)在免疫后四周時，并且其滴度在整個免疫期內(nèi)都呈現(xiàn)較低的滴度。
[0004]近年來，人們針對活疫苗凍干保護(hù)劑進(jìn)行了大量研究，多為耐熱保護(hù)劑，解決了疫苗在運(yùn)輸使用過程中的耐熱問題，但對于提高活疫苗效果方面幾乎沒有提升。
`[0005]多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力，同時多糖也具有很好的耐熱效果，多種實(shí)驗(yàn)表明中藥多糖可作為耐熱保護(hù)劑添加于活疫苗凍干保護(hù)劑中。
[0006]維生素是機(jī)體代謝中必不可少的有機(jī)化合物。機(jī)體猶如一座極為復(fù)雜的化工廠，不斷地進(jìn)行著各種生化反應(yīng)。其反應(yīng)與酶的催化作用有密切關(guān)系。酶要產(chǎn)生活性，必須有輔酶參加。已知許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子。因此，維生素是維持和調(diào)節(jié)機(jī)體正常代謝的重要物質(zhì)。
[0007]黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類物質(zhì)，也是自然界藥用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15個碳原子并以C6-C3-C6的方式構(gòu)成的三環(huán)天然有機(jī)物，是植物在長期自然選擇中產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物，現(xiàn)在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于果蔬、中草藥中，無毒副作用，它具有顯著的清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂降血壓等藥理保健功能，是一類極具開發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑，這些抗氧化活性物質(zhì)可以減少和清除機(jī)體內(nèi)自由基，具有預(yù)防疾病的作用。
[0008]法氏囊素(bursin,BS)是從禽類特有的體液免疫中樞淋巴器官法氏囊(Bursa offabricius)中分離出來的一種活性三肽物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)為L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促進(jìn)禽類和哺乳動物B淋巴細(xì)胞前體的分化、增殖，能提高B細(xì)胞系Daudi細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP水平，加快B細(xì)胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的速度，促進(jìn)B細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成，從而使B細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體能力加強(qiáng)。
[0009]基于上述【背景技術(shù)】，本發(fā)明提出一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用凍干保護(hù)劑。該保護(hù)劑主要由中藥多糖、中藥黃酮、維生素、法氏囊素等組成。本發(fā)明所制備的凍干保護(hù)劑一方面可以提供給活疫苗耐熱保護(hù)，另一方面在疫苗使用過程中大大提高了疫苗的使用效果，同時還兼具了提高機(jī)體免疫力的功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑的技術(shù)方案，該凍干保護(hù)劑能夠大幅度提高了機(jī)體的免疫力，提高體液免疫能力，刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的中和抗體，提高了機(jī)體預(yù)防疾病的能力。
[0011]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于該凍干保護(hù)劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、維生素6~10g、法氏囊素2~16mg、明膠4~6g和鹿糖40~70g,所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:生地、懷牛膝、桑白皮、茯苓、蘆根、淫羊藿、生甘草和問荊。
[0012]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于該凍干保護(hù)劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖50~80g、中藥黃酮30~50g、維生素7~9g、法氏囊素4~12mg、明膠5~6g和鹿糖50~60g。
`[0013]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得:
a、按生地10~30份、懷牛膝20~40份、桑白皮10~20份，獲茶10~30份、蘆根10~30份，淫羊藿10~30份、生甘草10~20份、問荊10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時,熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清液進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥制得中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后經(jīng)冷凍真空干燥制成中藥黃酮。
[0014]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的維生素含有維生素BI 15~35%、維生素C 40~70%和維生素E 10~30%。
[0015]所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的法氏囊素通過以下步驟制得:取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈；按1:1比例加入pH 7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行高速勻衆(zhòng)；勻衆(zhòng)液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復(fù)凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀；上清用1000da截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，膜下液經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，濾過液即為法氏囊素粗提液；粗提液經(jīng)冷凍真空干燥制得法氏囊素凍干粉。
[0016]上述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，設(shè)計(jì)合理，與傳統(tǒng)的凍干保護(hù)劑相比其具有以下優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明所制備的凍干保護(hù)劑，具有耐熱效果，可提高疫苗運(yùn)輸、儲藏等便利性。
[0017]2.采用本發(fā)明凍干保護(hù)劑所制備的疫苗在免疫注射時可以減少豬只疼痛感，降低豬只的應(yīng)激反應(yīng)。
[0018]3.采用本發(fā)明凍干保護(hù)劑制備疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的產(chǎn)生中和抗體，減少免疫空檔期，降低豬只發(fā)病幾率，提高機(jī)體抵御疾病的能力。
[0019]4.采用本發(fā)明凍干保護(hù)劑制備的疫苗免疫機(jī)體后，能促進(jìn)機(jī)體B淋巴細(xì)胞前體的分化、增殖，加快B細(xì)胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的速度，促進(jìn)B細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成，從而使B細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體能力加強(qiáng)，從而可提高機(jī)體免疫力。
【具體實(shí)施方式】`
[0020]為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限止本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0021]實(shí)施例1:中藥多糖和中藥黃酮的制備
a、按生地20份、懷牛膝30份、桑白皮15份、獲茶20份、蘆根20份、淫羊藿20份、生甘草15份、問荊20份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后，再經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
[0022]該實(shí)施例中步驟a中可以稱取生地10份、懷牛膝20份、桑白皮10份，茯苓10份、蘆根10份，淫羊藿10份、生甘草10份、問荊10份進(jìn)行加工，也可以稱取生地30份、懷牛膝40份、桑白皮20份，茯苓30份、蘆根30份，淫羊藿30份、生甘草20份、問荊30份進(jìn)行加工。
[0023]實(shí)施例2:法氏囊素的制備
a、取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈。
[0024]b、稱量法氏囊重量，按1:1 (ff:V)比例加入PH7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行高速勻漿。
[0025]C、勻衆(zhòng)液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復(fù)凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀。
[0026]d、上清用1000da截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，膜下液即為法氏囊素粗提液。
[0027]e、將d中粗提液通過0.22um濾膜過濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥制成法氏囊素凍干粉。
[0028]實(shí)施例3: —種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑的制備
在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖80g、中藥黃酮50g、維生素8g(維生素BI 2g、維生素C 4g和維生素E 2g)、法氏囊素12mg、明膠5g和蔗糖50g，即得到豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實(shí)施例1中的步驟制得，法氏囊素按照實(shí)施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0.5g，磷酸氫二鈉I~1.2g，磷酸二氫鉀0.05~0.5g，氯化鈣0.05~0.2g，含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116°C，高壓滅菌30分鐘得到。
[0029]實(shí)施例4:一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑的制備` 在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖30g、中藥黃酮20g、維生素6g (維生素BI0.9g、維生素C 4.2g和維生素E 0.9g)、法氏囊素2mg、明膠4g和蔗糖40g，即得到豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實(shí)施例1中的步驟制得，法氏囊素按照實(shí)施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0.5g，磷酸氫二鈉I~1.2g，磷酸二氫鉀0.05~0.5g，氯化鈣0.05~0.2g，含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116°C，高壓滅菌30分鐘得到。
[0030]實(shí)施例5: —種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑的制備
在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖100g、中藥黃酮60g、維生素IOg (維生素BI3.5g、維生素C 4g和維生素E 2.5g)、法氏囊素16mg、明膠6g和蔗糖70g，即得到豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實(shí)施例1中的步驟制得，法氏囊素按照實(shí)施例2中的步驟制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0.5g，磷酸氫二鈉I~1.2g，磷酸二氫鉀0.05~0.5g，氯化鈣0.05~0.2g，含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116°C，高壓滅菌30分鐘得到。
[0031 ] 實(shí)施例6:凍干保護(hù)劑的使用方法
1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒懸液制備 (O生產(chǎn)用毒種制備
將已長成單層的Marc-145細(xì)胞,棄去生長液,按生長液1%量接種病毒，37°C吸附I小時，加入細(xì)胞維持液，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，40小時后開始觀察，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%時，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，置_20°C保存。
[0032](2)制苗材料的選擇:選擇生長良好的Marc-145單層細(xì)胞。
[0033](3)制苗用細(xì)胞毒液的繁殖將已長成良好單層的Marc-145細(xì)胞，棄去生長液，用pH值7.2-7.6的MEM維持液將生產(chǎn)用毒種稀釋3-4倍，按生長液量的1%接種稀釋后的病毒，37°C吸附I小時，加細(xì)胞維持液，置37°C繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。接毒后，每天觀察細(xì)胞病變情況，病變細(xì)胞達(dá)80%時，即可收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，置-20°C以下凍結(jié)保存。
[0034]2.疫苗制備
將無菌檢驗(yàn)和病毒含量檢測合格的細(xì)胞毒液，混合于同一滅菌容器內(nèi)，按1:1 (v:v)t匕例加入實(shí)施例3、4或5中制備的凍干保護(hù)劑，充分混勻后定量分裝，冷凍真空干燥制成豬繁殖與呼吸綜合征凍干活疫苗(實(shí)驗(yàn))，每頭份病毒含量應(yīng)> IO6 0TCID500
[0035]同時將將無菌檢驗(yàn)和病毒含量檢測合格的細(xì)胞毒液，混合于同一滅菌容器內(nèi)，按1:1 (V:V)比例加入蔗糖牛奶保護(hù)劑，充分混勻后定量分裝，經(jīng)冷凍真空干燥制成豬繁殖與呼吸綜合征凍干活疫苗(對照)，每頭份病毒含量應(yīng)≥IO6 0TCID500
[0036]3.疫苗檢驗(yàn)
(1)隨保存時間，各項(xiàng)指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果
將上述制備的兩批疫苗放置常溫(25°C)進(jìn)行保存，病每隔一個月進(jìn)行病毒含量檢測，檢測結(jié)果見表1:
表1保存期檢測結(jié)果(25 °C)
【權(quán)利要求】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于該凍干保護(hù)劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、維生素6~10g、法氏囊素2~16mg、明膠4~6g和鹿糖40~70g,所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:生地、懷牛膝、桑白皮、茯苓、蘆根、淫羊藿、生甘草和問荊。
2.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于該凍干保護(hù)劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖50~80g、中藥黃酮30~50g、維生素7~9g、法氏囊素4~12mg、明膠5~6g和鹿糖50~60g。
3.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得: a、按生地10~30份、懷牛膝20~40份、桑白皮10~20份，獲茶10~30份、蘆根10~30份、淫羊藿10~30份、生甘草10~20份、問荊10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時,熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮； d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C`吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥多糖； g、將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后，再經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
4.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的維生素含有維生素BI 15~35%、維生素C 40~70%和維生素E 10~30%。
5.如權(quán)利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的法氏囊素通過以下步驟制得:取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，pH7.2滅菌冷PBS洗凈；按1:1比例加入pH 7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行高速勻衆(zhòng)；勻衆(zhòng)液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復(fù)凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀；上清用1000da截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，膜下液經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，濾過液即為法氏囊素粗提液；粗提液經(jīng)冷凍真空干燥制得法氏囊素凍干粉。
【文檔編號】A61P37/04GK103495180SQ201310426405
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】李陽, 閆艷麗, 劉雪, 王二先, 徐曉艷, 盛璐絲 申請人:浙江美保龍生物技術(shù)有限公司