一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗及其制備方法，包括禽流感病毒的培養(yǎng)、病毒滅活、病毒濃縮及疫苗乳化等步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明采用了本土分離的禽流感病毒，利用MDCK細(xì)胞取代雞胚組織繁殖病毒，降低了疫苗生產(chǎn)成本，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定，顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量；本發(fā)明利用均質(zhì)機(jī)對(duì)疫苗進(jìn)行乳化，制備的疫苗為水包油包水型，相對(duì)于傳統(tǒng)的油包水劑型而言該疫苗粘度低，粒度小，易吸收；本發(fā)明選用的佐劑在疫苗制備過(guò)程中無(wú)需額外添加任何表面活性劑成分，制備的疫苗安全性好，避免了傳統(tǒng)油佐劑難以吸收造成的副作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸用疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]禽流感(Avian Influenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一種禽類(lèi)烈性傳染病，被國(guó)際獸疫局定為I類(lèi)傳染病。根據(jù)其血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA的抗原性將禽流感病毒分成不同亞型，包括17種特異的HA亞型和9種特異的NA亞型，兩者的不同組合形成不同亞型禽流感病毒。根據(jù)毒株致病性的不同，禽流感可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感兩大類(lèi)。H9亞型禽流感屬于低致病性禽流感，產(chǎn)蛋家禽感染后，可引起產(chǎn)蛋率下降，軟殼蛋、無(wú)殼蛋增多，嚴(yán)重的將會(huì)停止產(chǎn)蛋。種禽感染后，除上述癥狀外，還表現(xiàn)出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雛禽出殼困難，出殼后的雛禽弱雛增多。雛禽在一周內(nèi)死亡率較高，且易感染大腸桿菌，治療較困難。H9亞型禽流感混合感染其他病原時(shí)，可導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率的大幅度提高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。近年來(lái)，H9亞型禽流感病毒感染人的病例也時(shí)有發(fā)生，因此它也是不容忽視的人獸共患病病原。
[0003]疫苗接種是預(yù)防和控制流感病毒流行的最有效手段，但由于甲型流感病毒的HA 和NA具有高度的變異性，只有當(dāng)疫苗株和流行株匹配時(shí)，疫苗才能起到有效的保護(hù)作用。 目前，控制禽流感病毒發(fā)病的主要手段是接種滅活全病毒疫苗，其生產(chǎn)依靠雞胚法實(shí)現(xiàn)，生產(chǎn)成本高，并且具有生物安全隱患；滅活疫苗多為油包水型，注射時(shí)阻力大，不易吸收，抗體產(chǎn)生慢。因此有必要開(kāi)發(fā)一種依賴(lài)于細(xì)胞系，劑型更合理，更易吸收，同時(shí)具有更好的免疫應(yīng)答效應(yīng)的疫苗產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗及其制備方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗及其制備方法，包括以下步驟:
[0007]I)制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)`:取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)良好的MDCK細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5X105/mL-5X106/mL的細(xì)胞密度接種于含有 8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)過(guò)夜；
[0008]2)細(xì)胞的培養(yǎng)與收獲:當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)基單層時(shí)，按種毒接種量為0.01-0.5M0I 接種病毒含量> 106_ 5TCID5ciAiL的HP株H9亞型禽流感病毒，控制溫度在37 °C繼續(xù)搖瓶培養(yǎng) 48-96小時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，得到含上清液的細(xì)胞毒液；
[0009]3)病毒的滅活:將步驟2)得到的含上清液的細(xì)胞毒液置于滅菌容器內(nèi)，根據(jù)病毒液體積加入甲醛溶液并調(diào)整甲醛終濃度至0.5-2%。(v/v)，充分搖勻毒液，以180r/min轉(zhuǎn)速，室溫條件下(20-25°C)滅活12-48小時(shí)；[0010]4)疫苗的制備:將滅活的病毒液以3500r/min離心20min，再經(jīng)8層紗布過(guò)濾， 棄去沉淀，將濾過(guò)液用截留分子量為300KD的Millipore膜包進(jìn)行2~3倍濃縮，濃縮后的病毒液即為水相，使用前置于28~32°C水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱；取法國(guó)賽比克公司的 montanide?i SA206VG型佐劑，充分混勻后置于28-32°c水浴鍋中預(yù)熱至水浴鍋溫度，即為油相；將上述預(yù)熱后的水相和油相按1:0.8-1:1.2 (w/w)比例混合，利用磁力攪拌裝置進(jìn)行預(yù)混合1-2h，然后采用ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司的AHlOOD型均質(zhì)機(jī)調(diào)整二級(jí)閥壓力為 20-30bar、一級(jí)閥壓力為400_500bar對(duì)該混合物乳化2_3次，即得到一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗。
[0011]上述方法中，步驟I)所述的細(xì)胞接種量?jī)?yōu)選為8X 105/mL ;步驟2)所述的病毒接種量?jī)?yōu)選為0.1MOI ;步驟3)所述的甲醛終濃度優(yōu)選為1%。;步驟3)所述的滅活溫度為20°C， 滅活時(shí)間為20h ;步驟4)所述的水相預(yù)熱溫度優(yōu)選為31°C;步驟4)所述的油相預(yù)熱溫度優(yōu)選為31°C;步驟4)所述的水相與油相比例優(yōu)選為1:1 ;步驟4)所述的均質(zhì)機(jī)參數(shù)優(yōu)選為二級(jí)閥壓力25bar、一級(jí)閥壓力400bar ;步驟4)所述的乳化次數(shù)優(yōu)選為3次。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為疫苗接種后產(chǎn)生抗體水平對(duì)比圖
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
[0014]1.1病毒的培養(yǎng)、收獲
[0015]取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)良好的MDCK細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按8 X 105/mL的細(xì)胞密度接種于含有8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)過(guò)夜；當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)基單層時(shí)，按種毒接種量為0.1MOI接種病毒含量≤106_5TCID5tZmL的HP株H9亞型禽流感病毒，控制溫度在37°C繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)48-96小時(shí)， 收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，得到含上清液的細(xì)胞毒液；
[0016]1.2病毒的滅活
[0017]將以上得到的含上清液的細(xì)胞毒液置于滅菌容器內(nèi)，根據(jù)病毒液體積加入甲醛溶液并調(diào)整甲醛終濃度至1%。(w/v)，充分搖勻毒液 ，在搖床上調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，于 20°C條件下滅活20小時(shí)；
[0018]1.3疫苗的制備
[0019]將滅活的病毒液以3500r/min離心20min，再經(jīng)8層紗布過(guò)濾，棄去沉淀，將濾過(guò)液用截留分子量為300KD的Millipore膜包進(jìn)行2倍濃縮，濃縮后的病毒液即為水相，使用前置于3i°c水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱；取法國(guó)賽比克公司的montanide?iSA206VG型佐劑，充分混勻后置于3rc水浴鍋中預(yù)熱至水浴鍋溫度，即為油相；將上述預(yù)熱后的水相和油相按1:Uw/ W)比例混合，利用磁力攪拌裝置進(jìn)行預(yù)混合lh，然后采用ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司的AH100D 型均質(zhì)機(jī)調(diào)整二級(jí)閥壓力為25bar、一級(jí)閥壓力為400bar對(duì)該混合物乳化3次，即得到一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗。
[0020]1.4禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗的質(zhì)量檢測(cè)
[0021]取上述制得的禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗，進(jìn)行如下檢測(cè):[0022]1.4.1外觀檢測(cè)
[0023]通過(guò)肉眼觀察發(fā)現(xiàn)疫苗為乳白色乳劑，合格。
[0024]1.4.2劑型檢測(cè)
[0025]取一清潔吸管，吸取少許疫苗滴于清潔冷水表面，液滴呈云霧狀擴(kuò)散，合格。
[0026]1.4.3離心穩(wěn)定性檢測(cè)
[0027]取IOmL疫苗,3000r/min離心15min,不分層,無(wú)水相析出，合格。
[0028]1.4.4粘度檢驗(yàn)
[0029]用ImL吸管(下口的內(nèi)徑1.2mm，上口內(nèi)徑2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其垂直自然流出，流出0.4mL所需的時(shí)間為4秒。同時(shí)采用Brookf ieldDVI粘度計(jì)檢測(cè)，該劑型疫苗粘度為27mPa.s，合格。
[0030]1.4.5粒徑檢測(cè)
[0031]用移液槍精確取乳液IOuL于測(cè)試杯中，加入290uL磷酸鹽緩沖液充分混勻，確保乳化顆粒良好分散，將測(cè)試杯放入Bettersize公司BT-9300H激光粒度分析儀中測(cè)定,測(cè)定溫度設(shè)定為25°C，平均粒徑為300nm，合格。
[0032]1.5禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗安全檢驗(yàn)
[0033]取上述制得的禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗，進(jìn)行如下檢驗(yàn):
[0034]將疫苗分別進(jìn)行I次超劑量(ImL)和單劑量重復(fù)接種(0.3mLX2)的安全試驗(yàn)。觀察14天，試驗(yàn)雞均無(wú)任何局部和全身不良反應(yīng)，表明上述疫苗安全性良好
`[0035]1.6禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗效力檢驗(yàn)
[0036]用上述滅活后的病毒液再制備出油包水型疫苗，用于同制備出的禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗做效力比較。
[0037]1.6.1血清學(xué)方法檢驗(yàn)
[0038]取3-4周齡SPF雞30只，分為3組，每組10只雞，第I組皮下或肌肉注射油包水型疫苗0.3mL，第2組注射水包油包水型疫苗，第3組注射磷酸鹽緩沖液作為對(duì)照，同樣條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)條件見(jiàn)表1免疫后每周采集血清，直至免疫后第6周，按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定的血凝抑制試驗(yàn)(HI)方法對(duì)特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。
[0039]表1兩種不同劑型的禽流感病毒油乳劑滅活疫苗免疫劑量及分組
[0040]
組號(hào)劑型試驗(yàn)劑量試驗(yàn)雞數(shù)第I組油包水型0.3ml/只10只第2組水包油包水型0.3ml/只10只第3組磷酸鹽緩沖液0.3ml/只10只
[0041]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和圖1所示。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中規(guī)定當(dāng)HI抗體效價(jià)的幾何平均值不低于61og2時(shí)判為陽(yáng)性，否則為陰性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知常規(guī)的油包水型疫苗在免疫后第2 周即可誘導(dǎo)產(chǎn)生禽流感病毒特異性抗體，第4周抗體水平達(dá)到高峰，第6周抗體水平有所下降，但仍為陽(yáng)性；水包油包水型疫苗則在免疫后第I周即可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，第3周抗體水平達(dá)到高峰，第6周抗體水平有所下降，但仍為陽(yáng)性；對(duì)照組則無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。本實(shí)施例制備的水包油包水型疫苗相對(duì)于常規(guī)的油包水型疫苗具有一定的優(yōu)勢(shì)，其產(chǎn)生抗體快，并且可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的抗體。
[0042]表2兩種不同劑型禽流感病毒滅活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平檢測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于包括以下步驟:1)制苗用細(xì)胞的培養(yǎng):取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)良好的MDCK細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5X 105/mL-5X 106/mL的細(xì)胞密度接種于含有8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 °C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)過(guò)夜；2)細(xì)胞的培養(yǎng)與收獲:當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)基單層時(shí)，按種毒接種量0.01-0.5M01、病毒含量大于等于106_ 5TCID5tlAiL的禽流感病毒，控制溫度在37°C繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)48-96小時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，得到含上清液的細(xì)胞毒液；3)病毒的滅活:將步驟2)得到的含上清液的細(xì)胞毒液置于滅菌容器內(nèi)，根據(jù)病毒液體積加入甲醛溶液并調(diào)整甲醛終濃度至0.5-2%。(v/v)，充分搖勻毒液，以180r/min轉(zhuǎn)速， 20-25 °C條件下滅活12-48小時(shí)；4)疫苗的制備:將滅活后的病毒液以3500r/min離心20min，再經(jīng)8層紗布過(guò)濾，棄去沉淀，將濾過(guò)液用截留分子量為300KD的膜包進(jìn)行2-3倍濃縮，濃縮后的病毒液即為水相， 使用前置于28-32°C水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱；取疫苗佐劑，充分混勻后置于28-32°C水浴鍋中預(yù)熱至水浴鍋溫度，即為油相；將上述預(yù)熱后的水相和油相按1:0.8-1:1.2 (w/w)比例混合， 利用磁力攪拌裝置進(jìn)行預(yù)混合l_2h，然后采用均質(zhì)機(jī)調(diào)整二級(jí)閥壓力為20-30bar、一級(jí)閥壓力為400-500bar對(duì)該混合物乳化2_3次，即得到一種禽`流感病毒水包油包水型滅活疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗及其制備方法，其特征在于步驟I)所述的EDTA-胰酶細(xì)胞分散液配方為:含0.25%(w/v)胰酶、0.02%(w/v)EDTA 的 Hank’ s 液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟I)所述的細(xì)胞接種量為8X 105/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟2)所述的病毒接種量為0.1MOI。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟2)所述的培養(yǎng)時(shí)間為72h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟3)所述的甲醛終濃度為1%。。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟3)所述的滅活條件為20°C、20小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟4)所述預(yù)熱后的水相和油相以相同溫度混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于所述相同溫度為31°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒水包油包水型滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟4)所述的均質(zhì)機(jī)參數(shù)為二級(jí)閥壓力為25bar、一級(jí)閥壓力為400bar。
【文檔編號(hào)】A61P31/16GK103495163SQ201310444384
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】張立霞, 何召慶, 吳全忠, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司