靶向wisp-1蛋白的特異性七肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了靶向WISP-1蛋白的特異性七肽及其應用。所述特異性七肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1～114任一所示。本發(fā)明利用噬菌體肽庫技術，篩選到能特異性地靶向WISP-1蛋白的114個拮抗肽，利用這些拮抗肽制備WISP-1蛋白多肽拮抗劑，不僅能明顯抑制WISP-1蛋白的活性，高效低毒，并且生產(chǎn)成本低，用量小、易合成。
【專利說明】靶向WISP-1蛋白的特異性七肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術領域】，具體涉及靶向WISP-1蛋白的特異性七肽及其應用。
【背景技術】
[0002]Wnt-1誘導的分泌性蛋白(WISP-1)基因最早是在小鼠乳腺上皮細胞系(C57MG)中發(fā)現(xiàn)的，該基因位于人染色體8q24.l-8q24.3，編碼產(chǎn)物為367個氨基酸組成的分泌型蛋白，含有一段信號肽(SP)以及IGFBP、VWFC、TSP和CTCK4個結(jié)構(gòu)域(圖5)。WISP-1蛋白屬于連接組織生長因子(CCN)家族成員，序列分析顯示W(wǎng)ISP-1與CCN家族成員保持高度的序列相似性。
[0003]與另兩個CCN家族成員CTGF與Cyr-61 —樣，WISP-1受到整合素受體的信號調(diào)控。整合素受體在細胞轉(zhuǎn)移和增殖中發(fā)揮作用，且能夠影響癌細胞的侵襲和生長。WISP-1在一些細胞系中能引起有絲分裂效應，具有支持細胞系長期生長的能力，具體表現(xiàn)為:參與DNA合成、改變細胞形態(tài)、增加細胞飽和度、加速細胞生長等。WISP-1不僅能加速細胞增殖，還能驅(qū)使正常細胞向腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化。目前，已研究發(fā)現(xiàn)WISP-1基因在一些腫瘤細胞系及腫瘤病人體內(nèi)擴增，在乳癌、腸癌、子宮內(nèi)膜樣癌、軟骨瘤等腫瘤中WISP-1蛋白特異性過量表達。
[0004]目前，在細胞和動物水平均已證實WISP-1的表達受到Wnt信號通路中的Wnt-1及其下游β-連環(huán)蛋白的調(diào)節(jié)，即WISP-1基因的啟動子元件轉(zhuǎn)錄應答Wnt-1和β-連環(huán)蛋白信號。連環(huán)蛋白是fct信號通路的重要分子，它的表達受Wnt-1信號的正調(diào)控。WISP-1是Wnt-1的下游靶標，轉(zhuǎn)化Wnt-1基因的C57MG細胞中WISP-1高表達。在對WISP-1基因啟動子的研究中發(fā)現(xiàn)，cAMP應答元件綁定蛋白(CREB)位點在β -連環(huán)蛋白介導WISP-1蛋白的轉(zhuǎn)錄活化過程中起重要作用，而淋巴增強子/T細胞因子(TCF/LEF)位點只是起微小的作用。
[0005]WISP-1蛋白在一些細胞類型中也表現(xiàn)出抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。在高度轉(zhuǎn)移的鼠黑色素瘤細胞中，與WISP-1等同的mELML表達下調(diào)，在該細胞中轉(zhuǎn)染并表達mELML時，細胞轉(zhuǎn)移減少。在肺癌細胞系(H460)中，過量表達WISP-1能夠抑制肺癌細胞轉(zhuǎn)移及體外細胞侵襲和活動性。Akt的活化對于細胞骨架重構(gòu)是十分重要的。研究發(fā)現(xiàn)，在WISP-1過量表達的H460細胞中Akt活性受抑制。當整合素的阻斷抗體作用時，該細胞中的Akt被重新激活。
[0006]WISP-1促進細胞增殖和轉(zhuǎn)化、抑制細胞凋亡以及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的特性使其成為腫瘤生物治療的理想靶點。在體內(nèi)或體外用抗體都能夠阻斷WISP-1的表達，從而使相關細胞和組織的功能得到恢復。
[0007]腫瘤的非細胞生物治療包括抗體、多肽(或蛋白質(zhì))疫苗、基因疫苗、體內(nèi)基因治療等。其中，抗體和多肽治療是目前最為活躍的兩個領域。目前所有用于科學研究的WISP-1抗體都是非臨床應用型的，而抗體的制備價格昂貴且存在鼠源性抗體在人體內(nèi)易產(chǎn)生抗抗體等弊端。
[0008]與單克隆抗體藥相比，較小的多肽幾乎沒有免疫原性；可化學合成，產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控，能為腫瘤的生物治療提供一種新的方法。近年來，隨著生物技術的不斷發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)很多腫瘤相關基因及腫瘤產(chǎn)生調(diào)控因子，篩選與這些靶點特異拮抗的多肽，可能成為抗癌藥物研發(fā)的突破口。
[0009]在多肽藥物開發(fā)中，利用提取、化學合成、噬菌體展示技術和蛋白酶降解等多種方式可得到各種不同的肽庫，從這些肽庫中可以篩選出活性多肽，并鑒定其結(jié)構(gòu)。噬菌體肽庫是20世紀90年代興起的一項新技術，其原理是:以噬菌體為載體，將編碼外源多肽的基因片段定向插入到噬菌體的外殼蛋白基因區(qū)，使外源多肽通過與噬菌體外殼蛋白融合而表達并展示于噬菌體表面，被展示的多肽可保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，進而通過親和富集等方法篩選表達特異多肽的噬菌體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了靶向WISP-1蛋白的特異性七肽，該特異性七肽是利用噬菌體肽庫技術篩選出來的，能特異性地靶向fct信號通路下游靶基因WISP-1編碼的蛋白。
[0011]一種靶向WISP-1蛋白的特異性七肽，氨基酸序列如SEQ ID N0.1~114任一所示。
[0012]本發(fā)明還提供了編碼所述特異性七肽的基因，以及含有所述基因的表達單元或重組載體。
[0013]本發(fā)明還提供了含有所述特異性七肽的融合蛋白。
[0014]本發(fā)明還提供了表面展示有所述特異性七肽的噬菌體。
[0015]本發(fā)明所述特異性七肽是從噬菌體隨機七肽庫中篩選獲得的，具體步驟包括:
[0016](1)靶蛋白WISP-1的原核表達和純化；
[0017]采用蛋白質(zhì)編碼序列的定向克隆方法，使用PFN19A(HaloTag7)T7SP6FleXi載體構(gòu)建靶蛋白WISP-1的表達載體，HaloTag蛋白位于WISP-1融合蛋白的N末端；HaloTag作為一種新型蛋白標簽，能夠增強重組蛋白的表達產(chǎn)率和可溶性。
[0018]采用一步法(KRX)感受態(tài)細胞進行載體的有效轉(zhuǎn)化，由鼠李糖啟動子(rhaBAD)驅(qū)動T7RNA聚合酶表達，并通過T7啟動子對WISP-1融合蛋白的表達進行靈活控制。
[0019]將誘導表達的WISP-1融合蛋白共價固定到HaloLink樹脂上，使用TEV蛋白酶從HaloLink樹脂上將WISP-1蛋白切下，再使用HisLink樹脂特異性去除TEV酶，這樣就得到了產(chǎn)量大且純度高的WISP-1蛋白。
[0020](2)噬菌體拮抗肽的篩選；
[0021]將靶蛋白WISP-1直接包被在固相支持物上，加入噬菌體七肽庫(New EnglandBiolabs公司生產(chǎn))，進行“親和吸附一洗脫一回收一擴增”多輪親和篩選富集，洗去未吸附的或非特異結(jié)合(對照蛋白GUS篩選)的噬菌體，從噬菌體七肽庫中篩選到與靶蛋白特異性結(jié)合、表達有拮抗肽(特異性七肽)的噬菌體。
[0022]3)分離并擴增單一的噬菌體克?。?br> [0023]對篩選到的WISP-1特異結(jié)合噬菌體進行富集、稀釋后鋪平板，挑選單克隆噬菌體，并于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)擴增；為篩選盡可能多的拮抗肽，總共擴增4608個克隆(24塊.96孔平板)，其中包括若干陽性以及陰性對照克隆。[0024](4)拮抗肽的鑒定；
[0025]對WISP-1特異結(jié)合噬菌體進行ELISA鑒定:首先，將靶蛋白WISP-1包被酶標板，然后孵育各稀釋度的單克隆噬菌體，最后用抗噬菌體ML3抗體檢測陽性單克隆噬菌體；陽性單克隆噬菌體經(jīng)擴增后，提取噬菌體單鏈DNA進行測序；通過序列分析發(fā)現(xiàn)高度重復的多肽序列，確定WISP-1蛋白的特異性七肽基序。
[0026]由于所述特異性七肽能特異性結(jié)合WISP-1蛋白，因此本發(fā)明還提供了所述特異性七肽在制備WISP-1蛋白多肽拮抗劑中的應用。所述WISP-1蛋白多肽拮抗劑可用于阻斷WISP-1蛋白的表達，從而使相關細胞和組織的功能得到恢復。
[0027] 申請人:研究發(fā)現(xiàn)，WISP-1是放射抗性的食管癌細胞(KYSE-150R)上皮一間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)的關鍵因子。在KYSE-150R細胞中，WISP-1的RNA和蛋白水平表達均顯著上調(diào)。 申請人:使用抗體中和WISP-1的表達，發(fā)現(xiàn)KYSE-150R細胞的放射抗性隨之顯著減弱，在裸鼠模型中也得到相似的結(jié)果。因此，WISP-1是克服放射抗性的極有價值的治療靶點。
[0028]因此，本發(fā)明所述WISP-1蛋白多肽拮抗劑可以是放療增敏劑。所述放療增敏劑可用于減弱食管癌細胞的放射抗性，有利于對食管癌患者進行放射治療。
[0029]本發(fā)明利用噬菌體肽庫技術，以Wnt信號通路下游靶基因WISP-1編碼的蛋白為靶點，從噬菌體七肽庫中篩選到具有明顯抑制WISP-1蛋白活性的噬菌體，經(jīng)ELISA鑒定和序列分析獲得拮抗肽的序列。
[0030]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0031]本發(fā)明利用噬菌體肽庫技術，篩選到能特異性地靶向WISP-1蛋白的114個特異性七肽，利用這些特異性七肽制備`WISP-1蛋白多肽拮抗劑以及食管癌治療中的放療增敏劑不僅能明顯抑制WISP-1蛋白的活性，高效低毒，并且生產(chǎn)成本低，用量小、易合成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明靶向WISP-1蛋白的特異性七肽的篩選流程圖；
[0033]圖2為WISP-1重組蛋白的誘導表達結(jié)果電泳圖；其中，M為蛋白質(zhì)marker ；
[0034]圖3為WISP-1重組蛋白的Western blot鑒定圖；
[0035]圖4為親和WISP-1蛋白的噬菌體陽性克隆的ELISA鑒定圖；
[0036]圖5為WISP-1蛋白的結(jié)構(gòu)圖。
【具體實施方式】
[0037]靶向WISP-1蛋白的特異性七肽的篩選方法，其篩選流程見圖1，具體包括:
[0038](I)重組質(zhì)粒 pFN19A Halo-ffISP-Ι 的構(gòu)建
[0039]以pFN2K-WISP-l為模板，設計并合成WISP-1基因的特異性PCR引物，進行PCR擴增，PCR引物序列如下:
[0040]上游引物:5，-CCCGGCGATCGCCATGAGGTGGTTCCTGCCCTG-3，；
[0041]下游引物:5’-CTTGGTTTAAACGTTGGCAATTTCTGAGAAGTC-3’；
[0042]PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用特異性限制性內(nèi)切酶(Sgf I&Pme I)進行酶切，將PFN19A(HaloTag7)T7SP6Flexi載體用相同的限制性內(nèi)切酶進行酶切，并將對應的cDNA片段與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JML09，PCR鑒定陽性克隆并測序，將測序驗證正確的陽性克隆命名為PFN19A Halo-WISP-10
[0043](2)重組質(zhì)粒pFN19A Halo-WISP-l在KRX大腸桿菌中的誘導表達
[0044]將pFN19A Halo-ffISP-Ι重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達菌KRX，鋪入LB瓊脂平板上倒置培養(yǎng)，挑取菌落，PCR驗證陽性的克隆接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，在菌體進入指數(shù)增長期時，加入鼠李糖誘導表達，收集菌體，用Halo蛋白純化液(50mM HEPES,150mM NaCl, pH7.5)重懸，SDS-PAGE分析確定最優(yōu)的表達條件。
[0045](3)融合蛋白的純化
[0046]根據(jù)優(yōu)化的表達條件(37°C，3.5h)進行大量誘導表達，離心去上清收集菌液，沉淀于_80°C保存或置冰上備用；HaloLink樹脂懸液ImL預先用2.5倍體積的Halo蛋白純化液在4°C平衡。
[0047]用15mL Halo蛋白純化液重懸步驟(2)收集的菌體，加入100 μ L溶菌酶(IOOmg/mL)和100 μ L核酸酶(5mg/mL)，在冰上進行超聲破碎至菌液澄清，離心，收集上清液；取12mL上清液(S)加入預先平衡的HaloLink樹脂懸液lmL，室溫孵育2h，過純化柱棄濾液(FT)，用Halo蛋白純化液洗滌純化柱，最后加入含8U/mLTEV酶的Halo蛋白純化液3mL到純化柱中，混勻后室溫反應Ih ;過柱收集濾液，加入Halo蛋白純化液洗滌柱子，重復一次，收集濾液(El )，加入IOyL HisLink樹脂到3mL El中，室溫孵育0.5h后離心收集上清(E2)。從S、FT、E1和E2中分別吸取樣品，進行10%SDS-PAGE分析，電泳結(jié)果見圖2。圖2中“S-TEV”樣品是指取10 μ L含8U/mL TEV酶的Halo蛋白純化液與50 μ L的S樣品反應所獲得的溶液。
[0048](4)重組蛋白的鑒定
[0049]取IOyg純化的重組蛋白加5 μ L5 X蛋白電泳上樣緩沖液，于95°C加熱5min，進行10%SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束`后進行考馬氏亮藍染色，或用半干電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜17min (15V)，脫脂牛奶封閉2h，加入兔抗WISP-1抗體于4°C孵育過夜，用PBS洗滌數(shù)次，每次IOmin ;再與山羊抗兔-HRP抗體孵育lh，用PBS洗滌三次后用ECL檢測，在暗室中曝光到X光片上(見圖3)。
[0050](5)噬菌體隨機七肽庫靶向WISP-1蛋白的親和篩選
[0051]I)洗管:0.1M NaHCO3 (pH8.6)溶液清洗包被免疫管；
[0052]2)包被:準備 100 μ g/mL 靶分子溶液[WISP-1 蛋白溶于 0.1M NaHCO3CpH8.6)中]，室溫下包被于免疫管中；
[0053]3)封閉:倒出包被液，免疫管倒置在干凈的紙巾上拍甩以除去殘余溶液，每管加滿封閉液，4°C輕搖封閉；
[0054]4)親和:棄封閉液，以 TBST (TBS+0.l%Tween_20)洗滌；用 4mL 的 TBSB(TBS+0.5%BSA)緩沖液稀釋2 X IO11Pfu單位噬菌體(10 μ L)，然后加到免疫管中，4°C輕搖孵育；
[0055]5)洗脫:傾倒除去未結(jié)合的噬菌體，倒置免疫管在干凈的紙巾上拍甩除去殘余溶液，用TBST緩沖液洗管數(shù)次，每次洗滌輕搖；最后一次棄洗滌液后，每管加入500 μ L的0.2ΜGlycine-HCl (ρΗ2.2)，輕搖晃動；
[0056]6)中和:將洗脫液吸入一干凈1.5mL微量離心管中，用IM Tris-HCl (ρΗ9.I)中和上述洗脫液；[0057]7)留取50 μ L噬菌體洗脫物用于噬菌體滴度測定:按常規(guī)ML3方法中的程序測定I μ L噬菌體洗脫物在KT1-KT4不同稀釋度下的滴度(參見步驟(6))；
[0058]8)剩余洗脫物擴增:將噬菌體洗脫物加入到ER2738培養(yǎng)物中，37°C培養(yǎng)4.5hr ；
[0059]9)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一 50mL離心管中，離心，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，再離心；
[0060]10)將上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，噬菌體4°C沉淀過夜；
[0061]11)離心PEG沉淀物，棄上清，再短暫離心，吸去殘留上清液；沉淀用ImL TBS重懸溶解，離心，使殘余細胞沉淀，然后取上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，加入1/6體積的PEG/NaCl冰上孵育60min再次沉淀；離心，棄上清，沉淀溶解于200 μ L TBS (含0.02%NaN3)中，即為擴增的洗脫液；
[0062]12)用對照蛋白⑶S (實驗室儲備)包被免疫管，按照上述2) -11)的步驟進行“親和吸附一洗脫一回收一擴增”篩選，去掉非特異性噬菌體；
[0063]13)按上述步驟再進行三輪篩選，第二輪及以后幾輪分別用上一輪洗脫液的擴增噬菌體，投入噬菌體量均約為2X10npfu。
[0064](6)篩選獲得的噬菌體七肽庫的滴度測定
[0065]I)接種ER2738單菌落于LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)中期；
[0066]2)準備已高壓滅菌的Top Agar培養(yǎng)基和LB/IPTG/Xgal平板；
[0067]3)用LB培養(yǎng)液準備10倍系列稀釋的噬菌體；
`[0068]4)當ER2738菌體生長至對數(shù)中期，將培養(yǎng)物等份于微量離心管中，每個噬菌體稀釋度對應一管ER2738培養(yǎng)物；
[0069]5)在每管ER2738培養(yǎng)物中分別一一加入10 μ L不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育幾分鐘，進行噬菌體感染；
[0070]6)將感染菌體加入預溫的Top Agar瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管，快速混勻，立即傾注于LB/IPTG/Xgal平板上，適當傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開；
[0071]7)待平板冷卻后，倒置于37°C避光培養(yǎng)過夜；
[0072]8)檢查平板，計數(shù)平板上的噬菌斑數(shù)，計算空斑形成單位(Pfu)。
[0073](7)靶向WISP-1的噬菌斑單克隆擴增
[0074]I)將ER2738過夜培養(yǎng)物接種于LB-Tet培養(yǎng)基，恒溫搖床搖至對數(shù)期；
[0075]2)將步驟(5)最后一輪篩選洗脫下的靶向WISP-1的噬菌體侵染宿主菌ER2738，鋪板過夜；
[0076]3)分別挑16-48個藍色噬菌斑到上述步驟I)處于對數(shù)期增長的ER2738培養(yǎng)物中，37°C搖床培養(yǎng)4.5-5h ；
[0077]4)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一 1.5mL離心管中，離心，收集上清，此即為擴增噬菌體貯液，4°C貯存；
[0078]5)將上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，讓噬菌體4°C沉淀過夜；
[0079]6)離心PEG沉淀物，棄上清，再短暫離心，吸去殘留上清液；沉淀用ImL TBS重懸溶解，離心，使殘余細胞沉淀，然后取上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，加入1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育60min，離心，棄上清，沉淀溶解于200 μ L TBS (含0.02%NaN3)中，即為擴增的洗脫液。
[0080](8) ELISA鑒定親和WISP-1的噬菌體陽性克隆
[0081]I)用100 μ g/mL的靶分子溶液[WISP-1蛋白溶于0.1M NaHCO3 (pH8.6)中]包被ELISA板，每孔100 μ L，在濕盒中輕微振蕩；
[0082]2)甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在紙巾上拍甩除去殘液，每孔加封閉液封閉；
[0083]3 )甩出封閉液，用0.P/oPBST洗板數(shù)次；
[0084]4)每孔加入步驟(7)擴增后的單克隆噬菌體，4°C振蕩過夜孵育；
[0085]5)用0.P/oPBST洗板數(shù)次，然后每孔加入100 μ L HRP標記的抗-ML3抗體，室溫震蕩作用Ih ；
[0086]6)用0.P/oPBST洗板數(shù)次，每孔加100 μ L TMB底物顯色溶液，室溫作用至藍色明顯顯現(xiàn)后，每孔加入50μ L的IM鹽酸終止反應，測定450nm處的吸光值。
[0087]通過與陰性靶蛋白PRDX的OD45tl值進行比較(部分比較結(jié)果見圖4)，獲得能與WISP-1蛋白特異結(jié)合的114個陽性克隆噬菌體(OD45tlX).4)。
[0088]( 9 )測序模板的快速純化
[0089]I)將ER2738過夜培養(yǎng)物按1:100稀釋，取ImL菌體稀釋物，加入步驟(8)篩選的陽性克隆噬菌體10 μ L，進 行擴增4.5h，在離心后，取500 μ L上清轉(zhuǎn)入一新鮮離心管；
[0090]2)向離心管中加入200yL PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置10-20min，離心，棄上清，再離心，吸去殘余上清；
[0091]3)沉淀物徹底重懸于100 μ L碘化物緩沖液中，加入250 μ L乙醇，室溫溫育10-20min，離心，棄上清，用70%的乙醇洗沉淀，離心，棄上清，短暫放置干燥；
[0092]4)沉淀重懸于 30 μ L 不含 RNA 酶的 H2O 或者 TE [IOmM Tris-HCI (ρΗ8.0)，ImMEDTA]中，獲得模板溶液；
[0093]5)取5 μ L的上述模板溶液，進行測序，測序獲得編碼114個七肽的核苷酸序列。
【權(quán)利要求】
1.靶向WISP-1蛋白的特異性七肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQID N0.1~114任一所示。
2.編碼如權(quán)利要求1所述特異性七肽的基因。
3.含有如權(quán)利要求2所述基因的表達單元。
4.含有如權(quán)利要求2所述基因的重組載體。
5.含有如權(quán)利要求1所述特異性七肽的融合蛋白。
6.表面展示有如權(quán)利要求1所述特異性七肽的噬菌體。
7.如權(quán)利要求1所述特異性七肽在制備WISP-1蛋白多肽拮抗劑中的應用。
8.如權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述WISP-1蛋白多肽拮抗劑為放療增敏劑。
9.如權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于，所述放療增敏劑用于減弱食管癌細胞的放射抗性。`
【文檔編號】A61P35/00GK103497236SQ201310444615
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】王聞哲, 王孝舉, 吳式琇, 丁明建, 吳波, 宋濤, 李偉莉 申請人:浙江省醫(yī)學科學院, 杭州市腫瘤醫(yī)院