一種重組人透明質(zhì)酸酶、其生產(chǎn)純化方法、制劑及使用方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人透明質(zhì)酸酶、其生產(chǎn)純化方法、制劑及使用方法與應(yīng)用，所述重組人透明質(zhì)酸酶采用重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-IgFc，用于粘膜或皮膚表面。所述人透明質(zhì)酸酶制劑可制成膜片劑、噴劑、洗劑、凍干粉噴霧劑等形式，用于美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)皮膚促滲、表面麻醉劑皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長(zhǎng)因子粘膜皮膚促滲、降糖藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲等。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種重組人透明質(zhì)酸酶、其生產(chǎn)純化方法、制劑及使用方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組人透明質(zhì)酸酶、其生產(chǎn)純化方法、制劑及使用方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸是真皮中主要的粘多糖形式，是由重復(fù)的二糖單元D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的線(xiàn)性多糖。透明質(zhì)酸能夠保持超過(guò)自身重量500倍的水分，形成非常粘稠的溶液，填充在胞外基質(zhì)膠原蛋白纖維骨架之內(nèi)，影響胞外基質(zhì)的傳質(zhì)特征。胞外基質(zhì)是許多藥物進(jìn)行皮下注射的主要障礙。膠原蛋白纖維構(gòu)成的固態(tài)基架與嵌入富含透明質(zhì)酸的黏性凝膠，造成一定的傳質(zhì)阻力，限制了藥物代謝動(dòng)力學(xué)以及能夠從同一位點(diǎn)進(jìn)行皮下注射的液體體積，以及到達(dá)血管的速度和數(shù)量。透明質(zhì)酸酶是最有效的組織藥物滲透和藥物擴(kuò)散劑，自然界中毒蛇昆蟲(chóng)咬人都是利用透明質(zhì)酸酶快速促進(jìn)毒物滲透和攻擊獵物。
[0003]透明質(zhì)酸酶是降解透明質(zhì)酸的酶家族，通過(guò)催化透明質(zhì)酸的水解，透明質(zhì)酸酶降低透明質(zhì)酸的黏度，可逆性地改變真皮的結(jié)構(gòu)，由此提高組織的通透性。透明質(zhì)酸半衰期15-20h，在體內(nèi)更新時(shí)間短，皮膚能夠快速修復(fù)?；谕该髻|(zhì)酸酶的打通胞外基質(zhì)屏障給藥是一種新型高效給藥平臺(tái)。根據(jù)作用機(jī)理與降解產(chǎn)物的不同，可將透明質(zhì)酸酶分為三類(lèi)。第一類(lèi)包括β-D-乙酰-D-己糖胺酶，將高分子量底物降解成四糖作為主要的終產(chǎn)物。睪丸透明質(zhì)酸酶是這一種類(lèi)的原型，它能夠催化轉(zhuǎn)糖基作用，因此，在水解HA的過(guò)程中也會(huì)形成六碳糖、二糖以及八碳糖。第二類(lèi)，以水蛭透明質(zhì)酸酶為代表的透明質(zhì)酸酶。第三類(lèi)，細(xì)菌透明質(zhì)酸酶，是裂解酶。
[0004]自1940s以來(lái)，動(dòng)物組織中提取的含透明質(zhì)酸酶活性的擴(kuò)散因子已作為促擴(kuò)散劑用于臨床給藥。但是其應(yīng)用范圍一直限定于緊急情況，主要是因?yàn)閷?duì)成分不完全明確的酶制劑中其他雜質(zhì)成分的顧慮。動(dòng)物組織提取透明質(zhì)酸酶制劑中有效成分小于1%，絕大部分為異源雜質(zhì)蛋白。
[0005]繼中性人透明質(zhì)酸酶基因發(fā)現(xiàn)之后(現(xiàn)專(zhuān)利已過(guò)期)，美國(guó)Hylozyme公司采用DNA來(lái)源的重組人源透明質(zhì)酸酶(PH20)取代動(dòng)物源純化的透明質(zhì)酸酶，降低免疫原性、提升安全性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。重組人透明質(zhì)酸酶PH20有六個(gè)糖化點(diǎn)和五個(gè)二硫鍵，工業(yè)上難于高表達(dá)和生產(chǎn)，除美國(guó)Hylozyme公司采用基因拷貝擴(kuò)增`技術(shù)和CHO細(xì)胞成功表達(dá)和生產(chǎn)了重組人透明質(zhì)酸酶PH20外，到目前為止還沒(méi)有其它報(bào)道使用非基因拷貝擴(kuò)增技術(shù)和新型CHO細(xì)胞(CHO-S)成功表達(dá)和生產(chǎn)了糖化完整比活性和Hylozyme公司表達(dá)和生產(chǎn)的重組人透明質(zhì)酸酶PH20比活性相似的重組人透明質(zhì)酸酶PH20的案例。
[0006]重組人透明質(zhì)酸酶(PH20)半衰期短，已有人使用聚乙二醇化學(xué)偶聯(lián)PH20，生產(chǎn)了長(zhǎng)效人透明質(zhì)酸酶，已用于人類(lèi)臨床實(shí)驗(yàn)治療腫瘤。
[0007]透明質(zhì)酸酶主要用于皮下輸液、眼周手術(shù)麻醉、化藥和生物藥促滲、尿路造影術(shù)中造影劑的吸收，其中和生物藥制成復(fù)方注射劑的藥物有胰島素、抗體和免疫球蛋白。
[0008]透明質(zhì)酸廣泛分布于皮膚、口腔、舌下粘膜、牙齦表面組織、鼻粘膜和腸道粘膜(如肛腸)等。由于舌下粘膜、牙齦表面組織、鼻粘膜和腸道粘膜上皮細(xì)胞沒(méi)有角化，有利于粘膜局部直接使用透明質(zhì)酸酶促進(jìn)其他藥物(化藥、生物藥)的滲透。目前還沒(méi)有使用人透明質(zhì)酸酶膜片劑、噴劑或洗劑等促進(jìn)面部美容營(yíng)養(yǎng)品、麻醉藥、化藥、生物藥經(jīng)皮膚和粘膜(舌下粘膜、頰粘膜、軟腭粘膜、硬腭粘膜、牙齦粘膜)滲透的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種促滲效果好的重組人透明質(zhì)酸酶。
[0010]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組人透明質(zhì)酸酶生產(chǎn)純化方法。
[0011]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種重組人透明質(zhì)酸酶制劑。
[0012]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法。
[0013]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種重組人透明質(zhì)酸酶的應(yīng)用。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0015]一種重組人透明質(zhì)酸酶，用于粘膜或皮膚表面，采用重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ;其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示,所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0016]所述重組人透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)純化方法，使用富含GC基因表達(dá)載體pMH3、pMH4或PMH5載體、新型CHO-S細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，再采用Q瓊脂糖離子交換層析_苯基瓊脂糖疏水相互作用層析-羥基磷灰石層析-SP瓊脂糖離子交換層析四步純化方法進(jìn)行純化。
`[0017]一種重組人透明質(zhì)酸酶制劑，包含上述的重組人透明質(zhì)酸酶，所述制劑采用膜片劑、洗劑、液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式，所述膜片劑是以吸水膜為承載基礎(chǔ)。
[0018]進(jìn)一步地，包括150-1500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，5_15mM Na2HPO4,0.01-0.06%CaCl2，0.05-0.2%EDTA-Na2，100-200mM NaCl，0.05-0.2%HSA，且 pH 值為5.5~7.5。
[0019]進(jìn)一步地，包括500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，IOmM Na2HPO4,0.03%CaCl2,0.1%EDTA-Na2,145mM NaCl，0.1%HSA,且 pH 值為 5.5-7.5。
[0020]進(jìn)一步地，所述液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式的制劑包括:胰島素20-160單位/ml、200-1000 單位 PH20 或 PH20-HAS 或 PH20_IgFc/ml。
[0021]進(jìn)一步地，所述胰島素可替換為神經(jīng)生長(zhǎng)因子或神經(jīng)保護(hù)肽NAP。
[0022]上述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法，先使用重組人透明質(zhì)酸酶制劑促進(jìn)皮膚或粘膜的滲透性，使其作為配合給藥的促滲劑，再針對(duì)皮膚或粘膜進(jìn)行給藥，或者將藥物與所述制劑預(yù)先混合后再針對(duì)皮膚或粘膜使用。
[0023]上述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法，將所述制劑噴入鼻腔粘膜。
[0024]一種重組人透明質(zhì)酸酶的應(yīng)用，作為促滲劑配合給藥，用于粘膜或皮膚表面。
[0025]進(jìn)一步地，所述重組人透明質(zhì)酸酶包括重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ;其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0026]進(jìn)一步地，所述透明質(zhì)酸酶用于美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的皮膚促滲、表面麻醉劑的皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的皮膚促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長(zhǎng)因子粘膜促滲、降糖藥粘膜促滲、心血管藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲，或其他不同生物活性物質(zhì)和藥物的皮膚或粘膜促滲。
[0027]進(jìn)一步地，所述美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、膠原或透明質(zhì)酸；所述麻醉劑包括利多卡因、復(fù)方利多卡因或丁卡因；所述皮膚病治療藥物包括維生素A酸、抗菌素、糖皮質(zhì)激素、抗菌素或消毒劑；所述生物安定藥包括褪黑色素或胰島素；所述生長(zhǎng)因子包括生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素促釋放激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、膠原或透明質(zhì)酸；所述降糖藥包括胰島素、Extendin-4、GLPl或Leptin ;所述心血管藥包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸異山梨酯或速效救心丸；所述中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括神經(jīng)保護(hù)肽NAP、神經(jīng)生長(zhǎng)因子或胰島素；所述其他不同生物活性物質(zhì)和藥物包括鹽酸納洛酮、鹽酸阿撲嗎啡、睡眠康寧(腦部睡眠因子MT)、阿莫沙平、尼古丁、肝素、鹽酸丁丙諾非、復(fù)方丹參、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定(異丙腎上腺素)、鹽酸克倫特羅、干擾素、白介素2、腫瘤壞死因子、紅細(xì)胞生成素、白細(xì)胞生成素、心鈉素、生長(zhǎng)抑素、降鈣素、甲狀旁腺激素、蜂皇漿、生長(zhǎng)激素促釋放激素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、ddAVP、金剛燒妝、阿昔洛韋、利托那韋或卻地那韋。
[0028]由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0029]本發(fā)明的重組人透明質(zhì)酸酶可制成膜片劑、洗劑、液體噴劑或凍干粉噴霧劑，在配合給藥中預(yù)先使用可促進(jìn)皮膚、粘膜等的滲透性，增強(qiáng)皮膚、粘膜對(duì)美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、表面麻醉劑、皮膚病治療藥物、生物安定藥、生長(zhǎng)因子、降糖藥、心血管藥、中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或其他不同生物活性物質(zhì)或藥物的吸收；也可以預(yù)先與特定藥物混合或制成復(fù)方制劑使用。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明主要是利用富含GC動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)技術(shù)(W0/2008/091276)和動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器(W02006/138143和W02007/142664)生產(chǎn)重`組人透明質(zhì)酸酶PH20、人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白(PH20-HSA)和人透明質(zhì)酸酶人免疫球白蛋IgG2Fc片段融合蛋白(PH20_IgFc)，制造重組人透明質(zhì)酸酶膜片劑、液體噴劑、洗劑和凍干粉噴霧劑等，用于美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)皮膚促滲、表面麻醉劑皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長(zhǎng)因子粘膜促滲、降糖藥粘膜促滲、心血管藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲，或其他不同生物活性物質(zhì)和藥物的皮膚或粘膜促滲等。
[0031]本發(fā)明的一種重組人透明質(zhì)酸酶，用于粘膜或皮膚表面，采用重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ;其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0032]所述重組人透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)純化方法，使用富含GC基因表達(dá)載體pMH3、pMH4或pMH5載體、新型CHO-S細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，再采用Q瓊脂糖離子交換層析_苯基瓊脂糖疏水相互作用層析-羥基磷灰石層析-SP瓊脂糖離子交換層析四步純化方法進(jìn)行純化。
[0033]包含上述重組人透明質(zhì)酸酶的制劑，可以采用膜片劑、洗劑、液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式，膜片劑可以吸水膜為承載基礎(chǔ)，如紗布、無(wú)紡布等。
[0034]所述制劑包括150-1500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，5_15mM Na2HPO4,0.01-0.06%CaCl2，0.05-0.2%EDTA-Na2，100-200mM NaCl，0.05-0.2%HSA，且 pH 值為
5.5-7.5。優(yōu)選地，所述制劑包括500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，IOmM Na2HPO4,0.03%CaCl2,
0.1%EDTA-Na2,145mM NaCl，0.1%HSA，且pH值為5.5-7.5。使用時(shí)可以先使用重組人透明質(zhì)酸酶制劑促進(jìn)皮膚或粘膜的滲透性，使其作為配合給藥的促滲劑，再針對(duì)皮膚或粘膜進(jìn)行給藥，或者將藥物與所述制劑預(yù)先混合后再針對(duì)皮膚或粘膜使用。
[0035]液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式的制劑包括:胰島素20-160單位/ml、200_1000單位PH20或PH20-HAS或PH20_IgFc/ml。其中，胰島素可替換為神經(jīng)生長(zhǎng)因子或神經(jīng)保護(hù)肽NAP。使用時(shí)將所述制劑噴入鼻腔粘膜即可。
[0036]上述重組人透明質(zhì)酸酶的應(yīng)用，作為促滲劑配合給藥，用于粘膜或皮膚表面。可用于美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的皮膚促滲、表面麻醉劑的皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的皮膚促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長(zhǎng)因子粘膜促滲、降糖藥粘膜促滲、心血管藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲，或其他不同生物活性物質(zhì)和藥物的皮膚或粘膜促滲。
[0037]其中，所述美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、膠原或透明質(zhì)酸；所述麻醉劑包括利多卡因、復(fù)方利多卡因或丁卡因；所述皮膚病治療藥物包括維生素A酸、抗菌素、糖皮質(zhì)激素、抗菌素或消毒劑；所述生物安定藥包括褪黑色素或胰島素；所述生長(zhǎng)因子包括生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素促釋放激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、膠原或透明質(zhì)酸；所述降糖藥包括胰島素、Extendin-4、GLPl或L印tin ;所述心血管藥包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸異山梨酯或速效救心丸；所述中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括神經(jīng)保護(hù)肽NAP、神經(jīng)生長(zhǎng)因子或胰島素；所述其他不同生物活性物質(zhì)和藥物包括鹽酸納洛酮、鹽酸阿撲嗎啡、睡眠康寧(腦部睡眠因子MT)、阿莫沙平、尼古丁、肝素、鹽酸丁丙諾非、復(fù)方丹參、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定(異丙腎上腺素)、鹽酸克倫特羅、干擾素、白介素2、腫瘤壞死因子、紅細(xì)胞生成素、白細(xì)胞生成素、心鈉素、生長(zhǎng)抑素、降鈣素、甲狀旁腺激素、蜂皇漿、生長(zhǎng)激`素促釋放激素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、ddAVP、金剛烷肽、阿昔洛韋、利托那韋或卻地那韋等。
[0038]以下結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。由于人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白(PH20-HSA)，以及人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白(PH20-1gFc)的生產(chǎn)原理、方法及應(yīng)用與重組人透明質(zhì)酸酶(PH20)相同或類(lèi)似，因此以下實(shí)施例中僅以PH20為例進(jìn)行具體說(shuō)明。
[0039]實(shí)施例1
[0040]目的:重組人透明質(zhì)酸酶PH20的基因構(gòu)建、表達(dá)、免疫學(xué)檢測(cè)、活性檢測(cè)和反應(yīng)器生產(chǎn)。
[0041]研究背景:重組人透明質(zhì)酸酶PH20有六個(gè)糖化點(diǎn)和五個(gè)二硫鍵，工業(yè)上難于高表達(dá)和生產(chǎn)。除美國(guó)Hylozyme公司采用基因拷貝擴(kuò)增技術(shù)成功表達(dá)和生產(chǎn)了重組人透明質(zhì)酸酶PH20外，到目前為止還沒(méi)有其它報(bào)道使用非基因拷貝擴(kuò)增技術(shù)和新型CHO細(xì)胞(CHO-S)成功表達(dá)和生產(chǎn)了糖化完整比活性和Hylozyme公司表達(dá)和生產(chǎn)的重組人透明質(zhì)酸酶PH20比活性相似的重組人透明質(zhì)酸酶PH20的案例。
[0042]本發(fā)明利用我們有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的非基因拷貝擴(kuò)增技術(shù)，即富含GC動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)技術(shù)(W0/2008/091276)和動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器(W02006/138143和W02007/142664)技術(shù)，使用新型CHO細(xì)胞(CHO-S)生產(chǎn)出高質(zhì)量可商業(yè)化的重組人透明質(zhì)酸酶PH20。[0043]方法:通過(guò)PCR的方法將表達(dá)PH20氨基酸順序(SEQ ID N0.1)的結(jié)構(gòu)基因(SEQ IDN0.4)合成，并構(gòu)建到富含GC的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pMH3、pMH4、pMH5 (SEQ ID N0.5、6、7)中，小量制備這幾種表達(dá)質(zhì)粒后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的新型CHO細(xì)胞(CHO-S)中。通過(guò)G418師選，用槍頭手動(dòng)挑取穩(wěn)定克隆到96孔板中。當(dāng)細(xì)胞匯合度大于50%時(shí)，更換無(wú)血清新鮮培養(yǎng)基；3_6小時(shí)后，收集培養(yǎng)基樣品，通過(guò)檢測(cè)透明質(zhì)酸酶生物活性，選出表達(dá)量最高的克隆多個(gè)。在40ml搖瓶懸浮流加培養(yǎng)13天，活性單位呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，最高收液培養(yǎng)液中活性單位為2000U/ml。繼續(xù)在尖底小搖瓶?jī)?nèi)進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)和做傳代穩(wěn)定性研究；選出傳代穩(wěn)定的克隆在5L激流式反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。PH20在AP20SC (5L)反應(yīng)器上的大規(guī)模培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā):接種密度:2X 106個(gè)cells/ml ;參數(shù)工藝:T:生長(zhǎng)期37°C，表達(dá)期34°C ；DO:5-10%PH:6.8-7.2 ;生長(zhǎng)期培養(yǎng)基:B001，流加培養(yǎng)基:F001+糖；培養(yǎng)進(jìn)入表達(dá)期后，每天調(diào)一次PH至6.8，然后關(guān)閉加堿泵；培養(yǎng)周期16天，最高活性為3522U/ml。
[0044]結(jié)果:(1)重組人透明質(zhì)酸酶PH20在新型CHO細(xì)胞(CHO-S)中成功表達(dá)，westernblot結(jié)果表明篩選到重組人透明質(zhì)酸酶PH20穩(wěn)定高表達(dá)克隆所產(chǎn)生的條帶分子量大小正確；(2)高表達(dá)克隆在尖底小搖瓶?jī)?nèi)進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)和做傳代穩(wěn)定；(3)穩(wěn)定的高表達(dá)克隆在5L激流式反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行流加培養(yǎng)擴(kuò)增，各批次豐收液中透明質(zhì)酸酶活性達(dá)到1800-3500活性單位/毫升，達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)水平。
[0045]結(jié)論:使用富含GC的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pMH3、4、5，重組人透明質(zhì)酸酶PH20在新型CHO細(xì)胞(CHO-S)中成功表達(dá)，各批次豐收液中透明質(zhì)酸酶活性達(dá)到1800-3500活性單位/毫升，即每毫升培養(yǎng)液可以生產(chǎn)150單位的注射用重組人透明質(zhì)酸酶5-10支，滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)要求。
[0046]實(shí)施例2
[0047]目的:重組人透明質(zhì)酸酶PH20的分離純化。
[0048]方法:發(fā)酵液前處理:將所得5`L激流式反應(yīng)器所得發(fā)酵液使用固液分離裝置(離心機(jī)、膜包、中空纖維柱、套筒等)獲得上清，在IOmM Tris pH7.5中切向流透析，然后通過(guò)Q瓊脂糖離子交換層析、苯基瓊脂糖疏水相互作用層析、羥基磷灰石層析和SP瓊脂糖離子交換層析，純化人重組透明質(zhì)酸酶。
[0049]層析:用IOmM Tris+50mM NaCl pH7.5緩沖液沖洗10個(gè)柱體積，將人重組透明質(zhì)酸酶結(jié)合到Q瓊脂糖柱上，再用含有400mM NaCL的同樣的緩沖液洗脫。將洗脫峰用2M硫酸銨稀釋至最終濃度為500mM，并流穿通過(guò)苯基瓊脂糖柱。補(bǔ)加IOmM K3PO4至IOmM，pH7.4，流穿通過(guò)羥基磷灰石柱。將上一步收集流穿液以切向流設(shè)備緩沖液置換除鹽，電導(dǎo)為5ms/cm, pH5.4，再用含有140mM NaCl的同樣緩沖液洗脫。
[0050]將用20mM His+100mM NaCl pH7.0濃縮換液上述洗脫峰至濃度為lmg/ml，置于-20
度保存。
[0051]結(jié)果:通過(guò)SDS-PAGE電泳顯示其純度大于95% ;通過(guò)分子篩HPLC檢測(cè)顯示其純度為99% ;蛋白總收率約為40% ；
[0052]結(jié)論:重組人透明質(zhì)酸酶PH20經(jīng)分離純化后，純度符合要求；每毫克重組人透明質(zhì)酸酶活性13-16萬(wàn)單位，內(nèi)毒素遠(yuǎn)低于國(guó)家藥監(jiān)局要求。
[0053]實(shí)施例3
[0054]目的:重組人透明質(zhì)酸酶PH20的活性和穩(wěn)定性研究[0055]方法:重組人透明質(zhì)酸酶PH20液體制劑配方和穩(wěn)定性研究方法如下:
[0056]制劑配方:1500IUPH20+10mM Na2HP04+0.03%CaC12+0.l%EDTA-Na2+145mMNaCl+0.1%HSA pH5.5-7.5
[0057]穩(wěn)定性研究:將500U/ml PH20過(guò)濾后的溶液分裝至2ml安培瓶中，將25瓶溶液置于37 °C，濕度為75 土 5%的加速試驗(yàn)培養(yǎng)箱中。分別在第O、7、14、21、28、35、42天取樣，按照2010版藥典附錄玻璃酸酶活性檢測(cè)。
[0058]結(jié)果:
[0059]表1、重組人透明質(zhì)酸酶PH20穩(wěn)定性研究
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一種重組人透明質(zhì)酸酶，其特征在于，用于粘膜或皮膚表面，采用重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ； 其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)純化方法，其特征在于，使用富含GC基因表達(dá)載體pMH3、pMH4或pMH5載體、新型CHO-S細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，再采用Q瓊脂糖離子交換層析-苯基瓊脂糖疏水相互作用層析-羥基磷灰石層析-SP瓊脂糖離子交換層析四步純化方法進(jìn)行純化。
3.—種重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的重組人透明質(zhì)酸酶，所述制劑采用膜片劑、洗劑、液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式，所述膜片劑是以吸水膜為承載基礎(chǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，包括150-1500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，5-15mM Na2HPO4,0.01-0.06%CaCl2,0.05-0.2%EDTA-Na2,100-200mMNaCl，0.05-0.2%HSA，且 pH 值為 5.5-7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，包括500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，IOmM Na2HPO4,0.03%CaCl2,0.1%EDTA-Na2,145mM NaCl，0.1%HSA,且 pH 值為5.5~7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，所述液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式的制劑包括:胰島素20-160單位/ml、200-1000單位PH20或PH20-HAS或PH20-1gFc/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，所述胰島素可替換為神經(jīng)生長(zhǎng)因子或神經(jīng)保護(hù)肽NAP。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法，其特征在于，先使用重組人透明質(zhì)酸酶制劑促進(jìn)皮膚或粘膜的滲透性，使其作為配合給藥的促滲劑，再針對(duì)皮膚或粘膜進(jìn)行給藥，或者將藥物與所述制劑預(yù)先混合后再針對(duì)皮膚或粘膜使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法，其特征在于，將所述制劑噴入鼻腔粘膜。
10.一種重組人透明質(zhì)酸酶的應(yīng)用，其特征在于，作為促滲劑配合給藥，用于粘膜或皮膚表面。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組人透明質(zhì)酸酶的應(yīng)用，其特征在于，所述重組人透明質(zhì)酸酶包括重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ； 其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的重組人透明質(zhì)酸酶的應(yīng)用，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶用于美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的皮膚促滲、表面麻醉劑的皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的皮膚促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長(zhǎng)因子粘膜促滲、降糖藥粘膜促滲、心血管藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲，或其他不同生物活性物質(zhì)和藥物的皮膚或粘膜促滲。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組人透明質(zhì)酸酶的應(yīng)用，其特征在于，所述美容營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、膠原或透明質(zhì)酸； 所述麻醉劑包括利多卡因、復(fù)方利多卡因或丁卡因； 所述皮膚病治療藥物包括維生素A酸、抗菌素、糖皮質(zhì)激素、抗菌素或消毒劑； 所述生物安定藥包括褪黑色素或胰島素； 所述生長(zhǎng)因子包括生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素促釋放激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、膠原或透明質(zhì)酸； 所述降糖藥包括胰島素、Extendin-4、GLPl或Leptin ； 所述心血管藥包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸異山梨酯或速效救心丸；` 所述中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括神經(jīng)保護(hù)肽NAP、神經(jīng)生長(zhǎng)因子或胰島素； 所述其他不同生物活性物質(zhì)和藥物包括鹽酸納洛酮、鹽酸阿撲嗎啡、睡眠康寧(腦部睡眠因子MT)、阿莫沙平、尼古丁、肝素、鹽酸丁丙諾非、復(fù)方丹參、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定(異丙腎上腺素)、鹽酸克倫特羅、干擾素、白介素2、腫瘤壞死因子、紅細(xì)胞生成素、白細(xì)胞生成素、心鈉素、生長(zhǎng)抑素、降鈣素、甲狀旁腺激素、蜂皇漿、生長(zhǎng)激素促釋放激素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、ddAVP、金剛烷肽、阿昔洛韋、利托那韋或茚地那韋。
【文檔編號(hào)】A61K47/30GK103468662SQ201310454955
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】惠覓宙 申請(qǐng)人:惠覓宙