Senp1蛋白的抑制劑及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及SENP1蛋白的抑制劑及其用途，具體地，本發(fā)明涉及SENP1蛋白的抑制劑shRNA，以及SENP1蛋白的抑制劑用于制備預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的藥物中的用途，以及用于制備抑制惡性血液腫瘤細胞的增殖和/或促進惡性血液腫瘤細胞凋亡的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及篩選用于預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的藥物的方法。
【專利說明】SENP1蛋白的抑制劑及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及SENPl蛋白的抑制劑及其用途，具體地，本發(fā)明涉及SENPl蛋白的抑制 劑shRNA，以及SENPl蛋白的抑制劑用于制備預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的藥物中的用途，以 及用于制備抑制惡性血液腫瘤細胞的增殖和/或促進惡性血液腫瘤細胞凋亡的藥物中的 用途。本發(fā)明還涉及篩選用于預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的藥物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性血液腫瘤包括白血病、骨髓瘤等疾病。慢性髓性白血?。–hronic myeloid leukemia，CML)主要是由造血干細胞在原癌蛋白BCR-ABL的作用下發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生 的一類惡性克隆性血液疾病，也稱慢性粒細胞白血病。CML的發(fā)病主要是因為位于9q34 的abl基因與位于22qll的bcr基因相互易位形成bcr-abl融合基因，其編碼具有強蛋 白酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，該蛋白通過激活不同的信號途徑，最終導(dǎo)致造 血細胞的惡性轉(zhuǎn)化[Cilloni D, Saglio G.Molecular pathways:BCR_ABL. Clin Cancer Res. 2012; 18 (4) :930-7]。目前，針對BCR-ABL設(shè)計的特異性抑制劑格列衛(wèi)（Gleevec， 又名Imatinib, STI571)已經(jīng)發(fā)展成為臨床治療CML的一線藥物[Takahashi N, Miura M. Therapeutic drug monitoring of imatinib for chronic myeloid leukemia patients in the chronic phase. Pharmacology. 2011; 87 (5-6): 241-8]。但是，在臨床治療中，類似 于格列衛(wèi)等藥物對CML加速期病人的療效較差[Eiring AM, Khorashad JS, Morley K，et al.Advances in the treatment of chronic myeloid leukemia. BMC Med. 2011;9:99]〇 即使慢性期的病人，也有一定比例的病人會產(chǎn)生格列衛(wèi)的耐藥從而導(dǎo)致CML的治療失 敗。CML耐藥和復(fù)發(fā)的主要機制是靜息期CML腫瘤干細胞對格列衛(wèi)并不敏感，部分病人 bcr-abl基因存在格列衛(wèi)結(jié)合位點的突變[Alikian M, Gerrard G, Subramanian PG, et al. BCR-ABLlkinase domain mutations!methodology and clinical evaluation. Am J Hematol. 2012; 87 (3) : 298-304]。目前，進一步提高CML治療效果策略是針對多靶點的藥 物聯(lián)合應(yīng)用，如格列衛(wèi)聯(lián)合其它酪氨酸激酶抑制劑等。動物實驗也表明靶向蛋白乙?；?和泛素化相關(guān)的靶點可以提高格列衛(wèi)殺傷CML腫瘤干細胞的效率[Li L，Wang L，Li L，et al. Activation of p53by SIRTlinhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 2012; 21 (2) : 266-81] 〇 多發(fā)性 骨髓瘤（multiple myeloma, MM)也是一種臨床常見的惡性血液腫瘤，主要是一種楽細胞惡 性腫瘤，目前其治療也有耐藥的問題需要解決。
[0003] SUMO (small ubiquitin-related modifier protein)是一種小泛素相關(guān)修 飾物，能共價結(jié)合許多調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子等。SUMO 化（SUMOylation)是重要的蛋白修飾方式，對蛋白-蛋白之間的相互作用、亞細胞定 位、基因轉(zhuǎn)錄的活性以及祀蛋白的穩(wěn)定性等具有重要的調(diào)節(jié)作用[Geiss-Friedlander R,Melchior F.Concepts in sumoylation: a decade on.Nat Rev Mo I Cell Biol. 2007;8(12) :947-56.]。人類基因組編碼四種不同的SUMO蛋白，分別為SUM01、SUM02、 SUM03和SUM04。SUMO化修飾是一個動態(tài)可逆的過程，將SUMO從靶蛋白上去除，稱為去 SUMO 化（desumoylation)。去 SUMO 化則是由一組 SUMO 特異性蛋白酶（SUMO-specific protease, SENPs)家方矣來完成[Hay RT. SUM0-specific proteases:a twist in the tail. Trends Cell Biol.2007;17(8):370-6]。目前已鑒定了 SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、 SENP6、SENP7等人SENP家族成員。其中，SENPl是研究最深入的成員之一。SENPl介 導(dǎo)的去SUMO化在前列腺癌等發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[Zuo Y，Cheng JK. Small ubiquitin-like modifier protein-specific proteaseland prostate cancer. Asian J Androl. 2009; 11 (I) :36-8]。SENPl在早期T細胞、B細胞的發(fā)育中至關(guān)重要。條件性基因 剔除SENPl基因?qū)е滦∈罅馨拖到y(tǒng)發(fā)育障礙。另外，SENPl缺失還通過增加 XBPl的SUMO 化促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡[Jiang Z, Fan Q, Zhang Z，et al. SENPldeficiency promotes ER stress-induced apoptosis by increasing XBPISUMOylation. Cell Cycle. 2012; 11 (6) :1118-22]。但目前為止，尚沒有以SENPl為惡性血液腫瘤治療靶點的報 道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明人經(jīng)過大量實驗研究，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)CML患者、麗患者的干、祖細胞的 SENPl表達比正常骨髓捐獻者要高，并且進一步發(fā)現(xiàn)SENPl蛋白的抑制劑可以抑制惡性血 液腫瘤細胞的增殖并促進凋亡，由此完成了本發(fā)明。
[0005] 本發(fā)明第一方面涉及SENPl蛋白的抑制劑或者SENPl蛋白的抑制劑與其它藥物的 聯(lián)合應(yīng)用用于制備預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的藥物中的用途。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑是指能夠抑 制SENPl蛋白發(fā)揮功能的物質(zhì)，例如為能夠抑制SENPl基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄、翻 譯后修飾的核酸、蛋白或化合物，或者為能夠和SENPl蛋白結(jié)合、進而抑制SENPl蛋白活性 的核酸、蛋白或化合物，例如為shRNA，例如為如SEQ ID NO :1所示的shRNA。
[0007] 在本發(fā)明的實施方案中，所述核酸例如為shRNA、siRNA或miRNA。
[0008] 在本發(fā)明的實施方案中，所述蛋白例如為抗體，所述抗體例如為單克隆抗體或多 克隆抗體。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑為包含所述 shRNA的重組載體。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑為包含所述 重組載體的重組宿主細胞。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的用途，其中所述的惡性血液腫瘤選自慢性髓性白血 病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等。
[0012] 本發(fā)明第二方面涉及SENPl蛋白的抑制劑或者SENPl蛋白的抑制劑與其它藥物的 聯(lián)合應(yīng)用用于在體外/體內(nèi)抑制惡性血液腫瘤細胞的增殖和/或促進惡性血液腫瘤細胞凋 亡的用途。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑是指能夠抑 制SENPl蛋白發(fā)揮功能的物質(zhì)，例如為能夠抑制SENPl基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄、翻 譯后修飾的核酸、蛋白或化合物，或者為能夠和SENPl蛋白結(jié)合、進而抑制SENPl蛋白活性 的核酸、蛋白或化合物，例如為shRNA，例如為如SEQ ID NO :1所示的shRNA。
[0014] 在本發(fā)明的實施方案中，所述核酸例如為shRNA、siRNA或miRNA。
[0015] 在本發(fā)明的實施方案中，所述蛋白例如為抗體，所述抗體例如為單克隆抗體或多 克隆抗體。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑為包含所述 shRNA的重組載體。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑為包含所述 重組載體的重組宿主細胞。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的用途，其中所述的惡性血液腫瘤選自慢性髓性白血 病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等。
[0019] 本發(fā)明第三方面涉及SENPl蛋白的抑制劑或者SENPl蛋白的抑制劑與其它藥物的 聯(lián)合應(yīng)用用于制備抑制惡性血液腫瘤細胞的增殖和/或促進惡性血液腫瘤細胞凋亡的藥 物中的用途。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑是指能夠抑 制SENPl蛋白發(fā)揮功能的物質(zhì)，例如為能夠抑制SENPl基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄、翻 譯后修飾的核酸、蛋白或化合物，或者為能夠和SENPl蛋白結(jié)合、進而抑制SENPl蛋白活性 的核酸、蛋白或化合物，例如為shRNA，例如為如SEQ ID NO :1所示的shRNA。
[0021] 在本發(fā)明的實施方案中，所述核酸例如為shRNA、siRNA或miRNA。
[0022] 在本發(fā)明的實施方案中，所述蛋白例如為抗體，所述抗體例如為單克隆抗體或多 克隆抗體。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑為包含所述 shRNA的重組載體。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，其中所述的SENPl蛋白的抑制劑為包含所述 重組載體的重組宿主細胞。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途，其中所述的惡性血液腫瘤選自慢性髓性白血 病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等。
[0026] 本發(fā)明第四方面涉及shRNA用于下調(diào)體外/體內(nèi)細胞中SENPl蛋白的表達的用 途，優(yōu)選地，所述shRNA為如SEQ ID NO :1所示的shRNA。
[0027] 本發(fā)明第五方面涉及shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0028] 本發(fā)明還涉及重組載體，其含有本發(fā)明第五方面任一項的shRNA。
[0029] 本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其含有本發(fā)明所述的重組載體。
[0030] 本發(fā)明還涉及篩選用于預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的藥物的方法，其包括篩選 SENPl蛋白的抑制劑的步驟；
[0031] 優(yōu)選地，所述SENPl蛋白的抑制劑是指能夠抑制SENPl蛋白發(fā)揮功能的物質(zhì)，例如 為能夠抑制SENPl基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾的核酸、蛋白或化合物，或 者為能夠和SENPl蛋白結(jié)合、進而抑制SENPl蛋白活性的核酸、蛋白或化合物；
[0032] 優(yōu)選地，所述惡性血液腫瘤選自慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤。
[0033] 在本發(fā)明的實施方案中，所述核酸例如為shRNA、siRNA或miRNA。
[0034] 在本發(fā)明的實施方案中，所述蛋白例如為抗體，所述抗體例如為單克隆抗體或多 克隆抗體。
[0035] 本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的方法、或者抑制惡性血液腫瘤細胞的 增殖、或者促進惡性血液腫瘤細胞凋亡的方法，所述方法包括給有需要的受試者有效量的 SENPl蛋白的抑制劑的步驟。
[0036] 在本發(fā)明的實施方案中，所述SENPl蛋白的抑制劑是指能夠抑制SENPl蛋白發(fā)揮 功能的物質(zhì)，例如為能夠抑制SENPl基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾的核酸、 蛋白或化合物，或者為能夠和SENPl蛋白結(jié)合、進而抑制SENPl蛋白活性的核酸、蛋白或化 合物。
[0037] 在本發(fā)明的實施方案中，所述核酸例如為shRNA、siRNA或miRNA。在本發(fā)明的具 體實施方案中，所述shRNA的序列如SEQ IDNO :1所示。
[0038] 在本發(fā)明的實施方案中，所述蛋白例如為抗體，所述抗體例如為單克隆抗體或多 克隆抗體。
[0039] 在本發(fā)明中，所述SENPl蛋白的抑制劑是指能夠抑制SENPl蛋白發(fā)揮功能的物質(zhì)， 例如是指能夠抑制SENPl基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾中的任一步驟的物質(zhì)， 例如為能夠抑制SENPl基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾的核酸分子、蛋白或化 合物，或者所述抑制劑是指能夠和SENPl蛋白結(jié)合、進而抑制SENPl蛋白活性的核酸、蛋白 或化合物，所述抑制劑可以為天然分子或化合物，也可以為人工合成的分子或化合物，所述 分子可以是核酸分子或蛋白分子。
[0040] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，可以利用SENPl蛋白制備抗體，通過抗體與蛋白的結(jié)合來 抑制SENPl蛋白的活性；或者可以根據(jù)SENPl蛋白活性中心的結(jié)構(gòu)設(shè)計或篩選蛋白或化合 物，從而抑制SENPl蛋白的活性。
[0041] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，可以根據(jù)SENPl基因或其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA的序列選取靶序 列設(shè)計小干擾RNA (siRNA)或者小RNA (microRNA、miRNA)分子。該siRNA或者miRNA分 子可以干擾基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯或轉(zhuǎn)錄、翻譯后的修飾，進而影響蛋白的表達。
[0042] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，為了延長siRNA對靶基因表達的抑制作用，可以設(shè)計一對 特定的寡核苷酸序列，退火后克隆至載體中，該重組載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA),其可以自身折疊配對成莖長為19-21個堿基的莖環(huán)（8七6111-1〇(^)結(jié) 構(gòu)，其中該19-21個堿基即來源于靶基因 mRNA的一段特定序列，這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體在細 胞內(nèi)很快被切割形成有功能的siRNA。這種載體表達的shRNA經(jīng)剪切形成的siRNA具有表 達量穩(wěn)定、待續(xù)時間長的特點，從而可引起目標基因表達的長效抑制。
[0043] 在本發(fā)明中，所述shRNA是指短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA)，shRNA包括兩個 短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop)序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由pol III啟動子控制。 隨后再連上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止子。將siRNA序列克隆進質(zhì)粒載體中， 可以在活體中輸送"小干擾RNA"（siRNA)。當送入動物體內(nèi)時，該發(fā)夾序列被表達出來，形 成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該莖環(huán)結(jié)構(gòu)被切割成有功能的siRNA，發(fā)揮基因沉默作用。
[0044] 在本發(fā)明中，所述siRNA是指Small interfering RNA，是一種小RNA分子，由大約 21-25個核苷酸組成，由Dicer (RNAase III家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成， siRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補的目標mRNA的沉默。
[0045] 在本發(fā)明中，所述microRNA (miRNA)是近年來在多種真核細胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一 類來源于內(nèi)源性染色體上的非編碼單鏈RNA，長度約為22 (18?25)個核苷酸（nt)的短 序列，在進化上具有高度的保守性，它們基于與靶mRNA的序列互補，能夠通過與靶mRNA特 異性的堿基互補配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào) 控。
[0046] 在本發(fā)明的實施方案中，所述SENPl蛋白的抑制劑是shRNA，其在細胞內(nèi)經(jīng)過剪切 形成siRNA通過RNA干涉作用導(dǎo)致SENPl的基因表達的沉默。
[0047] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述shRNA的序列為5' CCGGGCGCCAGAUUGAAGAACAGA ACUCGAGUUCUGUUCUUC AAUCUGGCGCUUUUU3' （SEQ ID N0:1)。
[0048] 該shRNA所針對的靶序列為人SNEPlmRNA的第1396-1416位，即 5'GCGCCAGAUUGAAGAACAGAA3'（SEQ ID N0:2)。
[0049] 該 shRNA 轉(zhuǎn)錄生成的 DNA 寡核苷酸鏈為 5 ' CCGGGCGCCAGATTGAAGAACAGAACTCGAGTT CTGTTCTT CAATCTGGCGCTTTTT3, (SEQ ID NO ：3)〇
[0050] 該shRNA可剪切形成siRNA正義鏈和反義鏈，
[0051] 正義鏈為 5'GCGCCAGAUUGAAGAACAGAA3'（SEQ ID NO :4)，
[0052] 反義鏈為 5'UUCUGUUCUUCAAUCUGGCGC3'（SEQ ID NO :5)。
[0053] 在本發(fā)明的實施方案中，所述載體為能夠克隆表達shRNA的表達載體，例如為原 核表達載體、真核表達載體、噬菌體載體或病毒載體。其中所述原核表達載體例如為PET載 體、PGEX載體，所述真核表達載體例如為pcDNA3. 1、pEGFP-Cl、pPIC9K，所述噬菌體載體例 如為λ噬菌體載體λ gt、Agt-λ B，所述病毒載體例如為逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺 相關(guān)病毒載體。在本發(fā)明的實施方案中，所述病毒載體為慢病毒載體。
[0054] 在本發(fā)明的實施方案中，所述宿主細胞可以為原核細胞或真核細胞。所述真核細 胞例如為哺乳動物細胞。所述宿主細胞可以通過向原核細胞或真核細胞中引入/轉(zhuǎn)染上述 的重組載體而得到。
[0055] 在本發(fā)明中，所述原核細胞例如可以為大腸桿菌DH5a、BL21、JMlOLToplOjy^ii 真核細胞例如可以為腫瘤細胞，所述腫瘤細胞例如可以為惡性血液腫瘤細胞，例如慢性髓 性白血病細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞等，所述哺乳動物例如可以為大鼠、小鼠、犬、小型豬、猴、 人。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述宿主細胞為真核細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中， 所述哺乳動物為大鼠或人。
[0056] 在本發(fā)明中，可以利用本領(lǐng)域所知的任何種類的轉(zhuǎn)染方法獲得轉(zhuǎn)染有特定核酸或 載體的重組宿主細胞，例如，可通過電穿孔或顯微注射將核酸引入細胞中；或者，可使用脂 轉(zhuǎn)染試劑如FuGENE6、X-tremeGENE和LipofectAmine ;或者，可通過基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病 毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的適當病毒病毒載體將核酸引入細胞中。
[0057] 在本發(fā)明的實施方案中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)染的方法將含有shRNA的載體 轉(zhuǎn)染入離體或在體細胞中。
[0058] 在本發(fā)明中，所述抑制惡性血液腫瘤細胞的增殖是指與不干預(yù)的情況相比，即不 使用增殖抑制劑的情況相比，所述惡性血液腫瘤細胞的增殖至少減少30%，例如至少減少 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或者 99%。
[0059] 在本發(fā)明中，所述促進惡性血液腫瘤細胞凋亡是指與不干預(yù)的情況相比，即不使 用凋亡促進劑的情況相比，所述惡性血液腫瘤細胞的凋亡數(shù)至少增加30%，例如至少增加 40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、400%、600%。
[0060] 在本發(fā)明中，所述下調(diào)體外/體內(nèi)細胞中SENPl蛋白的表達是指與不干預(yù)的情況 相比，降低SENPl蛋白表達量的至少30%，例如至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或者 99%。
[0061] 在本發(fā)明中，所述的其它藥物是指能夠用于預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的藥物。在 本發(fā)明的實施方案中，所述其它藥物是指伊馬替尼。
[0062] 在本發(fā)明的實施方案中，通過將SENPl蛋白的抑制劑與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用，可以 增強對惡性血液腫瘤的預(yù)防或治療效果，或者用于在對其它藥物產(chǎn)生耐藥的惡性血液腫瘤 中增強預(yù)防或治療效果。
[0063] 本發(fā)明通過實驗證實了 SENPl蛋白的抑制劑可以抑制惡性血液腫瘤細胞的增殖 并促進凋亡，表明SENPl蛋白可以作為惡性血液腫瘤治療的靶點。在本發(fā)明的具體實施方 案中，shRNA可以通過RNA干擾機制有效抑制SENPl蛋白的表達，進而抑制惡性血液腫瘤細 胞的增殖并促進凋亡，表明SENPl蛋白的抑制劑可以作為藥物用于預(yù)防或治療惡性血液腫 瘤。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0064] 圖1為SENPl在CML的表達檢測，其中A為CML患者和供者的骨髓⑶34+細胞中 SENPlmRNA的表達，B為兩例CML⑶34+細胞的干、組細胞中SENPlmRNA的表達，橫坐標為各 細胞或細胞系，縱坐標為SENPl較內(nèi)參β -actin的相對表達量，C為CML患者和供者的骨 髓⑶34+細胞中SENPl蛋白的表達。
[0065] 圖2為SENPl-GFP-shRNA干涉載體的電泳鑒定結(jié)果。
[0066] 圖3為SENPl-GFP-shRNA干涉載體轉(zhuǎn)入293細胞后熒光顯微鏡的鑒定結(jié)果。
[0067] 圖4為SENPl-GFP-shRNA干涉載體中小發(fā)卡序列的測序結(jié)果。
[0068] 圖5為SENPl-GFP-shRNA干涉載體能夠在mRNA水平和蛋白水平降低SENPl的表 達，其中左圖中的縱坐標為mRNA水平降低的倍數(shù)。
[0069] 圖6為SENPl-GFP-shRNA感染K562細胞熒光顯微鏡結(jié)果。
[0070] 圖7為SENPl-GFP-shRNA對K562細胞中SENPl的mRNA表達的抑制作用，其中縱 坐標為mRNA水平降低的倍數(shù)。
[0071] 圖8為SENPl-GFP-shRNA對K562細胞增殖的抑制作用，其中縱坐標為細胞增殖的 倍數(shù)。
[0072] 圖9為SENPl-GFP-shRNA對K562細胞凋亡的影響。
[0073] 圖10為SENPl-GFP-shRNA感染KCL22細胞的熒光顯微鏡結(jié)果。
[0074] 圖11為SENPl-GFP-shRNA對KCL22細胞中SENPl的mRNA表達的抑制作用，其中 縱坐標為mRNA水平降低的倍數(shù)。
[0075] 圖12為SENPl-GFP-shRNA對KCL22細胞增殖的抑制作用，其中縱坐標為細胞增殖 的倍數(shù)。
[0076] 圖13為SENPl-GFP-shRNA對KCL22細胞凋亡的影響。
[0077] 圖14為SENPl-GFP-shRNA對CML患者和健康捐獻者骨髓⑶34+細胞凋亡的影響， 左圖為CML患者，右圖為健康捐獻者，其中縱坐標為Annexin V陽性細胞的比率。
[0078] 圖15為SENPI-GFP-shRNA對CML患者⑶34+細胞紅系分化的影響，其中左圖的縱 坐標為CD235a陽性紅系細胞比率；右圖是流式細胞儀檢測的一個代表圖。
[0079] 圖16為SENPl-GFP-shRNA對CML患者和健康捐獻者骨髓⑶34+細胞增殖的影響， 其中縱坐標為對照組與SENPl-shRNA組細胞數(shù)目倍數(shù)比。
[0080] 圖17為SENPl-GFP-shRNA對耐藥細胞的抑制作用，其中A為T315I-GFP逆轉(zhuǎn) 錄病毒感染TF-I細胞系的熒光檢測結(jié)果，B為流式細胞儀檢測GFP的表達效率，C為 SENPl-GFP-shRNA相對于對照病毒使TF-1-T315I細胞凋亡增加，其中C的縱坐標為存活細 胞數(shù)比率。
[0081] 圖18為SENPl在麗細胞的表達及作用，其中A為麗細胞系高表達SENPl，縱坐標 為SENPl較內(nèi)參β -actin的相對表達量，B為SENPl-GFP-shRNA對麗細胞凋亡的影響，縱 坐標為存活細胞數(shù)比率，C為SENPl-GFP-shRNA對MM細胞增殖的影響，縱坐標為細胞增殖 倍比。

【具體實施方式】
[0082] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0083] 實施例I : SENPl在CML的表達檢測。
[0084] 發(fā)明人分別對8例CML患者和供者（donor)的骨髓細胞進行了磁珠分選，獲得 ⑶34+細胞，通過實時定量PCR檢測SENPlmRNA的表達，發(fā)現(xiàn)CML患者的SENPl表達高于 donor (圖1-A)。取其中兩例CML CD34+細胞進行了干、祖細胞的分選，得到髓系祖細胞 (CMP)、粒單核細胞系祖細胞（GMP)，紅系巨核系祖細胞（MEP)和造血干細胞（HSC)，之后 進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)HSC組分的SENPl表達水平最高（圖1-B)。各取兩例樣本的蛋白進行 western blot分析，發(fā)現(xiàn)SENPl的蛋白在CML⑶34+細胞比donor⑶34+細胞的表達要高 (圖 1-C)。
[0085] 實施例2 :降低SENPl基因表達的shRNA (short hairpin RNA，小發(fā)夾RNA)干涉 載體的構(gòu)建及鑒定。
[0086] 從sigma公司購買SENPl干涉載體套裝1套（含5個）（SHCLNG，NM-014554， 其中包括 TRCN0000004395、TRCN0000004396、TRCN0000004397、TRCN0000004398、 TRCN0000004399)，利用lipofectin2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入工程細胞株HEK293細胞，提取總 RNA，之后利用RT-qPCR檢測獲得干涉效率最高的載體，具體過程為：以反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為 模板，qPCR(定量PCR)檢測SENPl基因的表達，以β -actin做內(nèi)參；其中以干涉載體的空載 體作對照，2-Λ Λ CT為干涉后的SENPl的表達。該干涉效率最高的載體中的小發(fā)卡序列為： 5'CCGGGCGCCAGAUUGAAGAACAGAACUCGAGUUCUGUUCUUC AAUCUGGCGCUUUUU3' （SEQ ID Ν0:1)， 其針對的靶序列為人 SNEPlmRNA 的第 1396-1416 位，即 5'GCGCCAGAUUGAAGAACAGAA3'（SEQ ID NO :2)，其轉(zhuǎn)錄生成的 DNA 寡核苷酸鏈為 5'CCGGGCGCCAGATTGAAGAACAGAACTCGAGTTCTGTT CTT CAATCTGGCGCTTTTT3'（SEQ ID N0:3)，該shRNA可剪切形成siRNA正義鏈和反義鏈，正義 鏈為 5'GCGCCAGAUUGAAGAACAGAA3'（SEQ ID NO :4)，反義鏈為 5'UUCUGUUCUUCAAUCUGGCGC3' (SEQ ID NO ：5)〇
[0087] 由于此載體無標識蛋白GFP，故將此載體中含有目的干涉序列的片段構(gòu)建到含有 GFP標志的慢病毒表達載體PPIG-u6_scramble中。該PPIG-u6_scramble載體的構(gòu)建是在 商業(yè)化載體pLKO. 1載體(購自Addgene公司）的基礎(chǔ)上進行kpnl單酶切，之后將MigRl載 體(購自Addgene公司）中的"IRES-GFP"片段平端連接上去，鑒定連接正確。將目的干涉序 列與PPIG-u6-scramble連接后，首先利用雙酶切進行鑒定，如圖2所示，4號克隆有可能正 確，將其送Invitrogen公司測序，內(nèi)含有完全正確的干涉小發(fā)卡序列（圖4);同時將該質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入293細胞，24h后在熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光出現(xiàn)（圖3)。之后進行qPCR檢測和 Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)在mRNA水平和蛋白水平（圖5)都能有效降低人SENPl的表達。這 證明此干涉載體構(gòu)建成功，載體命名為SENPl-GFP-shRNA。
[0088] 實施例3 :含人SENPl-shRNA的慢病毒的制備及SENPl-GFP-shRNA對K562細胞的 抑制作用。
[0089] 降低SENPl基因表達的shRNA干涉載體的構(gòu)建成功后，進行慢病毒的制備及純化。 首先接種293T細胞4-4. 5 X IO6個于IOcm培養(yǎng)皿中。備次日待細胞鋪滿至80-85%，進行慢 病毒質(zhì)粒SENPl-GFP-shRNA轉(zhuǎn)染。用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞，具體 步驟為：pMD2G :3 μ g，pSAX2 :9 μ g (載體購自Addgene公司），目的質(zhì)粒(干涉載體）：12 μ g。 三種質(zhì)?；靹?。加入63 μ 12. OM的CaCL2，用0. I XTE補齊至500 μ 1，混勻。將上述液體 緩慢滴入500 μ 12 X HBS中，邊加邊混勻。液體混勻后呈渾濁狀態(tài)，室溫靜置25-30min。將 Iml混合液緩慢滴入1個培養(yǎng)皿中。6-7小時后，檢查細胞狀態(tài)，輕輕將培養(yǎng)皿中液體換為 6ml DMEM+10%胎牛血清新鮮培養(yǎng)液(液體預(yù)熱至37°C )并加入36 μ 1 丁酸鈉。換液后分別 在24h、36h和48h，收集上清液暫儲于4°C，并換6ml新鮮培養(yǎng)液+36 μ 1 丁酸鈉。最后一次 將所有收集液體離心：3500rpm，15min，4°C，棄沉淀。上清與PEG20000以4 :1混勻，4°C過 夜。3000印111，301^11，41：，離心，棄上清。將沉淀重懸至合適體積頂01培養(yǎng)基中（冰上操作)， 進行病毒滴度測定。病毒液分裝后_80°C保存，命名為慢病毒SENPl-GFP-shRNA。慢病毒滴 度測定：接種HT1080細胞2X 105/2ml于六孔板中。備次日進行慢病毒感染。將純化后病 毒或原液按1 μ 1/孔、5 μ 1/孔或100 μ 1/孔、500 μ 1/孔感染于各孔HT1080細胞。同時加 polybrene，4 μ 1/孔。在此過程中，要取一孔未加病毒的細胞進行記數(shù)(一般細胞會增殖至 4Χ IO5/孔）；計數(shù)后，可將剩余細胞繼續(xù)放入孔內(nèi)用作空白對照細胞。感染病毒48h后，消 化細胞并用PBS洗1遍后進行流式檢測（GFP)。在病毒感染期間可以在熒光顯微鏡下觀察 熒光表達情況。根據(jù)細胞數(shù)和GFP流式檢測結(jié)果，計算病毒滴度。滴度（titer unit/ml) = [_ln(未感染細胞比率）X每孔細胞數(shù)]/滴加病毒（ml)。
[0090] 慢病毒SENPl-GFP-shRNA感染K562細胞及其作用研究
[0091] 接種K562細胞(人紅白血病細胞）4X105于六孔板中。按20M0I滴加慢病毒 SENPl-GFP-shRNA及對照病毒（即轉(zhuǎn)染有空載體PPIG-u6-scramble的慢病毒，下同），同時 加 polybreneSyg/ml。48h后傳代。熒光顯微鏡觀察綠色熒光（圖6)，病毒感染效率較高。 用TRIZOL提取總RNA，之后進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ;用ABI fast7500PCR儀檢測SENPl的 mRNA的表達，干涉效率可達到70%(圖7)。利用CCK-8細胞增殖試劑盒（日本同仁化學(xué)研究 所）檢測病毒感染過的這些細胞，發(fā)現(xiàn)SENPl-GFP-shRNA使K562細胞增殖率明顯降低（圖 8)。利用ANNEXIN V-APC，PI凋亡試劑盒(美國eBioscience公司）進行細胞凋亡性能的檢 測，發(fā)現(xiàn)SENPl-GFP-shRNA使K562細胞凋亡增加（圖9)。
[0092] 實施例4 :SENPl-GFP-shRNA對KCL22細胞的抑制作用。
[0093] 與實施例3的方法相似，接種KCL22細胞(人髓系白血病細胞）4X IO5于六孔板 中。按20M0I滴加慢病毒及對照病毒，同時加 polybrene8y g/ml。8h后補加新鮮培養(yǎng)液， 48h后細胞傳代。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光（圖10)，顯示病毒感染效率較高，不用進行流 式細胞儀分選。用TRIZOL試劑提取細胞總RNA，核算定量后進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ;同樣 用ABI fast7500PCR儀進行實時定量PCR檢測SENPl的mRNA的表達，干涉效率可達到70% (圖11)。利用這些細胞進行CCK-8細胞增殖檢測，發(fā)現(xiàn)SENPl-GFP-shRNA使KCL22細胞增 殖能力降低（圖12)。利用ANNEXIN V-APC，PI凋亡試劑盒進行細胞凋亡性能的檢測，發(fā)現(xiàn) SENPl-GFP-shRNA 使 KCL22 細胞凋亡增加（圖 13)。
[0094] 實施例5 :SENPl-GFP-shRNA對CML原代細胞的抑制作用。
[0095] 各從3例CML患者及3例健康捐獻者骨髓取得單個核細胞后利用磁珠分選獲得 ⑶34陽性細胞。利用20M0I的SENPl-GFP-shRNA慢病毒重復(fù)感染⑶34陽性細胞2次， 之后進行流式細胞儀分選，獲得GFP、CD34雙陽細胞。利用這些細胞進行細胞凋亡、增 殖及分化特性的檢測。使用ANNEXIN V-APC，PI凋亡試劑盒進行細胞凋亡性能檢測，發(fā) 現(xiàn)SENPI-GFP-shRNA可以使CML患者⑶34+細胞的凋亡性能明顯增強，即有促進凋亡作 用（圖14左）；而對健康捐獻者骨髓CD34陽性細胞的凋亡性能沒有作用（圖14右)。這為 SENPl-shRNA成藥奠定了很好的基礎(chǔ)。在GEMM培養(yǎng)體系中培養(yǎng)GFP、CD34雙陽細胞，分別 于實驗第3天和第6天利用多色流式分析儀進行細胞分化指標檢測(其中CD33為髓系指 標，⑶14為單核系指標，⑶Ilb為粒系指標，⑶235a為紅系指標)，發(fā)現(xiàn)SENPl-GFP-shRNA明 顯抑制CML⑶34+細胞的紅系分化（圖15)。同時在實驗第3、6、9天分別計數(shù)細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn) SENPl-GFP-shRNA能明顯抑制CML CD34+細胞的增殖，而對健康捐獻者骨髓CD34+細胞的作 用與對照比較沒有差異（圖16)。
[0096] 實施例6 :SENPl-GFP-shRNA對耐藥細胞的抑制作用。
[0097] 利用T315I-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒(美國洛杉磯醫(yī)學(xué)中心惠贈）感染TF-I細胞系，熒光 顯微鏡下觀察綠色熒光表達，顯示感染效率較高（圖17-A)。流式細胞儀檢測GFP表達效率 達到94. 4% (圖17-B)。T315I賦予了 TF-I細胞對伊馬替尼（Imatinib)等藥物的耐藥性， 而SENPl-GFP-shRNA相對于對照病毒使TF-1-T315I細胞凋亡特性大大增強（圖17-C)，這為 SENPl-GFP-shRNA的成藥也奠定了很好的基礎(chǔ)。
[0098] 實施例7 :SENPl在麗的表達及作用。
[0099] 發(fā)明人分別對供者（donor)的骨髓單個核細胞（MNC)和⑶34+細胞及麗細胞系 XG-7、RPMI8226、SK0-007細胞，通過實時定量PCR檢測SENPImRNA的表達，發(fā)現(xiàn)MM細胞系高 表達SENPl(圖18-A)。利用慢病毒SENPl-GFP-shRNA和對照病毒，在細胞系XG-7、RPMI8226 細胞上進行了細胞凋亡和增殖的實驗，結(jié)果表明SENPl-shRNA具有促進細胞凋亡（圖18-B) 和抑制細胞增殖的作用（圖18-C)。
[0100] 盡管本發(fā)明的【具體實施方式】已經(jīng)得到詳細的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【權(quán)利要求】
1. SENP1蛋白的抑制劑或者SENP1蛋白的抑制劑與其它藥物的聯(lián)合應(yīng)用用于制備預(yù)防 或治療惡性血液腫瘤的藥物中的用途，或者用于在體外/體內(nèi)抑制惡性血液腫瘤細胞的增 殖和/或促進惡性血液腫瘤細胞凋亡的用途，或者用于制備抑制惡性血液腫瘤細胞的增殖 和/或促進惡性血液腫瘤細胞凋亡的藥物中的用途。
2. 權(quán)利要求1的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制劑是指能夠抑制SENP1蛋白發(fā)揮 功能的物質(zhì)，例如為能夠抑制SENP1基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾的核酸、 蛋白或化合物，或者為能夠和SENP1蛋白結(jié)合、進而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化 合物，，例如為shRNA，例如為如SEQ ID NO :1所示的shRNA。
3. 權(quán)利要求2的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制劑為包含所述shRNA的重組載體。
4. 權(quán)利要求3的用途，其中所述的SENP1蛋白的抑制劑為包含所述重組載體的重組宿 主細胞。
5. 權(quán)利要求1-4任一項的用途，其中所述的惡性血液腫瘤選自慢性髓性白血病、多發(fā) 性骨髓瘤、惡性淋巴瘤。 6. ShRNA用于下調(diào)體外/體內(nèi)細胞中SENP1蛋白的表達的用途，優(yōu)選地，所述shRNA為 如 SEQ ID NO :1 所示的 shRNA。 7. ShRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
8. 重組載體，其含有權(quán)利要求7的shRNA。
9. 重組宿主細胞，其含有權(quán)利要求8的重組載體。
10. 篩選用于預(yù)防或治療惡性血液腫瘤的藥物的方法，其包括篩選SENP1蛋白的抑制 劑的步驟； 優(yōu)選地，所述SENP1蛋白的抑制劑是指能夠抑制SENP1蛋白發(fā)揮功能的物質(zhì)，例如為能 夠抑制SENP1基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾的核酸、蛋白或化合物，或者為 能夠和SENP1蛋白結(jié)合、進而抑制SENP1蛋白活性的核酸、蛋白或化合物，例如為shRNA，例 如為如SEQ ID NO :1所示的shRNA ; 優(yōu)選地，所述惡性血液腫瘤選自慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤。
【文檔編號】A61P35/02GK104436196SQ201310434973
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】王立生, 孫慧燕, 吳祖澤, 肖鳳君, 王 華, 楊月峰 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所