殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球及其制備方法，通過微囊成型裝置，以殼聚糖為有機(jī)基質(zhì)，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體；利用殼聚糖中的羥基和氨基基團(tuán)對(duì)羥基磷灰石的原位結(jié)晶誘導(dǎo)作用，調(diào)控?zé)o機(jī)礦物在有機(jī)基質(zhì)上原位非均勻成核結(jié)晶；同時(shí)復(fù)合了對(duì)成骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和分化作用的傳統(tǒng)中藥-淫羊藿苷，原位仿生制備殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球。該復(fù)合微球是一種骨填充材料，制備過程簡(jiǎn)易，方法溫和，材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，很有希望作為骨組織缺損用修復(fù)材料在臨床上得到廣泛應(yīng)用。
【專利說明】殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，隨著生態(tài)環(huán)境的惡化，骨病損患者人數(shù)顯著增多。通常骨組織的修復(fù)方法有:自體骨移植修復(fù)，異體骨移植修復(fù)和金屬合金、高分子聚合物等各種人工骨替代材料移植修復(fù)。自體骨是骨缺損修復(fù)的最佳種植體，然其供應(yīng)來(lái)源有限，異體、異種骨存在免疫排斥反應(yīng)和較高的制樣及處理成本；應(yīng)用最廣泛的金屬材料，雖具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，然而其成分和自然骨差異甚遠(yuǎn)，金屬材料與宿主骨不能發(fā)生化學(xué)鍵合作用，生理環(huán)境長(zhǎng)期對(duì)金屬材料的腐蝕會(huì)造成金屬離子向周圍組織擴(kuò)散，對(duì)人體造成毒副作用。
[0003]隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，骨缺損修復(fù)研究開始往骨材料的成分和結(jié)構(gòu)仿生方面發(fā)展。仿生合成技術(shù)模仿有機(jī)物調(diào)控?zé)o機(jī)物形成的機(jī)理，合成過程中先形成有機(jī)物的自組裝體，使無(wú)機(jī)先驅(qū)物于自組裝聚集體和溶液的相界面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在自組裝體的模板作用下，形成具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的無(wú)機(jī)-有機(jī)復(fù)合體。人體骨由有機(jī)基質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽構(gòu)成，膠原蛋白、蛋白多糖是其主要的有機(jī)基質(zhì)組分；無(wú)機(jī)鹽則主要是低結(jié)晶度的納米羥基磷灰石。而人工合成的羥基磷灰石其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與天然的類似，具有良好的骨傳導(dǎo)性，填入骨缺損部位后能為骨基質(zhì)的沉積和維持提供一個(gè)良好的骨床，引導(dǎo)周圍骨組織增生，加快成骨過程，促進(jìn)缺損骨的愈合，被視為骨缺損修復(fù)的理想材料。殼聚糖是一種有機(jī)大分子，溶于醋酸時(shí)帶正電荷，不與體液發(fā)生反應(yīng)并可被機(jī)體的溶菌酶生物降解，并能促進(jìn)傷口愈合和骨的形成，具有無(wú)免疫原性、無(wú)毒性等特性。近年來(lái)，已有多位學(xué)者將殼聚糖與納米羥基磷灰石復(fù)合制成多孔支架材料。文獻(xiàn)(Li J., Chen Y P., Yin Y, Yao E, Yao K.Modulationof nano—hydroxyapatite size via formation on chitosan—gelatin network filmin situ[J].Biomaterials 2007 ；28:78 1-790)采用原位復(fù)合的方法合成納米羥基磷灰石-殼聚糖-明膠復(fù)合材料，`結(jié)果表明，有機(jī)基質(zhì)能引導(dǎo)納米羥基磷灰石在膜材基體上原位結(jié)晶形成均勻分散的納米顆粒。文獻(xiàn)(Yang D., Jin Y, Zhou Y, et al.1n SituMineralization of Hydroxyapatite on Electrospun Chitosan—Based NanofibrousScaffolds [J].Macromol Biosci 2008 ;8:239-246)將殼聚糖、聚乙烯醇通過靜電紡絲的方法制備多孔支架，再把支架材料浸泡到含有PAA的氯化鈣和磷酸二氫鉀溶液中，實(shí)現(xiàn)了納米羥基磷灰石在有機(jī)基體上的原位結(jié)晶。體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)表明，該復(fù)合材料具有較好的生物相容性。這種原位復(fù)合的方法，可降低有機(jī)與無(wú)機(jī)界面的界面能，利用有機(jī)基質(zhì)上的氨基、羥基基團(tuán)，對(duì)納米羥基磷灰石的結(jié)晶起著電位互補(bǔ)、綁定和螯合作用，引導(dǎo)納米羥基磷灰石在有機(jī)基質(zhì)上原位結(jié)晶形成均勻分散的納米顆粒，克服了機(jī)械混合導(dǎo)致的納米羥基磷灰石聚集問題。
[0004]目前較多研究是將羥基磷灰石與殼聚糖復(fù)合做成塊狀支架材料，也有出現(xiàn)將二者機(jī)械混合做成微球形狀的文獻(xiàn)報(bào)道，但尚未有報(bào)道將二者通過原位復(fù)合的方法制備微球。有關(guān)研究表明，顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)能影響顆粒在人體內(nèi)的活性，形狀不規(guī)則的顆粒植材入人體會(huì)產(chǎn)生炎癥等不良反應(yīng)，因此，形狀較規(guī)則的球狀載藥顆粒是作為植入藥物載體的優(yōu)先選擇。淫羊藿苷為傳統(tǒng)中藥淫羊藿的莖葉提取物，研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可使成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線上移，S期細(xì)胞百分率升高，Gl期細(xì)胞百分率減少以及BMP-2蛋白表達(dá)量增加，從而促進(jìn)骨的再生。這里，我們采用原位復(fù)合的方法，仿生構(gòu)建殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球，利用納米羥基磷灰石的大比表面積和高表面活性裝載傳統(tǒng)中藥，以及殼聚糖對(duì)藥物的包埋功能起到緩釋藥物的作用，作為骨填充材料進(jìn)行局部定向釋藥，通過體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)評(píng)價(jià)體系初步探討其用于骨修復(fù)的可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球及其制備方法。該方法的制備工藝條件溫和，操作簡(jiǎn)捷，成本較低，制備得到的復(fù)合微球粒徑可控，性能優(yōu)越。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制備方法，是通過微囊成型裝置(裝置詳見專利CN00218100.2)，以殼聚糖為有機(jī)基質(zhì)，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體；利用殼聚糖中的羥基和氨基基團(tuán)對(duì)羥基磷灰石的原位結(jié)晶誘導(dǎo)作用，調(diào)控?zé)o機(jī)礦物在有機(jī)基質(zhì)上原位非均勻成核結(jié)晶；同時(shí)復(fù)合了對(duì)成骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和分化作用的傳統(tǒng)中藥-淫羊藿苷，原位仿生制備殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球。包括以下步驟:
(1)將殼聚糖溶解于乙酸溶液中，淫羊藿苷溶解于無(wú)水乙醇中；
(2)緩慢往殼聚糖的乙酸溶液中加入可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液，再加入淫羊藿苷的醇溶液，攪拌均勻；
(3)通過微囊成型裝置將步驟(2)的混合液滴入凝膠浴中成型；將成型的微球連同凝膠浴一并置于水浴鍋中反應(yīng)，然后用去離子水反復(fù)洗滌至中性，移至冰箱預(yù)冷凍，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，即制得殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球。
[0007]復(fù)合微球包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:
淫羊藿苷0.01~0.05%
殼聚糖1~3%
羥基磷灰石0.5~2%。
[0008]各步驟的工藝參數(shù)如下:步驟(1)中乙酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為I~2% ;步驟(2)中可溶性鈣鹽溶液的濃度為1.5~3mol/L，可溶性磷酸鹽溶液的濃度為0.6~1.8mol/L，二者間隔30min加入；淫羊藿苷的醇溶液的加入體積為2mL，攪拌時(shí)間為Ih ;步驟(3)中以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3~5%的NaOH溶液為凝膠?。凰囟葹?7°C，反應(yīng)時(shí)間為8~12h。
[0009]所述的可溶性鈣鹽是硝酸鈣、氯化鈣中的一種；可溶性磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉中的一種。
[0010]無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體中Ca/P的摩爾比為η (Ca2+): n (PO43O=L 67:1。
[0011]本發(fā)明的殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制備方法可以簡(jiǎn)單概括為以下幾個(gè)過程:(I)有機(jī)基質(zhì)與無(wú)機(jī)離子的界面識(shí)別，形成有效的成核位點(diǎn)；(2)藥物分子在有機(jī)基質(zhì)上的吸附；(3)復(fù)合微球的成型；(4)有機(jī)基質(zhì)調(diào)控?zé)o機(jī)離子原位成核結(jié)晶自組裝成納米粒；(5)復(fù)合微球的后處理。
[0012]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:殼聚糖是一種帶正電荷的天然多糖，不與體液發(fā)生反應(yīng)并可被機(jī)體的溶菌酶生物降解，并能促進(jìn)傷口愈合和骨的形成，具有無(wú)免疫原性、無(wú)毒性等特性。加入無(wú)機(jī)相前驅(qū)體可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽后，殼聚糖分子上的氨基、羥基能與無(wú)機(jī)鈣離子、磷酸根離子，通過離子配位、靜電吸引以及氫鍵相互結(jié)合，為后續(xù)無(wú)機(jī)晶體的定位生長(zhǎng)提供了有效的成核位點(diǎn)；最后，模仿骨組織形成過程中無(wú)機(jī)鈣磷礦物在有機(jī)基質(zhì)生物大分子調(diào)控下原位析晶過程，采用原位仿生法制備一種殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球。
[0013]相對(duì)于其他骨修復(fù)材料有以下優(yōu)點(diǎn):
(O復(fù)合微球中的各組分具有較好的生物相容性；
(2)采用原位仿生法和納米自組裝技術(shù)，使得無(wú)機(jī)相在微球上實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)分散；
(3)復(fù)合微球獨(dú)特的表面性能(比表面積大、表面能高、表面粗糙度及表面潤(rùn)濕性增加)有利于生長(zhǎng)因子的吸附，促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖、分化；
(4)通過改變電壓大小，可得到具有不同粒徑的復(fù)合微球；
(5)體外微球細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)結(jié)果表明，該復(fù)合材料具有良好的生物相容性；
(6)該復(fù)合微球的制備工藝較簡(jiǎn)單,操作方便,成本低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是殼聚糖-羥基磷灰石微球的局部SEM掃描電子顯微鏡圖。
`[0015]圖2是殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的局部SEM掃描電子顯微鏡圖。
[0016]圖3是殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的SEM掃描電子顯微鏡圖。
[0017]圖4是殼殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的XRD圖。
[0018]圖5-6是殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)第
3、5天倒置熒光顯微鏡圖片。
[0019]圖7是殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)的Hoechst33258熒光染色圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1
1)配制1.5mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為2%、0.01% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于無(wú)水乙醇中；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌2 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為1% ；
4)將淫羊藿苷醇溶液緩慢地加入上述溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
5)將上述混合液通過微囊成型裝置，滴入3%NaOH的水溶液中成型，連同凝膠浴一起置入37°C水浴鍋中8h，進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_20°C預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0021]實(shí)施例2
1)配制2mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.2mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為1%、0.03% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于無(wú)水乙醇中；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌3 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為0.5%。
[0022]4)將淫羊藿苷醇溶液緩慢地加入上述溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
5)將上述混合液通過微囊成型裝置，滴入3% NaOH的水溶液中成型，連同凝膠浴一起置入37°C水浴鍋中10h，進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-20°C預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0023]實(shí)施例3
1)配制3mol/L的可溶性鈣鹽溶液，0.6mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為2%、0.05% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于無(wú)水乙醇中；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，`持續(xù)攪拌4 h,理論形成HAP的質(zhì)量配比為0.8% ；
4)將淫羊藿苷醇溶液緩慢地加入上述溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
5)將上述混合液通過微囊成型裝置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，連同凝膠浴一起置入37°C水浴鍋中8h，進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_20°C預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0024]實(shí)施例4
1)配制2mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.5mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為1%、0.05% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于無(wú)水乙醇中；；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌3 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為0.5% ；
4)將淫羊藿苷醇溶液緩慢地加入上述溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
5)將上述混合液通過微囊成型裝置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，連同凝膠浴一起置入37°C水浴鍋中12h，進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-20°C預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0025]實(shí)施例5
1)配制3mol/L的可溶性鈣鹽溶液，0.9mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為3%、0.01% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于無(wú)水乙醇中；；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌4 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為2% ；
4)將淫羊藿苷醇溶液緩慢地加入上述溶液中，攪拌使其充分混合均勻；5)將上述混合液通過微囊成型裝置，滴入4% NaOH的水溶液中成型，連同凝膠浴一起置入37°C水浴鍋中8h，進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_20°C預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0026]實(shí)施例6
1)配制2mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為3%、0.03% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于無(wú)水乙醇中；；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌3.5 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為1.5% ；
4)將淫羊藿苷醇溶液緩慢地加入上述溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
5)將上述混合液通過微囊成型裝置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，連同凝膠浴一起置入37°C水浴鍋中9h，進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_20°C預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0027]實(shí)施例7
1)配制2.5mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.2mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為2%、0.05% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于無(wú)水乙醇中；；` 3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌6 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為1% ；
4)將淫羊藿苷醇溶液緩慢地加入上述溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
5)將上述混合液通過微囊成型裝置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，連同凝膠浴一起置入37°C水浴鍋中10h，進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-20°C預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0028]實(shí)施例8
1)配制3mol/L的可溶性鈣鹽溶液，0.6mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、淫羊藿苷的含量分別為2%、0.04% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的淫羊藿苷溶于無(wú)水乙醇中；；
3)按照η(Ca2+):n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌5 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為1.2% ；
4)將淫羊藿苷醇溶液緩慢地加入上述溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
5)將上述混合液通過微囊成型裝置，滴入4%NaOH的水溶液中成型，連同凝膠浴一起置入37°C水浴鍋中12h，進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-20°C預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0029]將所制備的一系列微球進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性能表征，并采用乳鼠成骨細(xì)胞建立復(fù)合支架的體外評(píng)價(jià)模型，考察殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的細(xì)胞學(xué)特性。
[0030]結(jié)論:比較圖1與圖2，可以發(fā)現(xiàn)殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球除了短棒狀的納米羥基磷灰石外還有一些顆粒聚集成小堆狀，可能是由于少量的淫羊藿苷晶體沉積在微球表面造成的。圖3可看出微球形貌比較圓整；圖4可以發(fā)現(xiàn)，(002)，(211)和(300)晶面的衍射峰為羥基磷灰石的主要衍射峰，說明復(fù)合微球中原位生成了納米羥基磷灰石。從圖5，6中可以看出，細(xì)胞在微球上長(zhǎng)勢(shì)良好。復(fù)合微球在加入細(xì)胞懸液數(shù)天后，細(xì)胞長(zhǎng)滿孔板底部并開始向微球攀爬生長(zhǎng)，隨著天數(shù)的增加，微球外層逐漸被成骨細(xì)胞包裹，微球表面上的細(xì)胞呈梭形、三角形或多角形，有偽足伸出，輪廓清晰，細(xì)胞胞質(zhì)透明，表明在微球-細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)過程中，細(xì)胞保持著良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。圖7為微球上的活細(xì)胞在波長(zhǎng)為46Inm處發(fā)出藍(lán)靛色熒光圖像。藍(lán)靛色圓點(diǎn)即細(xì)胞，從圖中可以看出，細(xì)胞在微球上長(zhǎng)勢(shì)良好。這些結(jié)果都表明了原位復(fù)合制備的復(fù)合微球具有良好的生物相容性，具有作為骨填充材料進(jìn)行局部定向釋藥的潛力。
[0031]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范`圍。
【權(quán)利要求】
1.一種殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制備方法，其特征在于:通過微囊成型裝置，以殼聚糖為有機(jī)基質(zhì)，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體；利用殼聚糖中的羥基和氨基基團(tuán)對(duì)羥基磷灰石的原位結(jié)晶誘導(dǎo)作用，調(diào)控?zé)o機(jī)礦物在有機(jī)基質(zhì)上原位非均勻成核結(jié)晶；同時(shí)復(fù)合了對(duì)成骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和分化作用的傳統(tǒng)中藥-淫羊藿苷，原位仿生制備殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將殼聚糖溶解于乙酸溶液中，淫羊藿苷溶解于無(wú)水乙醇中； (2)緩慢往殼聚糖的乙酸溶液中加入可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液，再加入淫羊藿苷的醇溶液，攪拌均勻； (3)通過微囊成型裝置將步驟(2)的混合液滴入凝膠浴中成型；將成型的微球連同凝膠浴一并置于水浴鍋中反應(yīng)，然后用去離子水反復(fù)洗滌至中性，移至冰箱預(yù)冷凍，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，即制得殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制備方法，其特征在于:復(fù)合微球包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分: 淫羊藿苷0.01~0.05%殼聚糖I~3% 羥基磷灰石0.5~2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制備方法，其特征在于:各步驟的工藝參數(shù)如下: 步驟(1)中乙酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為I~2% ； 步驟(2)中可溶性鈣鹽溶液的濃度為1.5~3!1101/1，可溶性磷酸鹽溶液的濃度為0.6~1.8mol/L，二者間隔30min加入；淫羊藿苷的醇溶液的加入體積為2mL，攪拌時(shí)間為Ih ； 步驟(3)中以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3~5%的NaOH溶液為凝膠?。凰囟葹?7°C，反應(yīng)時(shí)間為8 ~12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制備方法，其特征在于:所述的可溶性鈣鹽是硝酸鈣、氯化鈣中的一種；可溶性磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球的制備方法，其特征在于:無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體中Ca/P的摩爾比為n (Ca2+): η (PO廣)=1.67:1。
7.—種如權(quán)利要求1所述的方法制得的殼聚糖-羥基磷灰石原位負(fù)載淫羊藿苷復(fù)合微球。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK103495210SQ201310442025
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】陳景帝, 張惠, 張玉玨, 王自豪, 張其清 申請(qǐng)人:福州大學(xué)