Hsa-miR-503在制備治療膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了hsa-miR-503在制備治療膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示hsa-miR-503可以有效降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡；qPCR檢測顯示hsa-miR-503在膠質(zhì)瘤組織或細(xì)胞系中呈低表達(dá)。這些結(jié)果表明hsa-miR-503可用于制備治療膠質(zhì)瘤藥物，其表達(dá)水平可作為膠質(zhì)瘤診斷的指標(biāo)。一種治療膠質(zhì)瘤的藥物包含hsa-miR-503和/或其前體。一種hsa-miR-503的檢測試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、miR-503和內(nèi)參的正向引物和反向引物。本發(fā)明為膠質(zhì)瘤的診斷與治療提供了新的方向。
【專利說明】Hsa-miR-503在制備治療膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及hsa-miR-503在制備治療膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤，是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，為最常見的顱內(nèi)腫瘤，約占45%。膠質(zhì)瘤的分類方法很多，以星形細(xì)胞瘤最多見。目前我國膠質(zhì)瘤發(fā)病率正逐年上升，但常規(guī)的手術(shù)治療及放化療的療效并不理想，且患者隨著病理級別增高病程縮短、死亡率增高。另外，膠質(zhì)瘤不容易早期發(fā)現(xiàn)，自出現(xiàn)癥狀至就診時(shí)間一般多為數(shù)月甚至數(shù)年。
[0004]MicroRNA簡稱miRNA，是一類長度在18-22個(gè)堿基的核苷酸序列，具有調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄后翻譯的作用。miRNA在動物、植物和酵母等生物中普遍存在，是一類在進(jìn)化上高度保守的小分子單鏈RNA。它通過與mRNA的剪切或者對其翻譯的抑制，從而下調(diào)靶基因的表達(dá)。目前，科學(xué)家已證實(shí)miRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化及促進(jìn)血管生成等方面均具有重要的調(diào)控作用。有研究表明，miRNA在膠質(zhì)瘤的發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用。Gabriely等發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中過表達(dá)miR-21可通過抑制Reck和Timp3的表達(dá)而激活MMP (matrixmetallopeptidase),從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力(Gabriely G, Wurdinger T, Kesari S,etal.MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinaseregulators.Mol Cell Biol.2008; 28 (17): 5369-80.XGillies 等發(fā)現(xiàn)miR-221/miR_222可通過細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞的增殖過程。Kefas等發(fā)現(xiàn)了 miR-7可以降低IRS-1 (insulinreceptor substrate I)和IRS-2等蛋白的表達(dá)，從而抑制AKT和ERK1/2的信號(GilliesJK, Lorimer IA.Regulation of p27Kipl by miRNA 221/222 in glioblastoma.CellCycle.2007 Aug 15; 6 (16):2005-9.)?經(jīng)鑒定，miRNA在多種腫瘤包括膠質(zhì)瘤中的表達(dá)譜發(fā)生變化，這為診斷和治療膠質(zhì)瘤提供新的基因靶點(diǎn)和分子標(biāo)記。
[0005]根據(jù)高通量的miRNA基因芯片和qPCR的定量分析，(Bisheng Zhou, RuihuaMab, Wenxia Si, et al.MicroRNA-503 targets FGF2 and VEGFA and inhibits tumorangiogenesis and growth.Cancer Lett 2013; 333: 159-69.Xu YY, Wu HJ, Ma HD etal.MicroRNA-503 suppresses proliferation and cell-cycle progression ofendometrioid endometrial cancer by negatively regulating cyclin Dl.FEBS J 2013;280: 3768-79.)的研究顯示，在多種腫瘤組織中hsa-miR-503的表達(dá)譜與正常組織或癌旁組織對比均發(fā)生明顯的變化。而目前尚無關(guān)于hsa-miR-503與膠質(zhì)瘤診斷和治療的報(bào)道。
[0006]綜上所述，目前迫切需要診斷和治療膠質(zhì)瘤的有效方法，而miRNA (hsa-miR-503)的發(fā)現(xiàn)和研究使其有望成為新一代診斷和治療惡性膠質(zhì)瘤的小分子靶標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供hsa-miR-503在制備治療膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的還在于提供一種治療膠質(zhì)瘤的藥物。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示hsa-miR-503可以顯著抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG的生長，促進(jìn)U87MG的凋亡，抑制U87MG的遷移和侵襲。這些結(jié)果表明hsa-miR-503可以有效降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。因此hsa-miR-503可用于膠質(zhì)瘤患者的輔助治療，用于制備治療膠質(zhì)瘤藥物。
[0010]一種治療膠質(zhì)瘤藥，包含hsa-miR-503和/或hsa-miR-503前體；其中，hsa-miR-503 序列為:UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG ；
hsa-miR-503 前體序列為:UGCCCUAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAGUGAGCGAUCG ⑶GCUCUGGG⑶ AU腳UUCCGCUGCCAGG⑶ A。
[0011]一種能表達(dá)hsa-miR-503和/或hsa-miR-503前體的載體。
[0012]qPCR (實(shí)時(shí)熒光定量PCR)檢測結(jié)果顯示hsa_miR-503在膠質(zhì)瘤組織或細(xì)胞系中呈低表達(dá)，表明hsa-miR-503可能對膠質(zhì)瘤起到抑癌作用，并且hsa-miR-503表達(dá)水平可以作為膠質(zhì)瘤診斷的指標(biāo)。
[0013]一種hsa-miR-503的檢測試劑盒:包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、miR-503和內(nèi)參的正向引物和反向引物；所述的內(nèi)參優(yōu)選為U6。該試劑盒可用于診斷膠質(zhì)瘤。
[0014]本發(fā)明相對于 現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:
(I)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 hsa-miR-503可以降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
[0015](2)Hsa-miR-503為內(nèi)源性RNA，目前在動物體內(nèi)miRNA的生物合成過程已經(jīng)得到了較為詳盡的詮釋，具有無刺激、可以將hsa-miR-503的前體序列構(gòu)建到某種載體，今后作為新型藥物用于抗膠質(zhì)瘤的臨床治療。
[0016](3)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)hsa-miR-503的表達(dá)水平可以作為膠質(zhì)瘤診斷的指標(biāo)，根據(jù)hsa-miR-503的表達(dá)水平為臨床提供診斷和治療提供依據(jù)。
[0017](4) miRNA對腫瘤診斷的準(zhǔn)確性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于mRNA,而miRNA比mRNA更有優(yōu)勢的是miRNA可用于常規(guī)福爾馬林固定，石蠟包埋的標(biāo)本。
[0018](5)本發(fā)明為膠質(zhì)瘤的診斷與治療提供了新的方向。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是qPCR檢測hsa-miR-503在人腦細(xì)胞、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及U87MG中的相對表達(dá)水平圖。
[0020]圖2是MTT法檢測hsa-miR-503對U87MG增殖影響的結(jié)果圖。
[0021]圖3是流式檢測hsa-miR-503對U87MG凋亡影響的結(jié)果圖，其中，*表示P值小于
0.05，**表示P值小于0.01。
[0022]圖4是Transwell實(shí)驗(yàn)檢測hsa-miR-503對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲影響的結(jié)果圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0024]實(shí)施例1 qPCR分析hsaiiR-503表達(dá)
Cl)細(xì)胞系:U87MG和U251人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系；兩種細(xì)胞系均來源于ATCC。
[0025]樣本準(zhǔn)備:3例正常腦組織來自武漢大學(xué)人民醫(yī)院腦外科的腦挫傷患者；7例惡性膠質(zhì)瘤組織為經(jīng)臨床病理分析為IV級膠質(zhì)瘤患者的手術(shù)標(biāo)本，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院腦外科提供且經(jīng)過病人知情和同意。-80°C凍存，液氮運(yùn)輸。
[0026](2)總RNA的提取=Trizol試劑提取細(xì)胞和組織的總RNA，Trizol試劑購自Invitrogen公司，具體步驟如下:
O向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入ImL Trizol，冰上放置lOmin，用槍頭反復(fù)吹打混勻，轉(zhuǎn)移到RNase-free的1.5mL Ep管中；或在通風(fēng)柜中取新鮮組織0.1~0.2g置于勻漿器中，加入預(yù)冷的ImL Trizol，在冰浴中迅速勻漿30秒，以充分研碎組織，然后將細(xì)胞懸浮液吸入另一 RNase-free 的 1.5mL Ep 管中，冰上靜置 lOmin。
[0027]2)加入200 μ L氯仿，劇烈震蕩30s后，室溫靜置lOmin。
[0028]3)4°C, 12000rpm離心 15min,將上層無色液體吸入至另一 RNase-free 的 1.5mL Ep管中，加入等體積異丙醇，室溫靜置lOmin。
[0029]4) 4°C, 12000rpm 離心 lOmin。
[0030]5)棄上清,用ImL 75% (v/v)乙醇洗漆沉淀。
[0031]6) 4°C, 12000rpm 離心 5min。
[0032]7)棄上清，室溫干燥lOmin，向Ep管中加入200 μ L DEPC水溶解沉淀物，于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]8)另取2 μ L RNA溶于98 μ L水中，分別測RNA的濃度和純度。
[0034]9)取5 μ L RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(2% Agarose，I X TBE),檢測RNA質(zhì)量。
[0035](3)逆轉(zhuǎn)錄:采用廣州市銳博生物科技有限公司的miR-503逆轉(zhuǎn)錄引物和Thermo的第一鏈合成試劑盒。反應(yīng)體系及條件=RNA模板2 μ g,miR-503逆轉(zhuǎn)錄引物I μ L7DEPC水補(bǔ)齊至12μ?;每管分別混勻，65°C水浴5min，冰浴2min，然后再加入IOmM dNTP Mix 2 μ L，Reaction Buffer 4 μ L, Ribolock RT I μ L, Rever Aid RT I μ L ;混勻后 42°C, 60min ;70°C，5min，置于冰上。
[0036](4)qPCR:運(yùn)用 GeneCopoeia 公司 All-1n-OneTM qPCR mix進(jìn)行 qPCR,米用 Bio-Rad公司 iCycler thermal cycler PCR 儀。
[0037]反應(yīng)體系:2XqPCR Mix 10 μ L，正向引物2 μ L，反向引物2 μ L，cDNA模板2 μ L，ddH20 4 μ Lo內(nèi)參為U6 (qPCR試劑盒、miR-503與內(nèi)參的正向引物和反向引物采購于廣州市銳博生物科技有限公司)。qPCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性10秒，60°C退火20秒，70°C延伸10秒，其中變性、退火、延伸為40個(gè)循環(huán)。
[0038]qPCR結(jié)果如圖1所示:與正常腦組織相比，惡性膠質(zhì)瘤組織或細(xì)胞系中的hsa-miR-503表達(dá)水平明顯降低,表明hsa-miR-503可能對膠質(zhì)瘤起到潛在的抑癌作用，并且hsa-miR-503表達(dá)水平可以作為膠質(zhì)瘤診斷的指標(biāo)。
[0039]實(shí)施例2 hsa-miR-503對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，選擇人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG。以轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列miR-NC(Negative Control, NC)為對照組，以轉(zhuǎn)染 hsa-miR-503 mimics (hsa-miR-503 模擬物)為實(shí)驗(yàn)組。hsa-miR-503模擬物和隨機(jī)序列均由廣州銳博生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成(hsa-miR-503 mimics 序列為 “UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG”)。
[0040](I)接種細(xì)胞:將對數(shù)生長期的U87MG細(xì)胞用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔6000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積100 μ L0
[0041](2)培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)染:待12h后細(xì)胞貼壁，轉(zhuǎn)染50nmol hsa-miR-503 mimics或NC，每組重復(fù)6個(gè)孔，370C >5% CO2培養(yǎng)1-3天。
[0042]細(xì)胞轉(zhuǎn)染具體步驟如下:接種細(xì)胞12h后，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miRNA用opt1-DMEM稀釋于1.5mL Ep中，輕敲管壁混勻；將適量的Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)稀釋于另一 1.5mL Ep管中，輕敲管壁混勻；室溫靜置10分鐘，將兩管輕柔混合均勻，室溫靜置25分鐘。同時(shí)將細(xì)胞用PBS (0.01M, pH 7.4)洗三次，再加入上述混合液并補(bǔ)充一定量opt1-DMEM，培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后，用PBS沖洗細(xì)胞三遍，換用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0043](3)呈色:分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)，72小時(shí)后，每孔加20 μ L MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清；每孔加150 μ L DMSO,振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。
[0044](4)比色:選擇570nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度，記錄結(jié)果。
[0045]MTT結(jié)果如圖2所示:與對照組相比，轉(zhuǎn)染了 hsa-miR-503 mimics的U87MG細(xì)胞增殖能力明顯降低，表明hsa-miR-503可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。
[0046]實(shí)施例3流式檢測hsa-miR-503對U87MG凋亡的影響
(I)在U87MG細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染50nmol hsa-miR-503 mimics和NC (轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例2),6小時(shí)后換液。
[0047](2)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后對細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，并用冰上預(yù)冷的PBS (0.01M,pH 7.4)重懸，各加入 5μ L Annexin V-FITC 和 10 μ L propidium iodide(PI),冰上避光靜置 10 分鐘。
[0048](3)用流式細(xì)胞儀檢測凋亡并分析結(jié)果。
[0049]結(jié)果如圖3所示:與對照組相比，轉(zhuǎn)染了 hsa-miR-503 mimics的U87MG細(xì)胞凋亡水平明顯增加,表明hsa-miR-503可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
[0050]實(shí)施例4 hsa-miR-503對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響
(O做遷移實(shí)驗(yàn)不需要在transwell小室中預(yù)先加入基質(zhì)膠，而做侵襲實(shí)驗(yàn)需要提前12小時(shí)加入100 μ L 200mg/mL的基質(zhì)膠(基質(zhì)膠為BD公司生產(chǎn))。
[0051](2)向24孔板中加入2mL，含20% (v/v)胎牛血清的DMEM，然后將transwell小室放入24孔板中。
[0052](3)向孔徑為8 μ m的transwell小室中分別加入3X IO4的U87MG細(xì)胞，用無血清的DMEM于37°C、5% CO2分別培養(yǎng)12小時(shí)(檢測遷移)和24小時(shí)(檢測侵襲)。
[0053](4)用甲醇漂洗transwell小室10分鐘，常溫放干。
[0054](5)用0.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫染色，然后用PBS (0.01M, pH 7.4)漂洗3次。
[0055](6)在200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，比較統(tǒng)計(jì)結(jié)果。[0056]結(jié)果如圖4所示:與對照組相比，轉(zhuǎn)染了 hsa-miR-503 mimics的U87MG細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，表明hsa-miR-503可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移力和侵襲力。
[0057]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi) 。
【權(quán)利要求】
1.hsa-miR-503在制備治療膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
2.一種治療膠質(zhì)瘤的藥物，其特征在于:包含hsa-miR-503和/或hsa-miR-503前體。
3.一種能表達(dá)hsa-miR-503和/或hsa-miR-503前體的載體。
4.一種hsa-miR-503的檢測試劑盒，其特征在于:包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、miR-503和內(nèi)參的正向引物和反向引物。
5.根據(jù)權(quán)利 要求4所述的hsa-miR-503的檢測試劑盒，其特征在于:所述的內(nèi)參為U6。
【文檔編號】A61P35/00GK103480004SQ201310456035
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】劉萬紅, 何小華, 陳雄, 彭碧文, 張瑩瑩 申請人:武漢大學(xué)