穩(wěn)定化的蛋白組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1R1特異性結(jié)合劑在容器中的穩(wěn)定化組合物。并提供制備和使用該組合物的方法。
【專利說明】穩(wěn)定化的蛋白組合物
[0001]本申請為分案申請，本申請的原申請為申請日為2009年2月5日、申請?zhí)枮?00980112516.2、發(fā)明名稱為“穩(wěn)定化的蛋白組合物”的申請。
[0002]本申請要求2008年2月7日提交的第61 / 065，065號美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)。第61 / 065,065號美國臨時專利申請為了任何目的通過參考全文并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明提供RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑在容器中的穩(wěn)定化組合物。并提供制備和使用該組合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]某些治療組合物包含特異性結(jié)合劑。在某些情況下，例如，為了儲存和運輸，治療組合物被放置于容器中。在某些情況下，所述的容器與儲存及運輸條件、和給藥模式相匹配，例如，包括但不限于皮下、肌肉或者靜脈注射。某些典型容器包括但不限于安瓿、一次性使用注射器，其中包括但不限于用于預(yù)填充的一次性使用注射器、和玻璃或塑料制多劑量管型瓶。在某些情況下，治療組合物被容納于預(yù)充式注射器內(nèi)，例如，制造商已將治療組合物放置于注射器內(nèi)。
[0005]在某些情況下，當(dāng)處于運輸和/或儲存條件下時，容器中的治療組合物可形成顆粒和/或表現(xiàn)出聚集。所述表現(xiàn)形成顆粒和/或聚集的組合物，在某些情況下，不適合用于給藥而必須被丟棄。在某些情況下，期望提供在容器中穩(wěn)定化的治療組合物，使之在處于運輸和/或儲存條件下時不易形成顆粒和/或聚集。
[0006]發(fā)明概述
[0007]在某些實施方案中，提供裝有包含特異性結(jié)合劑的組合物的預(yù)充式注射器，其中將該預(yù)充式注射器中所包含的特異`性結(jié)合劑為穩(wěn)定化的。
[0008]在某些實施方案中，提供裝有包含特異性結(jié)合劑的組合物的預(yù)充式注射器，其中該組合物與注射器封口之間的頂空被最小化，并且其中該預(yù)充式注射器中所包含的特異性結(jié)合劑為穩(wěn)定化的。
[0009]一種制備預(yù)充式注射器的方法，該方法包括向注射器中引入包含特異性結(jié)合劑的組合物以使該組合物與注射器封口之間的頂空最小，并且其中該預(yù)充式注射器中所包含的特異性結(jié)合劑被穩(wěn)定化。
[0010]在某些實施方案中，提供一種用于穩(wěn)定組合物中特異性結(jié)合劑的方法，其中該組合物裝在預(yù)充式注射器中，該方法包括將該組合物放置到該預(yù)充式注射器中以使該組合物與注射器封口之間的頂空最小，并且其中該預(yù)充式注射器中所包含的特異性結(jié)合劑被穩(wěn)定化。
[0011]附圖簡述
[0012]圖1顯示a RANKL-1組合物在不同蛋白濃度下，于4°C在試管中培養(yǎng)24個月，并于各時間點由非變性SEC-HPLC根據(jù)實施例1所述方案分析的穩(wěn)定性。(A)主峰百分比(單體)；(B)聚集體百分比(前峰)。
[0013]圖2顯示靜態(tài)條件下，a RANKL-1組合物在不同蛋白濃度下，于4°C在預(yù)充式路厄鎖玻璃注射器或預(yù)充式玻璃押針式注射器中培養(yǎng)24周，并在各時間點由非變性SEC-HPLC根據(jù)實施例1所述方案分析的穩(wěn)定性。
[0014]圖3顯示a RANKL-1組合物在不含聚山梨酯的制劑中，于COP塑料(Resin CZ?)預(yù)充式注射器中，在靜態(tài)條件或運輸后，在4°C培養(yǎng)4周、10周、22周、32周或者52周，并于各時間點由非變性SEC-HPLC根據(jù)實施例1所述方案分析的主峰百分比(單體)。
[0015]圖4顯示sTNFR =Fc樣品的粒度分布。該圖以強度加權(quán)粒度顯示sTNFR =Fc樣品經(jīng)過根據(jù)實施例2中所述方案的各種預(yù)填充和運輸條件后的顯微鏡下可見粒度。
[0016]圖5(A)為押針式注射器及該注射器組件的示意圖；圖5?)為預(yù)充式注射器，顯示頂空沒有被最小化的示意圖。
[0017]圖6所示為根據(jù)實施例2所述方案的包括包含a RANKL-1的組合物和頂空、或最小化的頂空的預(yù)充式注射器；(A)頂空沒有被最小化，所示頂空為4.5mm ； (B)所示為最小化頂空(左側(cè)):帶有彎液面的1.5mm最小化頂空；和(右側(cè)):帶有一個可見氣泡的最小化頂空。
[0018]圖7所示為編碼a RANKL-1抗體重鏈的cDNA序列(SEQ ID NO:1)。本圖顯示該重鏈表達質(zhì)粒中從Hind III位點到Sal I位點的DNA序列。起始密碼子開始于核苷酸14，終止密碼子開始于核苷酸1415。
[0019]圖8所示為a RANKL-1抗體重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。IgG2信號肽以下劃線標(biāo)出，可變區(qū) 以大寫字母表示且不使用下劃線，而恒定區(qū)以小寫字母表示。
[0020]圖9所示為編碼a RANKL-1抗體kappa輕鏈的cDNA序列(SEQ ID NO:3)。本圖所示為該kappa鏈表達質(zhì)粒從Xbal I位點到Sal I位點的DNA序列。起始密碼子開始于核苷酸12 ;終止密碼子開始于核苷酸717。
[0021]圖10所示為a RANKL-1抗體kappa輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。Kappa信號肽以下劃線標(biāo)出，可變區(qū)以大寫字母表示且不使用下劃線，而恒定區(qū)以小寫字母表示。
[0022]某些實施方案的詳述
[0023]本節(jié)標(biāo)題在本文僅用于組織目的，并不用于限制本節(jié)討論的主題。所有在本申請中所引用的文件或部分文件，包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍和專著，在此為了任何目的通過參考全文明確地并入本文。當(dāng)通過參考而并入的一個或多個文件或部分文件對某個術(shù)語的定義與本申請不符時，以本申請為準(zhǔn)。
[0024]重組DNA，寡聚核苷酸合成，以及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)可使用常規(guī)技術(shù)。酶反應(yīng)及純化技術(shù)可根據(jù)制造商的說明書，或根據(jù)本領(lǐng)域通常實行的，或根據(jù)本文所述進行。前述技術(shù)和實驗方案可基本上根據(jù)本領(lǐng)域已知常規(guī)方法并根據(jù)本說明書所引用并敘述的各種一般性或更具體的參考文獻的描述進行。參見例如，Samtoook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆實驗手冊)(第 2 版 Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))。除非提供具體定義，否則本申請中所述分析化學(xué)、有機合成化學(xué)、以及醫(yī)藥與制藥化學(xué)，均使用本領(lǐng)域已知并常用的術(shù)語以及實驗步驟和技術(shù)?；衔锖铣桑衔锓治?，藥物配備，配制，遞送和患者治療均可使用常規(guī)技術(shù)。[0025]在本申請中，除非另外指明，否則單數(shù)名詞的使用均涵蓋其復(fù)數(shù)意義。在本申請中，除非另外指明，否則單詞“一(“a”或者“an”)”意為“至少一個”。在本申請中，除非另外指明，否則“或(or)”意為“和/或(and / or)”。在多項從屬權(quán)利要求的上下文中，“或”僅以替代的方式指代前述多于一項的獨立或從屬權(quán)利要求。此外，使用術(shù)語“包括(including) ”及其其他形式例如包括(“includes”)和包括(“included”)不是限制。另外，除非另外具體指明，否則比如“元素(element) ”或者“成分(component) ”等術(shù)語涉及包括一個單位的元素或成分和包括多于一個單位的元素或成分二者。
[0026]NF- K B受體激活子配體(RANKL)，又稱為骨保護素配體(OPGL)，是細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)家族中的一員，通過與其受體RANK相結(jié)合而促進破骨細(xì)胞生成。在某些情況下，破骨細(xì)胞的活性增加與許多骨質(zhì)減少病癥相關(guān)，所述骨質(zhì)減少病癥包括但不限于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、佩吉特氏癥、溶解性骨轉(zhuǎn)移(lytic bone metastases)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。由此可見，RANKL的活性降低可能會導(dǎo)致破骨細(xì)胞的活性降低并可減輕骨質(zhì)減少病癥的嚴(yán)重度。已描述了 RANKL的某些特異性結(jié)合劑，包括但不限于抗體。參見例如，2004年2月19日公開的第2004 / 0033535號美國專利公布，其為了任何目的通過參考并入本文。 [0027]白細(xì)胞介素-1 (IL-1)是一種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子。在某些情況下，TNF通過與包含兩種跨膜蛋白構(gòu)成的異二聚受體復(fù)合體相互作用而刺激細(xì)胞反應(yīng)，此兩種跨膜蛋白為IL-1受體類型I(IL-1Rl)和IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)。據(jù)報導(dǎo)，IL-1首先與IL-1Rl 結(jié)合；然后 IL-1RAcP 被募集到該復(fù)合體(Greenfeder 等，1995，J.Biol.Chem.270:13757-13765 ；Yoon 和 Dinarello,1998, J.1mmunologyl60:3170-3179 ；CulIinan 等人，1998，J.1mmunologyl61:5614-5620)，隨后是導(dǎo)致引起細(xì)胞反應(yīng)的信號傳導(dǎo)。據(jù)假定，在某些情況下，通過抑制IL-1與IL-1受體(例如IL-1R1)結(jié)合從而阻止IL-1信號傳導(dǎo)可在治療上用于治療某些IL-1介導(dǎo)的疾病。在某些情況下，IL-1Rl特異性結(jié)合劑抑制IL-1與IL-1受體結(jié)合。已描述了某些IL-1Rl特異性結(jié)合劑，包括但不限于抗體。參見例如，2004年5月20日公開的第2004 / 0097712號美國專利公布，其為了任何目的通過參考并入本文。
[0028]腫瘤壞死因子-a (TNFa，又稱為惡液質(zhì)素)和腫瘤壞死因子-β (TNFβ ,又稱為淋巴毒素)是能夠在多種細(xì)胞類型中引起廣泛作用的同源哺乳動物內(nèi)分泌蛋白。結(jié)構(gòu)和功能特征上的顯著相似性使得這兩種細(xì)胞因子統(tǒng)稱為“TNF”。編碼TNF a (Pennica等，Nature312:724，1984)和 TNF β (Gray 等，Nature312:724,1984)的互補 cDNA 克隆已被分離,從而允許對TNF的結(jié)構(gòu)和生物的進一步表征。
[0029]在某些情況下，TNF蛋白通過與在對TNF反應(yīng)性的細(xì)胞的質(zhì)膜上表達的特異性TNF受體(TNF-R)蛋白的結(jié)合來引發(fā)對細(xì)胞的生物效應(yīng)。除了 TNF的細(xì)胞表面受體，人類尿液中也鑒定了能夠與TNF結(jié)合的可溶性蛋白(Peetre等,Eur.J.Haematol.41:414,
1988；Seckinger 等，J.Exp.Med.167:1511,1988 ；Seckinger 等，J.Biol.Chem.264:11966,
1989；Seckinger 等的公開第 2218101A 號英國專利申請；EngeImann 等，J.Biol.Chem.264:11974，1989)。此外，已描述某些TNF特異性結(jié)合劑和某些TNF-R特異性結(jié)合劑，包括但不限于多肽、可溶性多肽(包括但不限于可溶性融合多肽)和抗體。參見例如，Mohler等，J.1mmunol.151:1548-1561,1993 ;第5，945，397號美國專利，其為了任何目的通過參考并入本文。[0030]某些定義
[0031]根據(jù)本公開內(nèi)容使用以下術(shù)語時，除非另外指明，否則應(yīng)理解為如下意義。
[0032]術(shù)語“NF- K B受體激活子配體”或“RANKL”指通過與NF- κ B的受體激活子(“RANK”)結(jié)合而促進破骨細(xì)胞生成的多肽。RANKL又稱作“骨保護素配體”或者“0PGL”。術(shù)語“RANKL”包括RANKL的片段、和相關(guān)多肽，其包括但不限于等位變體、剪接變體、衍生變體、取代變體、缺失變體、和/或插入變體、融合多肽，以及種間同源物。在某些實施方案中，RANKL多肽包括末端殘基，例如，包括但不限于前導(dǎo)序列殘基、靶標(biāo)殘基、氨基末端甲硫氨酸殘基、賴氣酸殘基、標(biāo)簽殘基和/或融合蛋白殘基。
[0033]術(shù)語“白細(xì)胞介素-1受體類型I”或“IL-1R1”指為稱為白細(xì)胞介素-1(
的炎癥細(xì)胞因子激發(fā)的跨膜受體的多肽。術(shù)語“IL-1R1”包括IL-1Rl的片段、和相關(guān)多肽，其包括但不限于等位變體、剪接變體、衍生變體、取代變體、缺失變體、和/或插入變體、融合多肽、和種間同源物。在某些實施方案中，IL-1Rl多肽包括末端殘基，例如，包括但不限于前導(dǎo)序列殘基、靶標(biāo)殘基、氨基末端甲硫氨酸殘基、賴氨酸殘基、標(biāo)簽殘基和/或融合蛋白殘基。
[0034]術(shù)語“TNF受體”或“TNF-R”指具有天然哺乳動物TNF受體的氨基酸序列的多肽或其片段、和相關(guān)多肽，其包括但不限于等位變體、剪接變體、衍生變體、取代變體、缺失變體、和/或插入變體、融合多肽、和種間同源物。已描述了某些確定TNF-R生物活性的典型方法和測定，如在第5，945，397號美國專利，和Mohler等，J Immunol.151:1548-1561(1993)中。在某些實施方案中，TNF受體包括末端殘基，例如但不限于前導(dǎo)序列殘基、靶標(biāo)殘基、氨基末端甲硫氨酸殘基、賴氨酸殘基、標(biāo)簽殘基和/或融合蛋白殘基。TNF-R能夠與TNF配體結(jié)合。在某些實施方案中，TNF配體通過與細(xì)胞結(jié)合引發(fā)TNF-R傳導(dǎo)的生物信號。在某些實施方案中，TNF-R能夠與通過天然(也就是說，非重組)來源的TNF-R產(chǎn)生的抗TNF-R抗體結(jié)合。成熟的全長人類TNF-R為分子量大約`80千道爾頓(KDa)的糖蛋白。術(shù)語“TNF受體”或“TNF-R”包括但不限于具有至少20個氨基酸并且顯示出至少一些與TNF-R相同的生物活性的天然多肽的變體或亞基，例如，不含跨膜區(qū)(并從細(xì)胞中分泌出來)但是保持了與TNF相結(jié)合的能力的可溶性TNF-R構(gòu)建物。多種典型TNF-R，包括可溶性TNF-R，公開在例如第5，945，396號美國專利，和Mohler等，J Immunol.151:1548-1561 (1993)中。天然人類TNF-R公開在例如第 5，945，397 號美國專利，以及 Smith 等，Science248:1019-1023(1990)，Loetscher等，Cell61:351-359(1990)和 Schall 等，Cell61:361-370(1990)中。
[0035]術(shù)語“可溶性TNF-R”或“sTNF-R”指具有對應(yīng)于全部或部分天然TNF-R胞外區(qū)的氨基酸序列的多肽，例如，包括但不限于huTNF-RA 235、huTNF-RA 185和huTNF-R Λ 163，或者天然人類TNF-R氨基酸1-163、氨基酸1-185、或氨基酸1-235的變體，其生物活性表現(xiàn)為與TNF配體結(jié)合，如Smith等在Science248:1019-1023(1990)中所述的。在某些實施方案中，sTNF-R是依那西普。依那西普是一種含有連接人類IgG抗體Fe片段的p75sTNF_R的胞外結(jié)構(gòu)域的重組融合蛋白。依那西普的氨基酸序列公布于Clinical Pharmacologyand Therapeutics66 (2):209,1999,其通過參考并入本文，且該蛋白以商業(yè)名稱Enbrel?(Amgen Inc.)出售。
[0036]依照對蛋白質(zhì)命名的慣例對TNF-R和sTNF-R命名(如TNF-R)，在蛋白質(zhì)的前面加上hu (代表人類)或者mu (代表鼠)，并后綴以△(表明缺失)和C-末端的氨基酸數(shù)。例如，huTNF-R Δ 235指以Asp235作為C-端氨基酸的人類TNF-R (例如，Smith等在Science248:
1019-1023(1990)中所述的具有天然人類TNF-R的氨基酸序列1_235的多肽)。當(dāng)沒有指明任何人類或鼠物種的時候，TNF-R—般性的指哺乳動物TNF-R。類似的，在沒有任何特別指明缺失突變體的時候，術(shù)語TNF-R指所有形式的TNF-R，包括具有TNF-R生物活性的各種變體。某些典型TNF-R包括與上述序列相差一個或多個取代、缺失、或插入，并保留了與TNF結(jié)合能力，或保留了通過細(xì)胞表面結(jié)合的TNF受體蛋白抑制TNF信號傳導(dǎo)活性的能力的多肽，例如HuTNF-R Λ X，其中X選自如Smith等在Science248: 1019-1023 (1990))中所述的天然人類TNF-R的氨基酸163-235中任一個。在某些實施方案中，對鼠TNF_R( “muTNF-R”)進行類似缺失。在某些實施方案中，TNF信號傳導(dǎo)活性的抑制決定于用重組TNF-R DNA對細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染以獲得重組受體表達。在此實施方案中，接著將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與TNF接觸，并檢測所得代謝反應(yīng)。如果所測代謝反應(yīng)結(jié)果可歸因于配體的作用，則此重組受體具有信號傳導(dǎo)活性。已公開某些用于確定多肽是否具有信號傳導(dǎo)活性的典型方案，例如Idzerda等，J.Exp.Med.171:861(1990) ； Curt is 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:3045 (1989) ；Prywes等，EMBO J.5:2179(1986)和 Chou 等，J.Biol.Chem.262:1842(1987)?？蛇x地，在某些實施方案中，使用表達內(nèi)源性TNF受體并具有可測量的TNF生物反應(yīng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。
[0037]當(dāng)與氨基酸序列一起使用的時候，術(shù)語“包括”表示化合物在給定序列的N端或C端的任一端或兩端可包括額外的氨基酸。
[0038]當(dāng)涉及到多肽的時候，如果被連接的兩段或多段多肽中每一段多肽都能以其預(yù)期方式發(fā)揮功能，這兩段或多段多肽被稱為“可操作連接”。如果一段多肽在與另一多肽可操作連接時能以其預(yù)期方式發(fā)揮功能，當(dāng)其不與另一多肽可操作性連接時，該多肽可能或可能不以其預(yù)期方式發(fā)揮功能。例如，在某些實施方案中，第一多肽在沒有連接時可能不能以其預(yù)期方式發(fā)揮功能，但是當(dāng)其與第二多肽連接時達到穩(wěn)定化，以使變得能夠以其預(yù)期方式發(fā)揮功能?？蛇x地，在某些實施方案中，第一多肽在沒有連接時可能以其預(yù)期方式發(fā)揮功能，并在當(dāng)與第二多肽可操作連接時保留了這種能力。
[0039]在本文中，當(dāng)兩段或多段多肽以一個單獨連續(xù)多肽序列被轉(zhuǎn)錄或被合成的時候，這兩段或多段多肽被稱為“融合”。在某些實施方案中，兩段或多段融合多肽可能由兩段或多段可操作連接的多核苷酸編碼序列在體內(nèi)翻譯而成。在某些實施方案中，兩段或多段融合多肽可能由兩段或多段可操作連接的多核苷酸編碼序列在體外翻譯而成。
[0040]在本文中，當(dāng)每段被連接的多肽能夠以其預(yù)期方式發(fā)揮功能時，這兩段或多段多肽被稱為“可操作融合”。
[0041]在某些實施方案中，如果第一多肽含有兩段或多段不同的多肽單位，只要第一多肽中的至少一段不同的多肽單位與第二多肽連接，所述第一多肽即被視為與第二多肽連接。
[0042]在某些實施方案中，“第一多肽與第二多肽連接”的表達方式涵蓋以下情況:其中(a)第一多肽中只有一個分子與第二多肽中的僅一個分子連接；(b)第一多肽中只有一個分子與第二多肽中的多于一個分子連接；(C)第一多肽中有多于一個分子與第二多肽中的僅一個分子連接；和(d) —段多肽中有多于一個分子與第二多肽中多于一個分子連接。在某些實施方案中，當(dāng)被連接`的分子中包括第一多肽中多于一個的分子和第二多肽中僅一個分子時，第一多肽中的所述分子可能全部或部分以共價或非共價的方式與第二多肽連接。在某些實施方案中，當(dāng)被連接的分子中包括第一多肽中多于一個分子時，其中第一多肽的一個或多個分子可能以共價或非共價的方式與第一多肽中的其他分子連接。
[0043]在本文中，“柔性連接子”指本領(lǐng)域技術(shù)人員無法根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測固定在三維空間中的任何連接子。在某些實施方案中，包括三個或多個氨基酸的肽連接子為柔性連接子。
[0044]當(dāng)涉及到多肽的時候，當(dāng)?shù)谝欢嚯呐c一段或多段多肽融合，可操作融合，連接，和/或可操作連接的時候，此兩段或多段多肽被稱為“附加”在一起。
[0045]術(shù)語“特異性結(jié)合劑”用以指與靶標(biāo)特異性結(jié)合的天然或非天然的分子。特異性結(jié)合劑的實例包括但不限于蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂類和小分子化合物。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白片段。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗體。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗原結(jié)合區(qū)。
[0046]術(shù)語“RANKL特異性結(jié)合劑”指特異性結(jié)合于RANKL任何部分的特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白片段。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑為RANKL的抗體。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗原結(jié)合區(qū)。
[0047]術(shù)語“IL-1R1特異性結(jié)合劑”指特異性結(jié)合于IL-1Rl任何部分的特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，IL-1Rl特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白。在某些實施方案中，IL-1Rl特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白片 段。在某些實施方案中，IL-1Rl特異性結(jié)合劑為IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗原結(jié)合區(qū)。
[0048]術(shù)語“TNF特異性結(jié)合劑”指特異性結(jié)合于TNF任何部分的特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，TNF特異性結(jié)合劑為多肽。在某些實施方案中，TNF特異性結(jié)合劑為可溶性多肽。在某些實施方案中，TNF特異性結(jié)合劑為可操作地融合第二多肽的可溶性多肽，其中第二多肽不是TNF特異性結(jié)合劑。例如，所述第二多肽包括但不限于Fe和Fe片段。在某些實施方案中，TNF特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白。在某些實施方案中，TNF特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白片段。在某些實施方案中，TNF特異性結(jié)合劑為TNF的抗體。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗原結(jié)合區(qū)。
[0049]術(shù)語“TNF-R特異性結(jié)合劑”指特異性結(jié)合于TNF-R任何部分的特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，TNF-R特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白。在某些實施方案中，TNF-R特異性結(jié)合劑為免疫球蛋白片段。在某些實施方案中，TNF-R特異性結(jié)合劑為TNF-R的抗體。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗原結(jié)合區(qū)。
[0050]術(shù)語“特異性結(jié)合”指特異性結(jié)合劑以比與非靶標(biāo)結(jié)合更高的親和性與靶標(biāo)結(jié)合的能力。在某些實施方案中，特異性結(jié)合指以比對非靶標(biāo)結(jié)合高至少10、50、100、250、500或1000倍的親和性與靶標(biāo)結(jié)合。在某些實施方案中，親和性由ELISA測定法確定。在某些實施方案中，親和性由BIAeore?測定法確定。在某些實施方案中，親和性由動力學(xué)方法確定。在某些實施方案中，親和性由均衡溶液方法(equilibrium / solution method)確定。
[0051]術(shù)語“靶標(biāo)”指能夠被特異性結(jié)合劑結(jié)合的分子或分子的一部分。在某些實施方案中，靶標(biāo)可能有一個或多個表位。在某些實施方案中，靶標(biāo)為抗原。
[0052]術(shù)語“表位”指能夠被特異性結(jié)合劑結(jié)合的分子的一部分。典型表位可包括任何能夠與免疫球蛋白和/或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合的多肽決定簇。典型表位決定簇包括但不限于具有化學(xué)活性的分子表面群集，例如，但不限于，氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；突酋；?。在某些實施方案中，表位決定簇可能具有特定三維結(jié)構(gòu)特征、和/或特定電荷特征。在某些實施方案中，表位是被抗體結(jié)合的抗原區(qū)。表位可以是連續(xù)或不連續(xù)的。在某些實施方案中，當(dāng)表位包含與用來生成抗體的表位相似的三維結(jié)構(gòu)，但不包含，或者只包含用于生成抗體的表位中一部分氨基酸殘基的時候，所述表位稱之為模擬的。
[0053]“抗體”或“抗體肽”均指完整抗體、或其片段。在某些實施方案中，所述片段包括完整抗體的連續(xù)的幾個部分。在某些實施方案中，所述片段包括完整抗體的不連續(xù)的幾部分。在某些實施方案中，抗體片段可以是與完整抗體相競爭進行特異性結(jié)合的結(jié)合片段。術(shù)語“抗體”還涵蓋多克隆抗體和單克隆抗體。在某些實施方案中，結(jié)合片段由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。在某些實施方案中，結(jié)合片段由酶切割或化學(xué)切割完整抗體產(chǎn)生。結(jié)合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab) 2、Fv、scFv、最多體(maxbodies)和單鏈抗體。非抗原結(jié)合片段包括但不限于Fe片段。
[0054]術(shù)語“多克隆抗體”指與同一抗原上不同表位結(jié)合的異源混合抗體。
[0055]術(shù)語“單克隆抗體”指一系列由同一個核酸分子編碼的抗體。在某些實施方案中，單克隆抗體由單獨的雜交瘤或其他細(xì)胞系，或由轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生。單克隆抗體通常識別同一個表位。術(shù)語“單克隆”不限制任何用來生成抗體的具體方法。
[0056]“嵌合抗體”指第一種物種的抗體可變區(qū)融合于另一分子，比如另一第二種物種抗體恒定區(qū)的抗體。參見例如第4，816, 567號美國專利，和Morrison等，ProcNatlAcadSci (USA)，81:6851-6855 (1985)。在某些實施方案中，所述第一種物種可能有別于第二種物種。在某些實施方案中，所述第一種物種可能與第二種物種相同。在某些實施方案中，嵌合抗體是CDR嫁接抗體。
[0057]術(shù)語“⑶R嫁接抗體 ”指其中一個抗體的⑶R插入到另一個抗體的框架中的抗體。在某些實施方案中，CDR所來源的抗體與框架所來源的抗體來自于不同物種。在某些實施方案中，CDR所來源的抗體與框架所來源的抗體來自于不同的同種型。
[0058]術(shù)語“多特異性抗體”指含有兩個或多個與不同表位結(jié)合的可變區(qū)的抗體。所述表位可能在相同或不同靶標(biāo)上。在某些實施方案中，多特異性抗體是“雙特異性抗體”，識別相同或不同抗原上兩個不同的表位。
[0059]術(shù)語“催化抗體”指附有一個或多個催化部分的抗體。在某些實施方案中，催化抗體為細(xì)胞毒性抗體，其中包含細(xì)胞毒性部分。
[0060]術(shù)語“人源化抗體”指全部或部分抗體框架來源于人類，但是一個或多個CDR區(qū)的全部或部分來源于其他物種(比如，包括但不限于小鼠)的抗體。
[0061]術(shù)語“完全人類抗體”指其中CDR與框架均大體上由人類序列構(gòu)成的抗體。在某些實施方案中，完全人類抗體由非人類哺乳動物產(chǎn)生，包括但不限于小鼠、大鼠和兔類。在某些實施方案中，完全人類抗體由雜交瘤細(xì)胞生成。在某些實施方案中，完全人類抗體由重組產(chǎn)生。
[0062]術(shù)語“重鏈”包括具有足夠的可變區(qū)序列以賦予對靶標(biāo)的特異性的任何多肽。全長重鏈包括一個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VH，和三個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域Ch1、Ch2和Ch3。所述Vh結(jié)構(gòu)域位于該多肽的氨基末端，而所述(^3結(jié)構(gòu)域位于羧基末端。本文所用術(shù)語“重鏈”包含全長重鏈及其片段。
[0063]術(shù)語“輕鏈”包括具有足夠的可變區(qū)序列以賦予對靶標(biāo)的特異性的任何多肽。全長輕鏈包括一個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域'，和一個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域Q。如同重鏈一樣，輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域位于該多肽的氨基末端。本文所用術(shù)語“輕鏈”包括全長輕鏈及其片段。
[0064]術(shù)語“Fab片段”指含有一條輕鏈和一條重鏈的ChI和可變區(qū)的抗體。該Fab片段的重鏈不能與另一個重鏈形成二硫鍵。在某些實施方案中，該Fab片段的重鏈與另一 Fab片段的輕鏈形成二硫鍵。
[0065]術(shù)語“Fab’片段”指含有一條輕鏈、一條重鏈的ChI區(qū)和可變區(qū)、以及位于重鏈中ChI和Ch2結(jié)構(gòu)域之間的一些恒定域的抗體。在某些實施方案中，F(xiàn)ab’片段的兩條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵從而形成F(ab’)2分子。
[0066]術(shù)語“F(ab’)2分子”指由兩段Fab’片段組成的抗體，并且所述兩段Fab’片段以兩條重鏈間形成的鏈間二硫鍵相連接。 [0067]“Fv分子”包含重鏈和輕鏈的可變區(qū)，但是缺乏恒定區(qū)。單鏈可變片段(scFv)包括一條重鏈和一條輕鏈的可變區(qū)，其中，所述重鏈與輕鏈可變區(qū)融合以形成單獨的多肽鏈，并形成抗原結(jié)合區(qū)。在某些實施方案中，scFv包括單獨多肽鏈。單鏈抗體包括scFv。在某些實施方案中，單鏈抗體包括一個或多個融合于scFv的額外多肽。典型額外多肽包括但不限于一個或多個恒定區(qū)。典型單鏈抗體已被探討在，例如W088 / 01649以及第4，946，778號和第5，260，203號的美國專利。
[0068]術(shù)語“最多體”指融合(可能通過連接子或者直接附加)于Fe或Fe片段的scFc。在某些實施方案中，單鏈抗體為最多體。在某些實施方案中，單鏈抗體為結(jié)合于HGF的最多體。典型Ig-樣結(jié)構(gòu)域-Fe融合體于第6，117, 655號美國專利中公布。
[0069]“Fe片段”包含重鏈的Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域，并含有位于ChI和CH2結(jié)構(gòu)域之間的一些恒定區(qū)，由此兩條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵。
[0070]術(shù)語“可變區(qū)”和“可變結(jié)構(gòu)域”在本文可交換使用，用以指抗體的輕鏈和/或重鏈的一部分。在多種情況下，可變結(jié)構(gòu)域包括重鏈中大約氨基端的120-130個氨基酸和輕鏈中氨基端的約100-110個氨基酸。在某些實施方案中，即使在同物種抗體中，不同抗體的可變區(qū)的氨基酸序列大有不同。在多種情況下，抗體的可變區(qū)決定該抗體對靶標(biāo)的特異性。
[0071]術(shù)語“抗原結(jié)合片段”指包含免疫球蛋白重鏈的至少一個可變結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白輕鏈的至少一個可變結(jié)構(gòu)域的多肽片段。在某些實施方案中，抗原結(jié)合片段能夠與配體結(jié)合，從而阻止該配體與其受體結(jié)合，由此干擾由該配體與受體結(jié)合所引發(fā)的生物反應(yīng)。在某些實施方案中，抗原結(jié)合片段能夠與受體結(jié)合，從而阻止該配體與其受體結(jié)合，由此干擾由配體與該受體結(jié)合所引發(fā)的生物反應(yīng)。在某些實施方案中，抗原結(jié)合片段能夠與受體結(jié)合并激活該受體。在某些實施方案中，抗原結(jié)合片段能夠與受體結(jié)合并滅活該受體。
[0072]當(dāng)對于某物體使用術(shù)語“自然產(chǎn)生”時，指該物體可以在自然界中被發(fā)現(xiàn)。例如，存在于有機體(包括病毒)中，可從自然來源分離且未被實驗室中人為修飾或以其它方式修飾的多肽或多核苷酸序列是自然產(chǎn)生的。
[0073]術(shù)語“分離的多核苷酸”指源于基因組、cDNA、或者合成、或上述一些組合的多核苷酸，因其來源，該“分離的多核苷酸”:(I)不與自然界中發(fā)現(xiàn)含有該“分離的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分相關(guān)，(2)與在自然界中不相連接的多核苷酸連接，或(3)不是自然界中更長序列的一部分。
[0074]術(shù)語“可操作連接”指以允許其以預(yù)期方式發(fā)揮功能而關(guān)聯(lián)的組分。例如，涉及到多核苷酸序列的時候，當(dāng)調(diào)控序列與編碼序列彼此相連接使得該編碼序列能在與調(diào)控序列功能相容的條件下進行表達時，該調(diào)控序列即稱為與該編碼序列“可操作性連接”。
[0075]術(shù)語“調(diào)控序列”指可影響相聯(lián)系的編碼序列的表達與加工的多核苷酸序列。所述調(diào)控序列的性質(zhì)可根據(jù)其宿主生物體而不同。某些典型的原核調(diào)控序列包括但不限于啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。某些典型的真核調(diào)控序列包括但不限于啟動子、增強予和轉(zhuǎn)錄終止序列。在某些實施方案中，“調(diào)控序列”可包括前導(dǎo)序列和/或融合伴侶序列。
[0076]術(shù)語“分離的多肽”和“分離的肽”指任何多肽，其(I)不包含至少一些在正常情況下會包含的一些蛋白，(2)本質(zhì)上不含有同一來源例如，同一物種的其他蛋白，(3)在不同物種的細(xì)胞中表達，或(4)在自然界中不存在。
[0077]術(shù)語“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本文中可交換使用，用于指兩個或多個氨基酸相互以肽鍵或修飾過的肽鍵連接的多聚體，例如，肽等排體。前述術(shù)語用于含有天然形成的氨基酸的氨基酸多聚體和含有一個或多個非天然形成氨基酸或天然形成氨基酸的化學(xué)類似物的氨基酸多聚體。氨基酸多聚體可能含有一個或多個被一種或多種天然加工(例如翻譯后加工)修飾過的氨基酸殘基，和/或一個或多個被一種或多種本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾過的氨基酸殘基。
[0078]在本文中，二十種常規(guī)氨基酸及其簡寫依照慣例。參見例如Immunology--ASynthesis (免疫學(xué)-合成)(第二版，E.S.Golub 和 D.R.Gren 編著，Sinauer Associates,Sunderland, Mass.(1991))。在某些實施方案中，一種或多種非常規(guī)氨基酸可被并入多肽。術(shù)語“非常規(guī)氨基酸”指任何不屬于二十種常規(guī)氨基酸的氨基酸。術(shù)語“非天然生成氨基酸”指自然界沒有的氨基酸。非天然形成的氨基酸是非常規(guī)氨基酸的一個子集。非常規(guī)氨基酸包括但是不限于，二十種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸，例如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、高絲氨酸、高半胱氨酸、4-羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、ε -N, N, N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ -N-甲基精氨酸、和本領(lǐng)域已知的其他相似的氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。在本文中所使用的多肽標(biāo)記法中，左手方向是氨基末端方向，而右手方向是羧基末端方向，與慣用和常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)一致。
[0079]參考多肽的“片段”，指來自參考多肽中任何一部分的連續(xù)氨基酸段。片段可為小于參考多肽長度的任意長度。
[0080]參考多肽的“變體”指相對于參考多肽含有一個或多個氨基酸取代、缺失或插入的多肽。在某些實施方案中，參考多肽的變體具有改變了的翻譯后修飾位點(例如，糖基化位點)。在某些實施方案中，參考多肽的變體具有改變了的二硫鍵連接。在某些實施方案中，參考多肽及其變體均為特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，參考多肽及其變體均為抗體。
[0081]參考多肽的變體包括但不限于糖基化變體。糖基化變體包括相對于參考多肽其糖基化位點的數(shù)目或類型被改變的變體。在某些實施方案中，參考多肽的糖基化變體包括相對參考多肽含有更多或更少數(shù)目的N-連接糖基化位點的變體。在某些實施方案中，N-連接糖基化位點以序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr為特征，其中，以X表示的氨基酸殘基可為除脯氨酸以外的任何氨基酸殘基。在某些實施方案中，參考多肽的糖基化變體包括N-連接碳水化合物鏈的重排，其中一個或多個N-連接糖基化位點(尤其是天然形成的糖基化位點)被缺失并生成一個或多個新的N-連接位點。
[0082]參考多肽的變體包括但不限于半胱氨酸變體。在某些實施方案中，半胱氨酸變體包括參考多肽中一個或多個半胱氨酸由一個或多個非半胱氨酸殘基取代的變體；和/或參考多肽中一個或多個非半胱氨酸由一個或多個半胱氨酸殘基取代的變體。在某些實施方案中，當(dāng)特定多肽必須被重折疊成為具有生物活性的構(gòu)象時，例如在分離不可溶包涵體后，半胱氨酸變體可以是有用的。在某些實施方案中，參考多肽的半胱氨酸變體包含相對參考多肽較少的半胱氨酸殘基。在某些實施方案中，參考多肽的半胱氨酸變體包含偶數(shù)的半胱氨酸從而使得不配對半胱氨酸的相互作用最小。在某些實施方案中，半胱氨酸變體比天然蛋白含有更多半胱氨酸殘基。 [0083]在某些實施方案中，對特定抗體的重鏈和輕鏈進行保守性修飾(以及對其編碼核苷酸進行相應(yīng)修飾)將會產(chǎn)生功能和化學(xué)性質(zhì)與原抗體相類似的抗體。相反，在某些實施方案中，對特定抗體在功能上和/或化學(xué)性質(zhì)上進行大致修飾可如下列所述實現(xiàn):選擇在重鏈和輕鏈氨基酸序列中對保持以下方面具有顯著不同作用的取代:(a)所取代區(qū)的分子主鏈結(jié)構(gòu)，例如，折疊或螺旋狀構(gòu)象，(b)該分子在靶標(biāo)位點的電荷或疏水性，或(C)大部分支鏈。
[0084]某些期望氨基酸取代(無論保守或非保守)可在需要所述取代時由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。在某些實施方案中，氨基酸取代可用于鑒定特定抗體的重要殘基，比如可增加或減少抗體親和性或抗體效應(yīng)子作用的殘基。
[0085]在某些實施方案中，抗體的效應(yīng)可由測量疾病癥狀的量的減少來進行評估。在某些實施方案中，感興趣的疾病可能由病原體引起。在某些實施方案中，疾病可在動物宿主中以其他方法建立，包括引入某種物質(zhì)(比如致癌物)和遺傳操縱。在某些實施方案中，抗體的效應(yīng)可由檢測動物宿主中一種或多種副反應(yīng)來進行評估。術(shù)語“副反應(yīng)”包括但不限于出現(xiàn)在接受了抗體的動物宿主中但沒有出現(xiàn)在未接受該抗體的動物宿主中的有害反應(yīng)。在某些實施方案中，副反應(yīng)包括但不限于發(fā)燒、對抗體的免疫反應(yīng)、炎癥、和/或動物宿主的死亡。
[0086]抗原的多種特異性抗體可由多種方法產(chǎn)生。在某些實施方案中，含有感興趣表位的抗原可被引入動物宿主(例如小鼠)，從而產(chǎn)生對該表位有特異性的抗體。在某些情況下，對感興趣表位特異性的抗體可從自然暴露于該表位的宿主的生物樣品中獲得。在某些情況下，在小鼠中引入內(nèi)源Ig基因已被滅活的人源免疫球蛋白(Ig)基因座可提供獲取人類單克隆抗體(MAb)的機會。
[0087]術(shù)語“劑”在此用于標(biāo)示化學(xué)化合物、化學(xué)化合物混合物、生物分子、生物大分子或生物物質(zhì)提取物。
[0088]術(shù)語“穩(wěn)定劑”指在組合物中使特異性結(jié)合劑穩(wěn)定的劑。如果相較不含穩(wěn)定劑的組合物，在含有穩(wěn)定劑的組合物中特異性結(jié)合劑保留了更多的物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性，則該特異性結(jié)合劑被視為已在組合物中“被穩(wěn)定化”。
[0089]當(dāng)特異性結(jié)合劑處在容器中，例如注射器中包含的組合物中時，如果該特異性結(jié)合劑在經(jīng)歷以下文件所述的一種或多種模擬運輸條件的實驗測試后，仍保留至少相同或相似的物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性，則該特異性結(jié)合劑已“被穩(wěn)定化”:Singh, J., S.P.Singh 和 G.Burgess, Measurement and Analysis of US Truck Vibrationfor Leaf Spring and Air Ride Suspensions and Development of Test Tests (測量與分析美國Leaf Spring貨車震動和懸空掛置系統(tǒng)與測試的開發(fā))，Packaging Technologyand Science,第 19 卷，2006 !International Safe Transit Association (ISTA) ResourceBook2006，Test Procedure3A (國際安全運輸協(xié)會(ISTA)教學(xué)資源書2006，測試步驟3A)；Singn, S.P.和 J.Marcondes, “Vibration Levels in Commercial Truck Shipments as aFunction of Suspension and Payload(商業(yè)貨車運輸中的震動水平是懸掛和有效負(fù)荷的函數(shù))，，，Journal of Testing and Evaluation, ASTM,第 20 卷，第 6 號，466-469,1992 ;Kipp,William 1.,Vibration Testing Equivalence,How Many Hours Of Testing EqualsHow Many Miles 0fTransport?(震動測試等值,多少小時的測試等同于多少英里的運輸？)ISTA2OOO 會議學(xué)報)；Rouillard, V., A New Approach to Analyzing and SimulatingShock and Vibration, Proceedings of Dimensions06 ( 一種用于分析和模擬碰撞和震動的新方法)，國際安全運輸協(xié)會06會議學(xué)報，East Lansing, MI48823，2006 ；Singh, S.P.，G.Burgess和P.Rojuckarin,“Test Protocol for Simulating Truck and Rail Vibrationand Rail Impacts in Shipments of Automotive Engine Racks (模擬貨車和火車震動的測試程序以及火車對機動車引擎架的運輸?shù)挠绊?”，Packaging Technology andScience,第 8 卷，33-41,1995 ；Brandenburg 和 Lee.(2001).Fundamentals of PackagingDynamics (包裝動力學(xué)基礎(chǔ))L.A.B.Equipment Inc.:Skaneateles, NY ;和 Singh, S.P.，G.Burgess,Marcondes,Jorge A., and Antle,John R.,“Measuring the Package ShippingEnvironment in Refrigerated Ocean Vessels (測量在冷藏越洋船上的包裝運輸環(huán)境)”，Packaging Technology and Science,第 6 卷，175-181,1993。如果特異性結(jié)合劑在經(jīng)歷至少一種測試后，仍保留至少相同或相似的物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性，即使其中一個或多個特 性未保留，則該被放置于容器中的組合物中的特異性結(jié)合劑仍被視為已“被穩(wěn)定化”。在某些實施方案中，所述實驗測試包括震動、碰撞/墜落、和/或壓力改變以模擬航空和/或陸地運輸。所述實驗測試還包括一個對照組，其中容器中包含的該特異性結(jié)合劑不經(jīng)歷震動、碰撞/墜落、和/或壓力改變。經(jīng)歷震動、碰撞/墜落、和/或壓力改變以模擬航空和/或陸地運輸后，確定該特異性結(jié)合劑的物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性并與對照組的物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性相比較。在某些實施方案中，如果特異性結(jié)合劑適于作為用于人類的藥物，則該特異性結(jié)合劑被認(rèn)為保留了至少相同或相似的物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性。
[0090]當(dāng)使用穩(wěn)定劑時，短語“保留其物理穩(wěn)定性”意為:相比于不含穩(wěn)定劑的組合物，含有穩(wěn)定劑的組合物中的特異性結(jié)合劑表現(xiàn)出較少的聚集和/或沉淀和/或變性。短語“保留其物理穩(wěn)定性”也意為:經(jīng)歷過第84段所述的模擬運輸條件的一種或多種實驗測試后，被放置于某一類型容器(例如，注射器)內(nèi)的組合物中的特異性結(jié)合劑表現(xiàn)出相同或相似或較少的聚集和/或沉淀和/或變性。如果特異性結(jié)合劑在經(jīng)歷至少一種測試后，即使其中一種或多種特性不相同或相似或較少，但特異性結(jié)合劑表現(xiàn)出相同或相似或較少的聚集和/或沉淀和/或變性，則該被放置于容器內(nèi)的組合物中的特異性結(jié)合劑被視為保留了其物理穩(wěn)定性。在某些實施方案中，放置于某一類型容器內(nèi)(例如，注射器)的組合物，在經(jīng)歷了模擬運輸條件的實驗測試，隨后靜態(tài)條件下的儲存之后，與放置于同樣類型容器中，在靜態(tài)條件下儲存但不經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試的組合物中的特異性結(jié)合劑相比，表現(xiàn)出相同或相似較少的聚集和/或沉淀和/或變性。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，隨后儲存于溫度介于2°C和8°C之間的靜態(tài)條件下。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，儲存于溫度介于15°C和45°C之間的靜態(tài)條件下。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物未經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試，于靜態(tài)條件下儲存于溫度介于_20°C和_80°C之間的冷凍柜。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，在靜態(tài)條件下儲存至少I個月到至少24個月。典型儲存期包括但不限于至少I個月、至少3個月、至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月、和至少24個月。典型的確定特異性結(jié)合劑的聚集和/或沉淀和/或變性量的方法，包括但不限于目測；通過光透法對顯微鏡下可見顆粒計數(shù)，例如，使用HIAC(Royco)儀器；顯微鏡顆粒計數(shù)；分子篩高效液相層析法(SEC-HPLC)JPSDS-PAGE。當(dāng)使用上述至少一種方法確定時，如果特異性結(jié)合劑表現(xiàn)出相同或相似或較少的聚集和/或沉淀和/或變性，即使其中一種或多種特性不是相同或相似或較少，則放置于容器內(nèi)的組合物中的該特異性結(jié)合劑被視為保留了其物理穩(wěn)定性。在某些實施方案中，如果特異性結(jié)合劑適于作為用于人類的藥物，則該特異性結(jié)合劑被認(rèn)為顯示了相同或相似或較少的聚集和/或沉淀和/或變性。
[0091] 當(dāng)使用穩(wěn)定劑時，短語“保留其化學(xué)穩(wěn)定性”意為:相比于不含穩(wěn)定劑的組合物，含有穩(wěn)定劑的組合物中的特異性結(jié)合劑表現(xiàn)出較少的化學(xué)變化。短語“保留其化學(xué)穩(wěn)定性”也意為:經(jīng)歷過第84段所述的模擬運輸條件的一種或多種實驗測試后，放置于某一類型容器(例如，注射器)內(nèi)的組合物中的特異性結(jié)合劑表現(xiàn)出相同或類似或較少的化學(xué)變化?；瘜W(xué)變化的實例包括但不限于大小改變，例如，包括但不限于剪切(clipping)。剪切指切割特異性結(jié)合劑以得到更小片段。在某些實施方案中，剪切是蛋白水解的結(jié)果?；瘜W(xué)變化的實例包括但不限于電荷改變，例如包括但不限于脫酰胺作用?；瘜W(xué)變化的實例包括但不限于親水/疏水改變，例如包括但不限于氧化作用?；瘜W(xué)變化的實例包括但不限于異構(gòu)化。如果特異性結(jié)合劑在經(jīng)歷至少一種測試后，即使其中一種或多種化學(xué)變化不是相同或相似或較少，但特異性結(jié)合劑表現(xiàn)出相同或相似或較少的任何類型的化學(xué)變化，則該放置于容器內(nèi)的組合物中的特異性結(jié)合劑被視為保留了其化學(xué)穩(wěn)定性。在某些實施方案中，放置于某一類型容器內(nèi)(例如，注射器)的組合物，在經(jīng)歷了模擬運輸條件的實驗測試，隨后靜態(tài)條件下的儲存之后，與放置于同樣類型容器中，在靜態(tài)條件下儲存但不經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試的組合物中的特異性結(jié)合劑相比，表現(xiàn)出相同或相似或較少的化學(xué)變化。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，儲存于溫度介于2°C和8°C之間的靜態(tài)條件下。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，儲存于溫度介于15°C和45°C之間的靜態(tài)條件下。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物未經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試，于靜態(tài)條件下儲存于溫度介于-20°C和-80°C之間的冷凍柜。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，在靜態(tài)條件下儲存至少I個月到至少24個月。典型儲存期包括但不限于至少I個月、至少3個月、至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月、和至少24個月。典型的確定特異性結(jié)合劑的化學(xué)變化量的方法，包括但不限于陽離子交換-HPLC、反相-HPLC、SDS-PAGE、和肽圖譜。當(dāng)使用上述至少一種方法確定時，如果特異性結(jié)合劑表現(xiàn)出相同或相似或較少的化學(xué)變化，即使其中一種或多種化學(xué)變化不是相同或相似或較少，則放置于容器內(nèi)的組合物中的該特異性結(jié)合劑被視為保留了其化學(xué)穩(wěn)定性。在某些實施方案中，如果特異性結(jié)合劑適于作為用于人類的藥物，則該特異性結(jié)合劑被認(rèn)為顯示了相同或相似或較少的化學(xué)變化。
[0092]當(dāng)使用穩(wěn)定劑時，短語“保留其生物活性”意為:相比于不含穩(wěn)定劑的組合物，含有穩(wěn)定劑的組合物中的特異性結(jié)合劑在組合物制備后的指定時間表現(xiàn)出更高生物活性。短語“保留其生物活性”也意為:在經(jīng)歷過第84段所述的模擬運輸條件的一種或多種實驗測試后，放置于某一類型容器(例如，注射器)內(nèi)的組合物中的特異性結(jié)合劑在組合物制備后的給定時間表現(xiàn)出相同或類似的生物活性。如果特異性結(jié)合劑在經(jīng)歷至少一種測試后，即使其中一個或多個類型的生物活性在組合物制備后的給定時間不是相同或相似，但特異性結(jié)合劑在組合物制備后的給定時間表現(xiàn)出相同或相似的任何類型的生物活性，則該放置于容器內(nèi)的組合物中的特異性結(jié)合劑被視為保留了其生物活性。在某些實施方案中，放置于某一類型容器內(nèi)(例如，注射器)的組合物，在經(jīng)歷了模擬運輸條件的實驗測試，隨后靜態(tài)條件下的儲存之后，與放置于同樣類型容器中，在靜態(tài)條件下儲存但不經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試的組合物中的特異性結(jié)合劑相比，在組合物制備后的給定時間表現(xiàn)出相同或相似生物活性。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，儲存于溫度介于2°C和8°C之間的靜態(tài)條件下。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，儲存于溫度介于15°C和45°C之間的靜態(tài)條件下。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物未經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試，于靜態(tài)條件下儲存于溫度介于_20°C和-80°C之間的冷凍柜。在某些實施方案中，放置于容器中的組合物經(jīng)歷模擬運輸條件的實驗測試后，在靜態(tài)條件下儲存至少I個月到至少24個月。典型儲存期包括但不限于至少I個月、至少3個月、至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月、和至少24個月。在某些實施方案中，生物活性由合適的確定生物活性的測定確定。典型的確定特異性結(jié)合劑的生物活性的測定包括但不限于抗原結(jié)合測定和受體磷酸化測定。典型的抗原結(jié)合測定包括但不限于ELISA測定、免疫沉淀測定和親和性測定，例如，包括但不限于BIAcore?測定。某些典型的用于確定RANKL特異性結(jié)合劑的生物活性的方法和測定已描述在，例如公開于2004年2月19日的第2004 / 0033535號美國專利公布。某些典型的用于確定IL-1Rl特異性結(jié)合劑的`生物活性的方法和測定已描述在，例如公開于2004年5月20日的第2004 / 0097712號美國專利公布。某些典型的用于確定TNF特異性結(jié)合劑和TNF-R特異性結(jié)合劑的生物活性的方法和測定已描述在，例如第5，945，397號美國專利。當(dāng)使用至少一種測定確定時，如果特異性結(jié)合劑在組合物制備后給定時間表現(xiàn)出至少相同或相似的任何類型的生物活性，即使如一種或多種測定確定的，其中一種或多種類型的生物活性在組合物制備后給定時間不是相同或相似，則放置于容器內(nèi)的組合物中的該特異性結(jié)合劑被視為保留了其生物活性。在某些實施方案中，如果特異性結(jié)合劑適于作為用于人類的藥物，則該特異性結(jié)合劑被認(rèn)為在組合物制備后的給定時間顯示了至少相同或相似的生物活性。
[0093]在某些實施方案中，生物活性的TNF受體能夠以每nmol受體上結(jié)合多于0.1nmolTNF的比例結(jié)合。在某些實施方案中，生物活性的TNF受體在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定中，能夠以每nmol受體結(jié)合多于0.5nmolTNF的比例結(jié)合。某些典型的用于確定TNF和TNF-R結(jié)合的結(jié)合測定和方法已描述在，例如第5，945，397號美國專利中。
[0094]“聚集”指個體蛋白分子通過共價或非共價作用形成多聚體。聚集也指顆粒的形成。顆粒也為肉眼可見或顯微鏡可見。顯微鏡可見顆粒的粒度在2μΜ與ΙΟΟμΜ之間。肉眼可見顆粒的粒度大于100 μ Μ。聚集可為可逆或不可逆的。在某些情況下，當(dāng)失去三級結(jié)構(gòu)或者發(fā)生部分解折疊的時候，通常情況下隱藏在折疊蛋白結(jié)構(gòu)中的疏水氨基酸殘基被暴露于溶液。在某些情況下，上述變化促進個體蛋白分子間的疏水-疏水相互作用，導(dǎo)致聚集。例如，Srisailam等人,在J Am Chem Socl24(9):1884-8 (2002)中已確定，蛋白的某些構(gòu)象變化伴隨著聚集，并且特定蛋白的某些區(qū)域可被鑒定為特別對聚集體的形成負(fù)責(zé)。在某些情況下，蛋白聚集可由加熱(Sun等人，J Agric Food Chem50 (6): 1636-42 (2002))、有機溶劑(Srisailam等人，同上)，和試劑比如SDS和溶血磷脂(Hagihara等人，Biochem41 (3):
1020-6(2002))引發(fā)。在體外蛋白純化和配制中，聚集可能成為一個嚴(yán)重問題。在某些情況下，聚集體形成后，需要以強變性劑溶解后進行復(fù)性和正確的再折疊以恢復(fù)其生物活性。
[0095]“變性”指多肽三維結(jié)構(gòu)的改變。多肽的三維結(jié)構(gòu)包括但不限于二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)指多肽中一部分的局部構(gòu)象。某些典型的二級結(jié)構(gòu)包括但是不限于，α螺旋；β構(gòu)象、β折疊、和β轉(zhuǎn)角。三級結(jié)構(gòu)指多肽中原子的整體三維排列。在某些情況下，三級結(jié)構(gòu)包括線性序列上相隔很遠(yuǎn)的氨基酸之間的相互作用。在某些情況下，三維結(jié)構(gòu)的改變致使多肽部分或全部解折疊。在某些情況下，三維結(jié)構(gòu)的改變足以引起多肽全部或部分功能喪失。在某些具體情況下，將多肽暴露于以下一種或多種條件可引起變性:加熱；極端PH值；有機溶劑，包括但不限于醇類和酮類；去垢劑，包括但不限于SDS ;和離液試劑，包括但不限于尿素和鹽酸胍。在某些情況下，將多肽暴露于容器表面可引起多肽變性，例如，包括但不限于由玻璃、不銹鋼、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(Teflon?)、聚氨酯、硅酮、聚氯乙烯、乙烯醋酸乙烯酯、聚酯、和聚烯烴制成的容器。在某些情況下，將多肽暴露于容器封口表面可引起多肽變性，例如，包括但不限于由硅酮、丁基橡膠、氟碳、和鎢制成的容器封口。在某些情況下，將多肽暴露于界面可引起多肽變性，例如，包括但不限于氣態(tài)/液態(tài)界面、冰/液態(tài)界面、和氣態(tài)/油界面。在某些情況下，通過將多肽暴露于有機溶劑、脲和去垢劑導(dǎo)致多肽中疏水相互作用的破壞，使得某些多肽(例如球蛋白)變性。在某些情況下，通過將多肽暴露于例如極端PH值，導(dǎo)致多肽凈電荷的改變，從而引起多肽內(nèi)的靜電斥力和某些氫鍵斷裂，使得多肽變性。
[0096]術(shù)語“運輸(shipping、ships或shipped) ”指將容器中的組合物使用汽車、飛機、和/或船只，按照任何路徑，經(jīng)過任何距離，和在任何溫度下進行運輸。
[0097]短語“于靜態(tài)條件下儲存”，或“靜態(tài)儲存條件”指將容器中的組合物放置于一個地點，不進行運輸。
[0098]術(shù)語“頂空”指容器中液體與容器封口之間的空間。參見如圖5(B)和圖6㈧及6(B)所示。在某些實施方案中，頂空的大小使容器中的液體形成可用肉眼或光學(xué)顯微鏡觀察到的彎液面。在本文中，“彎液面”指容器中液體上表面的凹面。當(dāng)該容器處于垂直(直立)位置時，彎液面橫跨容器的直徑，并且液體不接觸容器封口的底部表面。在某些實施方案中，頂空是彎液面頂部與容器封口的底部表面(例如，柱塞中間的扁平部分)之間的距離。在某些實施方案中，頂空的大小使容器中的液體不形成彎頁面，但是其大小使容器內(nèi)液體形成可用肉眼或光學(xué)顯微鏡觀察到的氣泡。本文中，當(dāng)該容器處于垂直位置時，“氣泡”不能橫跨容器的直徑，并且有一些但是不是全部液體接觸容器封口的底部表面。在某些實施方案中，氣泡是球形的。在某些所述的實施方案中，頂空為氣泡的直徑。在某些實施方案中，氣泡不是球形的。在某些所述的實施方案中，頂空為橢圓形。在某些所述的實施方案中，頂空為氣泡的最長直徑。在某些實施方案中，頂空由卡尺測量。在某些所述的實施方案中，IOX放大鏡和認(rèn)證并校準(zhǔn)過的卡尺一起使用。一種典型卡尺是Mitutoyo Series500,MCN number900-G1-222。在某些實施方案中，頂空由顯微鏡和顯微鏡尺來測量。在某些所述的實施方案中，卡尺用于記錄彎液面頂部與柱塞的底部扁平體之間的距離。在某些實施方案中，預(yù)填充并塞住的注射器頂空由光學(xué)比較器測量。典型的光學(xué)比較器是DeltixmicDH216,水平光學(xué)比較器(Horizontal Optical Comparator)。在某些所述的實施方案中，將注射器垂直放置與光學(xué)透鏡平行來進行測量。將放大的圖像投影到屏幕上用以檢查。光學(xué)比較器上的卡尺用于記錄彎液面頂部與柱塞的底部扁平體之間的距離。在某些實施方案中，頂空是彎液面頂部與柱塞底部扁平體之間以毫米計的距離。
[0099]在本文中，當(dāng)如第90段和以下實施例2所述使用卡尺和/或顯微鏡的測量方法測量頂空為3.0mm或更小時，該頂空即為“最小化”。如果至少有一種測量方法測量頂空為
3.0mm或更小時，即使有一種或多種方法測量得到大于3.0mm,該頂空仍被認(rèn)為“最小化”。某些典型的最小化頂空測量值包括但不限于2.7mm或更小、或2.5mm或更小、或2mm或更小、或1.5mm或更小、或Imm或更小、或0.5mm或更小、或0.2mm或更小、或0.1mm或更小，或無法檢測的頂空。在某些實施方案中，最小化的頂空測量值在2.5mm和3.0mm之間、或2.0mm和2.5mm之間、或1.5mm和2.0mm之間、或1.0mm和1.5mm之間。參見如圖6(B)所示。在某些實施方案中，當(dāng)頂空不能用本文所述卡尺和/或顯微鏡測量方法進行測量時，頂空為最小化。在某些上述實施方案中，不存在肉眼或光學(xué)顯微鏡下可見的彎液面。在某些上述實施方案中，不存在肉眼或光學(xué)顯微鏡下可見的氣泡。
[0100]“容器封口 ”指容器或容器配件中覆蓋或密封容器的部分。在某些實施方案中，容器封口保持(hold)容器內(nèi)的組合物。在某些實施方案中，容器封口可防止微生物入侵。典型容器封口包括但不限于帽、蓋、柱塞(plunger)和塞(stopper)。
[0101]“預(yù)充式注射器”指組合物(例如治療組合物)的容器，其中，該容器為注射器，該組合物在向患者給藥之前被放置于該注射器中，并且該注射器以注射器封口覆蓋，所述封口包括但不限于柱塞。在某些實施方案中，該組合物在生產(chǎn)填充廠家中被放置于注射器中。在某些實施方案中，在放置組合物于注射器中之前將注射器洗滌和滅菌。在某些實施方案中，預(yù)充式注射器在將組合物向患者給藥之前裝有該組合物至少I天、或至少7天、或至少14天、或至少I個月、或至少6個月、至少I年、或至少2年。在某些實施方案中，預(yù)充式注射器經(jīng)歷儲存和/或運輸條件。
[0102]術(shù)語“硅酮”指由一種基于結(jié)構(gòu)單位R2SiO的半無機多聚體構(gòu)成的潤滑劑，其中R為有機基團。在某些實施方案中，硅酮為聚二甲基硅氧烷，又稱為硅油。在某些實施方案中，注射器針筒的內(nèi)表面、注射器柱塞表面、和/或注射器針頭表面均以硅酮涂層。在某些實施方案中，其他類型的容器和/或容器封口，包括但不限于活栓(Stopcock)，以硅酮涂
層。某些典型聚二甲基硅`氧烷包括但不限于Dow Corningjs 360 醫(yī)藥用液(Dow Corning?360medical fluid),例如包括但不限于,具有350厘沲粘度的Dow Corning? 360醫(yī)藥用液、具有1000厘沲粘度的DowComing? 360醫(yī)藥用液、具有12，500厘沲粘度的Dow Coming?360醫(yī)藥用液、和DowComing?MDX4-4159液。在某些實施方案中，硅油被噴涂到表面上。在某些實施方案中，硅油被涂抹到表面上。在某些實施方案中，硅油是烘烤的(baked)。在某些實施方案中，硅油是交聯(lián)的。
[0103]“潤滑劑”指一種施加于表面層，用來減少活動部分間摩擦的材料。某些典型潤滑劑包括但不限于娃酮、聚四氟乙烯(Teflon?)和TriboGlide? (TriboFilm Research,Inc.，Raleigh，NC)。某些典型的塞涂層包括但不限于 Omniflex (Helvoet Pharma, Inc.，Pennsauken, NJ)、Nanoskin (Helvovet塞[配方FM457]上的等離子體覆蓋的全氟聚醚[PFPE]，產(chǎn)自 TriboFilm，Raleigh，NC)、和FluroteC^ (Daikyo Seiko，Ltd.，Sumida-Ku，Tokyo)o
[0104]術(shù)語“烘烤的硅酮”指將硅酮施加于例如，包括但不限于注射器的容器之后，進行熱處理以增進硅酮與容器表面的結(jié)合。
[0105]術(shù)語“交聯(lián)的硅酮”指已被交聯(lián)處理的可交聯(lián)硅油。可交聯(lián)硅油包括但不限于帶有反應(yīng)性或功能性化學(xué)基團以使得該油可被交聯(lián)的硅油。典型商業(yè)可得的可交聯(lián)硅油包括但不限于DowCorning^ MDX4-4159。典型交聯(lián)處理包括但不限于福射處理，例如包括但不限于暴露于電子、X-射線、或Y射線源；和在電離等離子體中處理，例如包括但不限于氧等離子體。
[0106]術(shù)語“無硅酮材料”和“缺少硅酮材料”指其中沒有加入硅酮來涂層表面的用于生產(chǎn)容器或容器封口的材料。在某些實施方案中，用一種或多個以下測試確定娃酮含量不可檢測:將材料暴露于將提取硅酮的溶劑中，并用下述方法檢測硅酮:(I)電感耦合等離子體(ICP)試驗與質(zhì)譜聯(lián)合(ICP-MS)、與原子發(fā)射光譜聯(lián)合(ICP-AES)、或與原子吸收聯(lián)合(ICP-AA)，如下列文獻所述:Kennan JJ, Breen LL, Lane TH，Taylor RB.，Methodsfor detecting silicones in biological matrixes (在生物基質(zhì)中檢測娃酮的方法)，Analytical Chemistry,71 (15):3054-60,1999 ；Mundry T，Surmann P，Schurreit Τ.,Traceanalysis of silicone oil in aqueous parenteral formulation and glass containersby graphite furnace atomic absorption spectrometry (用石墨管原子吸收光譜對液態(tài)腸胃外制劑進行硅油的痕量分析)，Drugs made in Germany，第44卷，第2期，47-56，2001 ;Carter，J.，L Ebdon，和E.H.Evans，Speciation of silicon and phosphorous usingliquidchromatography coupled with sector field high resolution ICP_MS(使用連接扇形場高分辨率ICP-MS的液態(tài)層析進行娃及磷的檢測(speciation))，MicrochemicalJournal，2004，76(1-2):p.35-41 ； 或 Klemens P，HeumannKG.，Development of anICP-HRIDMS method for accurate determination of traces of silicon in biologicaland clinical sam ples (—種用于在生物和臨床樣品中準(zhǔn)確確定痕量硅的ICP-HRIDMS方法的開發(fā))，F(xiàn)resenius J Anal Chem，371:758_763，2001 ;或者(2)使用傅立葉變換紅外線(FTIR)光譜試驗，如下列文獻所述:Silverstein，R.Μ.，Bassler, G.C.，Morrill，T.C.Spectrometric Identification of Organic Compounds (使用光譜鑒定有機化合物)，第 5 版，1991 ；或者 Giingel, H., Menceoglu, Yildiz, B., Akbulut, 0., FourierTransform Infrared AndlH Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopic Findings OfSilicone Oil Removed From Eyes And The Relationship Of Emulsification WithRetinotomy And Glaucoma (使用傅立葉變換紅外線和IH核磁共振光譜的發(fā)現(xiàn):如何從眼睛里去除硅油，以及乳化與視網(wǎng)膜切開術(shù)和青光眼的關(guān)系)，The Journal Of Retinal AndVitreous Diseases，第25卷，No3，332-338，2005。即使在一種或多種其它測試中可檢測到，但是當(dāng)在至少一種上述測試中檢測不到硅的時候，硅被認(rèn)為是不可檢測的。
[0107]術(shù)語“無潤滑劑材料”和“缺少潤滑劑材料”指沒有加入潤滑劑來涂層表面的用于生產(chǎn)容器或容器封口的材料。在某些實施方案中，用一種或多種以下測試確定潤滑劑含量不可檢測:將材料暴露于將提取潤滑劑的溶劑中，并用下述方法檢測潤滑劑:(I)電感耦合等離子體(ICP)試驗與質(zhì)譜聯(lián)合(ICP-MS)、與原子發(fā)射光譜聯(lián)合(ICP-AES)、或與原子吸收聯(lián)合(ICP-AA),如下列文獻所述:Kennan JJ, Breen LL, Lane TH, Taylor RB.,在生物基質(zhì)中檢測娃酮的方法(Methods for detecting silicones in biological matrixes), Analytical Chemistry,71(15):3054-60,1999 ;Mundry T,Surmann P,Schurreit T.,Traceanalysis of silicone oil in aqueous parenteral formulation and glass containersby graphite furnace atomic absorption spectrometry (用石墨管原子吸收光譜對液態(tài)腸胃外制劑進行硅油的痕量分析)，Drugs made in Germany,第44卷,第2期,47-56,2001 ;Carter, J., L.Ebdon,和E.H.Evans,Speciation of silicon and phosphorous usingliquid chromatography coupled with sector field high resolution ICP-MS(使用連接扇形場高分辨率ICP-MS的液態(tài)層析進行娃和磷的檢測(speciation)), MicrochemicalJournal,2004,76 (1-2):p.35-41 ； 或 Klemens P, Heumann KG., Development of anICP-HRIDMS method for accurate determination of traces of silicon in biologicaland clinical samples ( 一種用于在生物和臨床樣品中準(zhǔn)確確定痕量硅的ICP-HRIDMS方法的開發(fā))，F(xiàn)resenius J Anal Chem，371:758_763，2001 ;或者(2)使用傅立葉變換紅外線(FTIR)光譜試驗，如下列文獻所述:Silverstein, R.M., Bassler, G.C., Morrill,Τ.C.Spectrometric Identification of Organic Compounds (使用光譜鑒定有機化合物)，第 5 版，1991 ；或者 Giingel, H., Menceoglu, Yildiz, B., Akbulut, 0., FourierTransform Infrared AndlH Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopic Findings OfSilicone Oil Removed From Eyes And The Relationship Of Emulsification WithRetinotomy And Glaucoma (使用傅立葉變換紅外線和IH核磁共振光譜的發(fā)現(xiàn):如何從眼睛里去除硅油，以及乳化與視網(wǎng)膜切開術(shù)和青光眼的關(guān)系)，The Journal Of Retinal AndVitreous Diseases，第25卷，No3，332-338，2005。即使在一種或多種其它測試中可檢測到，但是當(dāng)在至少一種上述測試中檢測不到潤滑劑的時候，潤滑劑被認(rèn)為是不可檢測的。
[0108]術(shù)語“高分子量塑料材料”材料指具有至少40，000分子量的塑料材料。在某些實施方案中，高分子量塑料材料包括聚合的環(huán)化單體。某些典型高分子量塑料材料包括但不限于環(huán)化烯烴共聚體和環(huán)化烯烴多聚體。
[0109]“緩沖劑”或者“緩沖液”指用于維持組合物pH值在所需范圍內(nèi)的試劑。
[0110]術(shù)語“骨質(zhì)減少疾患”、“骨丟失(bone loss) ”或者“骨丟失病癥”包括但是不限于骨質(zhì)疏松；包括但是不限于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、內(nèi)分泌骨質(zhì)疏松(包括但是不限于甲狀腺機能亢奮癥、甲狀旁腺功能亢奮癥、庫欣氏綜合癥和肢端肥大癥)、遺傳和先天形式的骨質(zhì)疏松(包括但不限于成骨不全、高胱氨酸尿、門克斯氏綜合征和賴?yán)?戴綜合征)；由四肢無法行動引起的骨質(zhì)疏松；成人和青少年的佩吉特氏骨癥(畸形性骨炎)；骨髓炎，或一種骨內(nèi)感染性病變，導(dǎo)致的骨丟失；由實體瘤(包括但是不限于，乳房瘤、肺瘤和腎瘤)導(dǎo)致的高鈣血癥和血液惡性腫瘤(包括但不限于多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病)、特發(fā)性高鈣血癥，和與甲狀腺機能亢奮癥和腎功能紊亂相關(guān)的高鈣血癥；手術(shù)后的骨質(zhì)減少、與類固醇(例如糖皮質(zhì)激素)的使用相關(guān)的骨質(zhì)減少，和與大小腸功能紊亂和慢性肝腎疾病相關(guān)的骨質(zhì)減少；與外傷或非外傷骨疽相關(guān)的骨壞死，或稱骨細(xì)胞死亡；與貧血或炎癥或自身免疫疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的骨丟失，以及牙周疾病。 [0111]除骨丟失疾患以外，某些癌癥，包括轉(zhuǎn)移到骨或位于骨的癌癥，已知可增加破骨細(xì)胞活性并引起骨再吸收。所述的癌癥包括但不限于乳癌、前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤。在某些情況下，已知這些癌癥可產(chǎn)生引起骨內(nèi)RANKL過量表達的因子，從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)目和活性的增加。相應(yīng)的，骨丟失病癥包括但不限于乳癌、前列腺癌、和已轉(zhuǎn)移到骨或能夠轉(zhuǎn)移到骨的實體瘤；多發(fā)性骨髓瘤；以及骨巨細(xì)胞瘤。其他骨丟失疾患包括但不限于化療在轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性癌癥患者中引發(fā)的骨丟失，所述癌癥包括但不限于乳癌和前列腺癌。在某些情況下，骨丟失發(fā)生于以例如但不限于佐劑芳香酶抑制劑的荷爾蒙消融治療(hormoneablative therapy)期間。
[0112]如果自然發(fā)生或者試驗引發(fā)的疾病或病癥與體液或組織中的IL-1水平升高相關(guān)，或如果從身體獲取的細(xì)胞或組織在培養(yǎng)物中產(chǎn)生升高水平的IL-1，該疾病或病癥被視為“白細(xì)胞介素I (IL-1)介導(dǎo)疾病”。IL-1水平升高包括但不限于超過在特定細(xì)胞和組織中的正常水平；和在正常情況下不表達可檢測水平的IL-1的細(xì)胞或組織中任何可檢測水平的IL-1。在某些情況下，以下一種或兩種另外的情況也被認(rèn)為是IL-1介導(dǎo)的疾病:(I)疾病或病癥相關(guān)的病理結(jié)果與實驗中被施用IL-1或由實驗條件引起IL-1表達上調(diào)的動物相似；和(2)由實驗動物疾病或病癥模型引發(fā)的病理通過抑制IL-1作用的藥劑處理而抑制或消除。在某些IL-1介導(dǎo)的疾病中，滿足上述三種情況中的至少兩種。在某些IL-1介導(dǎo)的疾病中，滿足上述全部三種情況。
[0113]典型的IL-1介導(dǎo)的急性和慢性疾病包括但不限于以下:急性胰腺炎；肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS);阿爾茨海默氏病；惡病質(zhì)/厭食，包括但不限于艾滋病(AIDS)引發(fā)的惡病質(zhì)；哮喘和其他肺?。粍用}粥樣硬化；自身免疫性血管炎；慢性疲勞綜合征；梭菌相關(guān)疾病，包括但不限于梭菌相關(guān)性腹瀉；冠狀動脈疾患和適應(yīng)癥，包括但不限于充血性心臟衰竭、冠狀動脈再狹窄、心肌梗塞、心肌功能障礙(例如，與敗血癥相關(guān))和冠狀動脈旁路搭橋術(shù)?’癌癥，包括但不限于多發(fā)性骨髓瘤和骨髓性(如AML或CML)和其他白血病，以及腫瘤轉(zhuǎn)移；糖尿病(如胰島素依賴型糖尿病)；子宮內(nèi)膜異位癥；發(fā)燒；纖維肌痛；腎小球腎炎；移植物抗宿主病/移植排斥反應(yīng)；失血性休克；痛覺過敏；炎性腸道疾病；關(guān)節(jié)的炎性疾患，包括但不限于:骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎性眼疾，如可能與例如，角膜移植相關(guān)的；局部缺血，包括腦缺血(例如，大腦由于外傷、癲癇、出血或中風(fēng)造成的傷害，所述每種情況可能導(dǎo)致神經(jīng)變性)；川崎氏癥；學(xué)習(xí)障礙；肺病(如ARDS);多發(fā)性硬化癥；肌病(如肌肉蛋白質(zhì)代謝，尤其是在敗血癥中)；神經(jīng)毒性(例如，由HIV引起的神經(jīng)毒性)；骨質(zhì)疏松；疼痛，包括但不限于癌癥相關(guān)的疼痛；帕金森氏病；牙周疾病；早產(chǎn)；銀屑?。辉俟嘧p傷；感染性休克；放療副作用；顳下頜關(guān)節(jié)疾病；睡眠障礙；壓力造成的葡萄膜炎和炎性疾患、扭傷、軟骨損傷、創(chuàng)傷、整形外科手術(shù)、感染或其他疾病過程。
[0114]如果天然發(fā)生或者試驗引發(fā)的疾病或病癥與體液或組織中的TNF水平升高相關(guān)，或如果從身體獲取的細(xì)胞或組織在培養(yǎng)物中產(chǎn)生升高水平的TNF，該疾病或病癥被視為“TNF介導(dǎo)疾病”。TNF水平升高包括但不限于超過在特定細(xì)胞和組織中的正常水平；和在正常情況下不表達可檢測水平的TNF的細(xì)胞或組織中任何可檢測水平的TNF。在某些情況下，以下一種或兩種另外的情況也被認(rèn)為是TNF介導(dǎo)的疾病:(1)疾病或病癥相關(guān)的病理結(jié)果與實驗中被施用TNF或由實驗條件引起TNF表達上調(diào)的動物相似；和(2)由實驗動物疾病或病癥模型引發(fā)的病理通過抑制TNF作用的藥劑處理而抑制或消除。在某些TNF介導(dǎo)的疾病中，滿足上述三種情況中的至少兩種。在某些TNF介導(dǎo)的疾病中，滿足上述全部三種情況。
[0115]典型急性和慢性TNF介導(dǎo)的疾病包括但不限于惡病質(zhì)、感染性休克、艾滋病、心肌病、自身免疫性疾病、和炎癥性疾病，包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎及斑塊狀牛皮癬。
[0116]當(dāng)過量的特異性結(jié)合劑使結(jié)合了配體的受體量減少至少大約20%、40%、60%、80%、85%或更多(如在體外競爭測定法中檢測)時，該特異性結(jié)合劑被稱為“大致上抑制了配體與受體的結(jié)合”。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗體。在某些實施方案中，抗體大致上抑制RANKL與RANK的結(jié)合，或者大致上抑制IL-1與IL-1Rl的結(jié)合。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為可溶性融合多肽。在某些所述的實施方案中，可溶性融合多肽大致上抑制TNF與TNF-R的結(jié)合。
[0117]術(shù)語“癌癥”包括但不限于實體瘤和血液惡性腫瘤。典型癌癥包括但不限于乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、遺傳和散發(fā)性乳頭狀腎癌、白血病、淋巴瘤、李弗勞梅尼綜合征 、惡性胸膜間皮瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、巨細(xì)胞瘤，和膀胱移行細(xì)胞癌。
[0118]本文所用術(shù)語“藥劑或藥品”指當(dāng)適當(dāng)?shù)厥┯糜诨颊邥r，能夠引起所需治療作用的化學(xué)化合物或組合物。在本文中，治療作用可包括或不包括預(yù)防作用。
[0119]本文所用術(shù)語“調(diào)制劑”為可以改變或轉(zhuǎn)換分子活性或功能的化合物。例如，相比于不含調(diào)制劑的情況下觀察到的活性或功能的量級，調(diào)制劑可引起以分子在某種活性或功能上的量級的增加或減少。在某些實施方案中，調(diào)制劑是抑制劑，引起分子在至少一種活性或功能上的量級的降低。某些典型的分子的活性和功能包括但不限于結(jié)合親和性、酶活性和信號傳導(dǎo)。某些典型的抑制劑包括但不限于蛋白、肽、抗體、肽體(P印tibodies)、碳水化合物或小的有機分子。肽體已描述在，例如第6，660，843號美國專利和第WOOl / 83525號PCT公開中。
[0120]在本文中，“大致純”意為目標(biāo)物質(zhì)為存在的主導(dǎo)物質(zhì)(例如，在摩爾基礎(chǔ)上，組合物所含該物質(zhì)比其他任何單獨物質(zhì)都更大量)。在某些實施方案中，大致純的部分是其中在所有存在的大分子物質(zhì)中含有目標(biāo)物質(zhì)至少約百分之五十(在摩爾基礎(chǔ)上)的組合物。在某些實施方案中，大致純的組合物占組合物中存在的所有大分子物質(zhì)的超過約80 %、85 %、90%、95%或99%。在某些實施方案中，目標(biāo)物質(zhì)被純化到基本均質(zhì)(使用常規(guī)檢測方法無法在組合物中檢測出污染物質(zhì))，其中該組合物基本上只由一種大分子物質(zhì)組成。
[0121]術(shù)語“患者”包括人類和動物受治療者。
[0122]某些典型特異性結(jié)合劑
[0123]在某些情況下，TNF由活化巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞釋放，在大量細(xì)胞類型中引發(fā)廣泛的各種反應(yīng)。在某些情況下，TNF在調(diào)控正常免疫反應(yīng)，以及各種病理和疾病狀態(tài)中起作用。某些所述病理和疾病狀態(tài)包括但不限于與敗血癥有關(guān)的全身毒性、艾滋病的發(fā)病機制、以及各種自體免疫和炎性疾病，包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊椎炎和斑塊狀銀屑病。
[0124]在某些情況下，TNF蛋白通過與在TNF反應(yīng)性細(xì)胞的質(zhì)膜上表達的特異性TNF受體(TNF-R)蛋白結(jié)合而在細(xì)胞中引發(fā)生物反應(yīng)。因此，在某些情況下，降低TNF介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)可減輕哮喘、免疫、自身免疫、和/或炎癥性疾患的嚴(yán)重度。根據(jù)某些實施方案，TNF特異性結(jié)合劑用于治療包括但不限于以上所述的免疫、自身免疫、和/或炎癥性疾患。
[0125]在某些實施方案中，TNF的特異性結(jié)合蛋白為可溶性TNF-R。在某些實施方案中，提供了編碼可溶性TNF-R的核苷酸序列，和相應(yīng)的氨基酸序列。在某些實施方案中，可溶性TNF-R 選自 huTNF-RA 235、huTNF-RA 185 和 huTNF-RA 163。參見例如第 5，945，397 號美國專利。在某些實施方案中，可溶性TNF-R為單價的。單價可溶性TNF-R包含對TNF配體的一個TNF-R結(jié)合位點。在某些實施方案中，可溶性TNF-R為多價的。多價可溶性TNF-R包含對TNF配體的多個TNF-R結(jié)合位點。在某些實施方案中，可溶性TNF-R為二價的。在某些上述實施方案中，二價可溶性TNF-R包含由連接子區(qū)分隔的兩個huTNF-R Δ 235的串聯(lián)重復(fù)序列。在某些實施方案中，提供了能夠與TNF結(jié)合的純化人類可溶性TNF-R。
[0126]在某些實施方案中，TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF-R融合多肽。在某些實施方案中，可溶性TNF-R融合多肽為多價的。在某些實施方案中，可溶性TNF-R融合多肽為二價的(也稱為二聚的)。在某些實施 方案中，可溶性TNF-R融合多肽包含融合于Fe的可溶性TNF-R。
[0127]某些典型可溶性TNF-R和可溶性TNF-R融合多肽以及其制備和使用方法已在美國專利第 5，945，397 號和 Mohler 等，J.1mmunol.151:1548-1561(1993)中描述。在某些上述實施方案中，提供了純化的可溶性人類TNF-R融合多肽。在某些上述實施方案中，純化的可溶性人類 TNF-R 融合多肽為 sTNFR:Fc，如 Mohler 等，J.1mmunol.151:1548-1561(1993)中
所述，或為以商業(yè)名稱Enbrel?出售的依那西普，如下述實施例中所述。
[0128]在某些情況下，RANKL參與破骨細(xì)胞的形成。在某些情況下，RANKL與受體RANK結(jié)合，從而增加破骨細(xì)胞活性。在某些情況下，破骨細(xì)胞活性的增加與某些骨質(zhì)減少疾病有關(guān)，包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、佩吉特氏病、溶解骨轉(zhuǎn)移和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。因此，在某些情況下，降低RANKL活性可能引起破骨細(xì)胞活性的降低并可能減輕骨質(zhì)減少疾病的嚴(yán)重度。根據(jù)某些實施方案，RANKL特異性結(jié)合劑用于治療包括但不限于以上所述的骨質(zhì)減少疾病。
[0129]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑為完全人類單克隆抗體。在某些實施方案中，提供了編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子的核苷酸序列，和相應(yīng)氨基酸序列，特別是可變區(qū)的相應(yīng)序列。在某些實施方案中，提供了相應(yīng)于互補決定區(qū)(CDR)，特別是CDRl到CDR3的序列。根據(jù)某些實施方案，提供了表達所述免疫球蛋白分子的雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)某些實施方案，提供了表達所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)某些實施方案，提供了表達所述單克隆抗體的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。在某些實施方案中，提供了針對人類RANKL的純化人類單克隆抗體。
[0130]某些典型RANKL(又稱為0PGL)抗體以及制備和使用所述抗體的方法已在公開于2004年2月19日的第2004 / 0033535號美國專利申請公布中描述。在某些上述實施方案中，提供了針對人類RANKL的純化人類單克隆抗體。參見例如第2004 / 003353號美國專利申請公布。在某些上述實施方案中，針對人類RANKL的純化人類單克隆抗體為aRANKL-1，如下述實施例中所述。
[0131]在某些情況下，一種細(xì)胞因子IL-1參與了炎癥反應(yīng)。在某些情況下，IL-1與受體IL-1Rl結(jié)合，隨后與IL-1RAcP結(jié)合。這些事件隨后引起導(dǎo)致引發(fā)細(xì)胞反應(yīng)的信號傳導(dǎo)，在某些情況下，導(dǎo)致炎癥。在某些情況下，炎癥與由機械傷害導(dǎo)致的外傷、感染、或抗原刺激相關(guān)聯(lián)。在某些情況下，炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為病理反應(yīng)。在某些情況下，當(dāng)炎癥以擴大的方式表現(xiàn)，或被不適當(dāng)?shù)拇碳ぃ虍?dāng)導(dǎo)致受傷的物質(zhì)清除后仍然持續(xù)時，發(fā)生上述病理疾患。典型的由IL-1介導(dǎo)的病理疾患包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。因此，在某些情況下，IL-1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)活性的降低可導(dǎo)致引起炎癥的細(xì)胞反應(yīng)的減輕，從而減輕關(guān)節(jié)炎和其他免疫性疾病的嚴(yán)重度。根據(jù)某些實施方案，IL-1Rl特異性結(jié)合劑用于治療包括但不限于以上所述的炎癥性疾病。
[0132]在某些實施方案中，IL-1Rl特異性結(jié)合劑為完全人類單克隆抗體。在某些實施方案中，提供了編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子的核苷酸序列，和相應(yīng)氨基酸序列，特別是可變區(qū)的相應(yīng)序列。在某些實施方案中，提供了相應(yīng)于互補決定區(qū)(CDR)，特別是CDRl到CDR3的序列。根據(jù)某些實施方案，提供了表達所述免疫球蛋白分子的雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)某些實施方案，提供了表達所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)某些實施方案，提供了表達所述單克隆抗體的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。在某些實施方案中，單克隆抗體選自15C4、26F5和27F2中的至少一個。在某些實施方案中，提供了針對人類IL-1Rl的純化人類單克隆抗體。
[0133]某些典型IL-1Rl抗體以及制備和使用所述抗體的方法已在公開于2004年5月20日的第2004 / 0097712號美國專利申請公布中描述。在某些上述實施方案中，提供了針對人類IL-1Rl的純化人類單克隆抗`體。在某些上述實施方案中，針對人類IL-1Rl的純化人類單克隆抗體具有如美國專利申請公布號2004 / 0097712所示的輕鏈可變區(qū)SEQ ID NO:12和重鏈可變區(qū)SEQ ID NO:10 ;或者可選地如美國專利申請公布號2004 / 0097712所示的輕鏈可變區(qū)SEQ ID NO: 12和重鏈可變區(qū)SEQ ID NO:14 ;或者可選地如美國專利申請公布號2004 / 0097712所示的輕鏈可變區(qū)SEQ ID NO:18和重鏈可變區(qū)SEQ ID NO:16。
[0134]在某些實施方案中，針對人類RANKL的人類單克隆抗體或/和針對人類IL-1Rl的人類單克隆抗體為完全人類單克隆抗體。某些完全人類單克隆抗體可從如下所述工程化的小鼠品系獲得。人們可以大片段的人類Ig基因座改造小鼠抗體產(chǎn)生缺陷的小鼠品系，并預(yù)期所述小鼠將生成人類抗體而沒有小鼠抗體。人源Ig大片段可保留大量的可變基因多樣性以及適當(dāng)?shù)目贵w生成和表達的調(diào)控。通過利用小鼠的抗體多樣化和選擇機制，以及對人類蛋白免疫耐受性的缺乏，在這些小鼠品系中所再生的人類抗體譜可產(chǎn)生對所感興趣的任何抗原，包括人類抗原具有高親和性的完全人類抗體。使用雜交瘤技術(shù)，可生成和選擇具有所需特異性的抗原特異性人類MAb。某些典型方法已于W098 / 24893、美國專利第5，545，807 號、EP546073B1 和 EP546073A1 中描述。
[0135]在某些實施方案中，人們可將來自非人類物種的恒定區(qū)與人類可變區(qū)一起使用。在某些實施方案中，人們可將來自人類的恒定區(qū)與來自非人類物種的可變區(qū)一起使用。
[0136]某些典型抗體結(jié)構(gòu)
[0137]天然生成的抗體結(jié)構(gòu)單位通常包括四聚體。每一個所述四聚體由兩對相同的多肽鏈構(gòu)成，每對多肽鏈具有一條全長輕鏈(在某些實施方案中，大約25kDa)和一條全長重鏈(在某些實施方案中，大約50-70kDa)。
[0138]每條鏈的氨基末端部分通常包含約100到110或更多個氨基酸的可變區(qū)(在重鏈中是Vh，在輕鏈中是VJ，該可變區(qū)通常負(fù)責(zé)識別抗原。每條鏈的羧基末端通常定義恒定區(qū)(在重鏈中是C0,在輕鏈中是CJ，該恒定區(qū)負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能?？贵w效應(yīng)子功能包括激活化補體和刺激調(diào)理吞卩遼。人類輕鏈通常分類為kappa與Iamda輕鏈。重鏈通常分類為mu、delta、gamma、alpha或epsilon,并分別定義抗體的同型體為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有多種亞類，包括但不限于IgGU IgG2、IgG3和IgG4。IgM有包括但不限于IgMl和IgM2的亞類。IgA也類似的分類為包括但不限于IgAl和IgA2的亞類。通常在全長輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)由約12個或更多氨基酸的“J”區(qū)連接，在重鏈中還包括約10個或更多氨基酸的“D”區(qū)。參見例如Fundamental Immunology (基礎(chǔ)免疫學(xué))第7章(Paul, w.,第二版.Raven Press, N.Y.(1989))。通常由每對輕/重鏈的可變區(qū)形成抗原結(jié)合位點。
[0139]可變區(qū)通常表現(xiàn)出與相對保守并與三個高變區(qū)(也稱為互補決定區(qū)或⑶R)連接的框架區(qū)(FR)相同的大體結(jié)構(gòu)。每對重鏈和輕鏈的CDR通常和框架區(qū)對齊，從而使之可以與特定表位結(jié)合。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈的可變區(qū)通常包括FRl、OTRl、FR2、⑶R2、FR3XDR3和FR4結(jié)構(gòu)域。每個結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配通常根據(jù)Kabat Sequences of Proteinsof Immunological Interest (免疫學(xué)上重要蛋白的序列)(National InstitutesofHealth (美國國立健康研究院),Bethesda,Md.(1987 和 1991))、或 Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987) ;Chothia 等.Nature342:878-883 (1989)中的定義。
[0140]如在以上“某些定義”一節(jié)中所討論，存在多種類型的抗體片段。典型抗體片段包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F (ab’)2分子、Fv分子、scFv、最多體和Fe片段。
[0141]在某些實施方案中，功能結(jié)構(gòu)域CH1、CH2、CH3和其間的序列可被改組以產(chǎn)生不同的抗體恒定區(qū)。例如，在某些實施方案中，可優(yōu)化所述雜合恒定區(qū)在血清中的半衰期，抗體四聚體的組裝和折疊，和/或增強效應(yīng)子功能。在某些實施方案中，修飾過的抗體恒定區(qū)可由在恒定區(qū)氨基酸序列中引入單點突變，并測試所得抗體是否有性能上的提高(例如以上所列一項或多項的優(yōu)化)而生成。
[0142]在某些實施方案中，抗體的一種同種型通過同種型轉(zhuǎn)換而轉(zhuǎn)變成另一種同種型，并且不丟失其對特定靶標(biāo)分子的特異性。同種型轉(zhuǎn)換的方法包括但不限于直接重組技術(shù)(參見例如第4，816，397號美國專利)和細(xì)胞-細(xì)胞融合技術(shù)(參見例如第5，916，771號美國專利)等多種方法。在某些實施方案中，抗體可由以上技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)由一種亞類轉(zhuǎn)變成另一種亞類，并且不丟失其對特定靶標(biāo)分子的特異性，其中包括但不限于由IgG2亞類轉(zhuǎn)變?yōu)镮gGl、IgG3、或IgG4亞類。
[0143]某些雙特異性或雙功能抗體
[0144]雙特異性或雙`功能抗體通常是含有兩對不同重/輕鏈和兩個不同結(jié)合位點的人造雜合抗體。雙特異性抗體可由多種方法產(chǎn)生，包括但不限于雜交瘤融合或Fab’片段的連接。參見例如 Songsivilai&Lachmann Clin.Exp.Tmmunol.79:315-321 (1990), Kostelny 等J.1mmunol.148:1547-1553(1992)。
[0145]抗體的某些制備
[0146]在某些實施方案中，抗體可在雜交瘤細(xì)胞系以外的細(xì)胞系中表達。在某些實施方案中，編碼特定抗體，包括嵌合抗體的序列，可用于轉(zhuǎn)化合適的哺乳動物宿主細(xì)胞。根據(jù)某些實施方案，轉(zhuǎn)化可為用任何已知方法將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中，例如，包括將多核苷酸包被入病毒(或病毒載體中)并利用本領(lǐng)域已知的方案用該病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞或轉(zhuǎn)染載體，如第4，399，216號；第4，912，040號；第4，740，461號和第4，959，455號美國專利中所舉例。
[0147]在某些實施方案中，表達載體包含本文所討論的一種或多種多核苷酸序列，包括但不限于編碼一種或多種抗體的多核苷酸序列。在某些實施方案中，提供在包含以上所述任何表達載體的細(xì)胞中，并在適合表達其中所含多核苷酸的條件下生成多肽的多肽制備方
法。
[0148]在某些實施方案中，表達載體表達抗體重鏈。在某些實施方案中，表達載體表達抗體輕鏈。在某些實施方案中，表達載體表達抗體重鏈和抗體輕鏈。在某些實施方案中，提供包括在包含至少一種表達載體的細(xì)胞中，并在適合表達其中所含多核苷酸的條件下生成抗體的抗體制備方法。
[0149]在某些實施方案中，所用轉(zhuǎn)染方案可取決于將被轉(zhuǎn)化的宿主。某些用于向哺乳動物細(xì)胞引入異源多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，磷酸鈣沉淀，聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融合，電穿孔，在脂質(zhì)體中封裝多核苷酸，和直接微注射DNA進入細(xì)胞核。
[0150]某些可作為表達宿主的哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域中已知的，包括但不限于可由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的多種永生細(xì)胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、E5細(xì)胞、Hela細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人類肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如Hep G2)、NS0細(xì)胞、SP20細(xì)胞、Per C6細(xì)胞、293細(xì)胞和多種其他細(xì)胞系。在某些實施方案中，可通過確定哪些細(xì)胞系具有高表達水平和產(chǎn)生具有本質(zhì)抗原結(jié)合特性的抗體來選擇細(xì)胞系。
[0151]在某些實施方案中，可轉(zhuǎn)染進入宿主細(xì)胞的載體包含可操作性連接于編碼抗體的多核苷酸的調(diào)控序列。在某些實施方案中，調(diào)控序列促進所連接多核苷酸的表達，從而使得產(chǎn)生所連接的多核苷酸編碼的多肽。在某些實施方案中，載體也包含允許在宿主細(xì)胞內(nèi)不依賴染色體復(fù)制的多核苷酸序列。典型的載體包括但不限于質(zhì)粒(例如BlueScript、puc等)、粘粒和YACS。
[0152]重組多肽的某些表達
[0153]在某些實施方案中，重組表達載體用來擴增或表達編碼多肽的DNA，所述多肽例如包括但不限于TNF-R。在某些實施方案中，重組表達載體為可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體具有合成的或cDNA衍生的、編碼哺乳動物TNF-R的DNA片段或生物等效類似物，所述DNA片段或生物等效類似物可操作地連接于衍生于哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件。多種適合表達編碼多肽的合成或cDNA衍生的DNA片段的重組表達載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。某些典型的重組表達載體于第5，945，397號美國專利中描述。
[0154]在某些實施方案中，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是已被使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的TNF-R載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞通常情況下表達TNF-R，但是用于克隆或擴增TNF-RDNA的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞不需要表達TNF-R。在某些實施方案中，根據(jù)所選的TNF-R DNA，所表達的TNF-R將聚集在細(xì)胞膜，或被分泌進入培養(yǎng)上清液。用于表達哺乳動物TNF-R的典型宿主細(xì)胞包括但不限于原核細(xì)胞、酵母和高等真核細(xì)胞，其中TNF-R的表達被置于合適的啟動子控制之下。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌(E.coli)或桿菌(bacilli)。高等真核細(xì)胞包括但不限于已建立的來源于哺乳動物的細(xì)胞系。在某些實施方案中，也可使用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，由衍生于含有TNF-R的DNA構(gòu)建體的RNA來產(chǎn)生哺乳動物TNF-R。某些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞宿主的典型的克隆和表達載體在Pouwels等(Cloning Vectors:A Laboratory Manual (克隆載體:實驗室手冊)，Elsevier,N.Y.，1985)中描述。
[0155]在某些實施方案中，原核表達宿主用于表達TNF-R。在某些實施方案中，原核表達載體通常包含一個或多個表型選擇標(biāo)記，例如編碼賦予抗生素耐受性或提供營養(yǎng)缺陷要求的蛋白的基因，和能被宿主識別的復(fù)制來源以保證宿主內(nèi)的擴增。用于轉(zhuǎn)化的典型原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium),和假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphyolococcus)的菌種。各種原核表達載體及使用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。某些原核表達載體在第5，945，397號美國專利中描述。
[0156]在某些實施方案中，重組TNF-R蛋白在酵母宿主中表達，例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),和其他屬的酵母,例如畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)。各種酵母表達載體及使用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。某些典型的酵母表達載體及其使用方法已于R.Hitzeman等,歐洲專利申請公布第0073657號,和Sherman 等，Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法的實驗室課程手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.，1986中描述。
[0157]在某些實施方案中，哺乳動物或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)用于表達重組蛋白。合適的哺乳動物宿主細(xì)胞系的實例包括但不限于Gluzman(Cell23 =175,1981)描述的猴腎細(xì)胞C0S-7細(xì)胞系，和其他能夠表達合適載體的細(xì)胞系，包括例如L細(xì)胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、Hela和BHK細(xì)胞系。多種哺乳動物和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)及使用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。某些所述典型系統(tǒng)在第5，945，397號美國專利中描述。
[0158]在某些實施方案中，含有TNF-R cDNA的重組表達載體被穩(wěn)定的整合入宿主細(xì)胞的DNA中。在某些實施方案中，表達產(chǎn)物的水平升高通過選擇具有擴大數(shù)目的載體DNA的細(xì)胞系來實現(xiàn)。在某些實施 方案中，選擇具有擴大數(shù)量的載體DNA的細(xì)胞系，例如，通過在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化入含有編碼被已知藥物抑制的酶的DNA序列的載體。在某些實施方案中，該載體也包含編碼所需蛋白(例如TNF-R)的DNA序列。在某些實施方案中，該宿主細(xì)胞被包含編碼所需蛋白(例如TNF-R)的DNA序列的第二載體共轉(zhuǎn)化。在某些實施方案中，該被轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞隨后在增加濃度的已知藥物中培養(yǎng)，從而篩選出可能含有擴大拷貝的編碼所述酶的載體以及宿主細(xì)胞DNA中編碼所需蛋白(TNF-R)的載體DNA的耐藥性細(xì)胞。
[0159]某些典型的用于所述共同擴增的系統(tǒng)包括但不限于使用二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，該酶可被藥物甲氨蝶呤(MTX)抑制；和使用谷氨酰胺合成酶(GS)基因，該酶負(fù)責(zé)通過水解ATP生成ADP和磷酸鹽來驅(qū)動反應(yīng)以合成谷氨酸酯和氨。這些系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。另外，該GS共同擴增系統(tǒng)、合適的重組表達載體和細(xì)胞系，已于以下PCT申請中描述:W087 / 04462、W089101036、W089 / 10404 和 W086 / 05807。
[0160]在某些實施方案中，重組蛋白通過共同擴增DHFR或GS在哺乳動物宿主細(xì)胞中表達，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞；或可選地在鼠骨髓瘤細(xì)胞系，例如SP2 / 0-Agl4或者NSO ;或者大鼠骨髓瘤細(xì)胞系，例如在PCT申請WO / 89 / 10404和W086 / 0587中公開的YB2 / 3-Ag20。
[0161]某些其他表達TNF-R DNA的真核載體，包括pCAV / NOT載體，已于第5，945，397號美國專利中描述。
[0162]重鉬TNF-R的鈍化
[0163]在某些實施方案中，純化的哺乳動物TNF受體或類似物的制備通過培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)來表達TNF-R DNA的重組翻譯產(chǎn)物，隨后從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中純化所述產(chǎn)物。
[0164]在某些實施方案中，首先使用市售的蛋白濃縮過濾器例如Amicon或MilliporePellicon超濾裝置將向培養(yǎng)基中分泌重組蛋白的系統(tǒng)的上清液進行濃縮。在某些實施方案中，在濃縮步驟以后，將所 得濃縮液加入合適的純化基質(zhì)中。典型的純化基質(zhì)包括但不限于結(jié)合于合適支持物的TNF、凝集素或抗體多肽；包含例如懸垂的二乙基氨基乙基(DEAE)基團的陰離子交換樹脂，其中所述基質(zhì)為丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或常用于蛋白質(zhì)純化的其他類型；陽離子交換樹脂，包含各種包括磺丙基或羧甲基基團的不可溶基質(zhì)。
[0165]在某些實施方案中，一種或多種使用疏水性RP-HPLC介質(zhì)(例如具有懸垂甲基或其他脂族基團的硅膠)的反相高效液相層析(RP-HPLC)步驟用于進一步純化TNF-R組合物。在某些實施方案中，某些或全部前述純化步驟，以各種組合形式用于提供均質(zhì)重組蛋白。
[0166]在某些實施方案中，由細(xì)菌培養(yǎng)產(chǎn)生的重組蛋白通常首先由細(xì)胞團中被提取出來，然后經(jīng)過一次或多次濃縮、鹽析、液相離子交換或尺寸排阻層析步驟。在某些實施方案中，高效液相層析(HPLC)用于最后的純化步驟。在某些實施方案中，可用任何便捷的方法破裂用于表達重組哺乳動物TNF-R的微生物細(xì)胞，例如，凍融循環(huán)、超聲波處理、機械破壞、或使用細(xì)胞溶解劑。
[0167]在某些實施方案中，發(fā)酵以分泌蛋白形式表達哺乳動物TNF-R的酵母細(xì)胞。典型的用于純化由大規(guī)模發(fā)酵所得分泌的重組蛋白的方法在Urdal等(J.Chromatog.296:171,1984)中討論。
[0168]某些特異性結(jié)合劑組合物
[0169]在某些實施方案中，提供包含至少一種特異性結(jié)合劑、至少一種穩(wěn)定劑、和緩沖劑的組合物。在某些上述實施方案中，該組合物還包含至少一種另外的藥劑。在某些實施方案中，該特異性結(jié)合劑為RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為RANKL特異性結(jié)合劑，其中該RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為aRANKL-Ι。在某些實施方案中，該特異性結(jié)合劑為TNF特異性結(jié)合劑，其中該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR =Fc0在某些實施方案中，該特異性結(jié)合劑為IL-1Rl特異性結(jié)合劑，其中該IL-1Rl特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，該抗體選自15C4、26F5和27F2并如第2004 / 0097712號美國專利公布中描述。
[0170]在某些實施方案中，至少一種RANKL特異性結(jié)合劑的濃度為Img / ml至150mg /ml。在某些上述實施方案中，至少一種RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為aRANKL-Ι。至少一種RANKL特異性結(jié)合劑的某些典型的濃度包括但不限于 30mg / ml、60mg / ml、70mg / ml、105mg / ml 和 120mg / ml。在某些實施方案中，組合物包括多于一種的不同的RANKL特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，所述多于一種的RANKL特異性結(jié)合劑與多于一個表位結(jié)合。
[0171]在某些實施方案中，至少一種TNF特異性結(jié)合劑的濃度為Img / ml至150mg / ml。在某些上述實施方案中，至少一種TNF特異性結(jié)合劑以50mg / ml的濃度存在。在某些實施方案中，組合物包括多于一種的不同的TNF特異性結(jié)合劑。在某些上述實施方案中，所述多于一種的TNF特異性結(jié)合劑與多于一個表位結(jié)合。TNF特異性結(jié)合劑，包括可溶性TNFR:Fe的典型制劑可見于第2007 / 0243185號美國專利公布，通過引用全文并入本文。
[0172] 在某些實施方案中，至少一種IL-1Rl特異性結(jié)合劑的濃度為Img / ml至200mg /ml。在某些上述實施方案中，至少一種IL-1Rl特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，該抗體選自15C4、26F5或27F2，如第2004 / 0097712號美國專利公布中描述。至少一種IL-1Rl特異性結(jié)合劑的某些典型的濃度包括但不限于30mg / ml、70mg / ml>IOOmg / ml和150mg / ml。在某些實施方案中，組合物包括多于一種的不同的IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些上述實施方案中，所述多于一種的IL-1Rl特異性結(jié)合劑與多于一個表位結(jié)合。
[0173]在某些實施方案中，含有緩沖劑的組合物的pH值低于6.6。在某些實施方案中，含有緩沖劑的組合物的PH值在5.5與6.5之間。在某些上述實施方案中，該pH值為6.3。在某些實施方案中，含有緩沖劑的組合物的PH值在4.5與5.5之間。在某些上述實施方案中，該PH值為5.2。典型緩沖劑包括但不限于醋酸鹽、組氨酸、磷酸鹽、谷氨酸鹽和丙酸鹽。在某些實施方案中，緩沖劑的濃度在ImM與50mM之間。在某些實施方案中，緩沖劑的濃度為25mM。在某些實施方案中，緩沖劑的濃度為10mM。
[0174]在某些實施方案中，該組合物還含有至少一種糖。本文所用術(shù)語“糖”指諸如葡萄糖和甘露糖的單糖，或包括諸如蔗糖和乳糖等二糖的多糖，以及包括糖醇和糖酸的糖衍生物。糖醇包括但不限于甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、蘇糖醇、山梨糖醇和甘油。糖酸的一個非限制性實例是左旋葡萄糖酸。某些典型的糖包括但不限于海藻糖和甘氨酸。在某些實施方案中，提供濃度為0.5%至9.5%的糖。在某些實施方案中，糖為1%蔗糖。在某些實施方案中，糖為5.0%山梨糖醇。
[0175]在某些實施方案中，該組合物還含有至少一種表面活性劑。本文所用術(shù)語“表面活性劑”指包含疏水部分和親水部分的表面活性試劑。表面活性劑的實例包括但不限于去垢劑和膽酸鹽。在某些情況下，根據(jù)是否包含一個或多個帶電荷基團，表面活性劑分類為陰離子、非離子、兩性離子或陽離子表面活性劑。非離子表面活性劑帶有無電荷極性基團并不帶電荷。某些典型的非離子表面活性劑包括但不限于聚乙二醇(PEG)，包括但不限于PEG8000、和聚山梨酯，包括但不限于聚山梨酯80 (Tween? 80)和聚山梨酯20 (Tween?20),Triton χ-1oo、聚氧丙烯-聚氧乙烯酯(Pluronic?)和NP-40。在某些實施方案中，提供濃度為0.001%到1.0 %的表面活性劑。在某些實施方案中，提供濃度為0.003%到0.3%的表面活性劑。在某些實施方案中，提供濃度為0.01%的表面活性劑。在某些實施方案中，提供濃度在臨界膠束濃度(CMC)以下的表面活性劑。在某些上述實施方案中，組合物包含針對人類IL-1Rl的人類單克隆抗體和CMC為0.007%的聚山梨酯20，該聚山梨酯20濃度為
0.004%。在某些實施方案中，提供濃度在CMC以上的該表面活性劑。在某些上述實施方案中，組合物包含a RANKL-1和CMC為0.007%的聚山梨酯20，該聚山梨酯20濃度為0.01%。
[0176]在某些實施方案中，包含至少一種特異性結(jié)合劑、至少一種穩(wěn)定劑、和緩沖劑的組合物將至少一種特異性結(jié)合劑穩(wěn)定化。在某些實施方案中，該特異性結(jié)合劑為RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，特異性結(jié)合劑為RANKL特異性結(jié)合劑，其中該RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為aRANKL-Ι。在某些實施方案中，該特異性結(jié)合劑為TNF特異性結(jié)合劑，其中該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR =Fc0在某些實施方案中，該特異性結(jié)合劑為IL-1Rl特異性結(jié)合劑，其中該IL-1Rl特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，該抗體選自15C4、26F5和27F2，如第2004 / 0097712號美國專利公布中描述。在某些實施方案中，該組合物通過形成更少聚集體或二聚體而提供穩(wěn)定化。在某些實施方案中，該組合物通過形成更少化學(xué)變化形式而提供穩(wěn)定化。
[0177]在某些實施方案中，樣品中特定蛋白分子的聚集和/或化學(xué)變化形式的存在或程度可由本領(lǐng)域已知的合適方法確定，比如尺寸排阻層析(SEC)，又稱為凝膠過濾層析或分子篩層析。在某些實施方案中，確定樣品中聚集體和/或化學(xué)變化形式的存在的合適方法為非變性條件下的凝膠電泳。“凝膠”指由水和例如瓊脂糖或聚合丙烯酰胺等多聚體組成的基質(zhì)。這些方法在基于比較分子大小和凝膠孔大小的基礎(chǔ)上分離分子。測量聚集和/或化學(xué)變化形式的某些其他方法包括但不限于疏水相互作用層析(HIC)和高效液相層析(HPLC)。HPLC以基于任何一種吸附、離子交換、尺寸排阻、HIC或反相層析法的方法提供分離。HIC基于蛋白疏水部分與基質(zhì)中不可溶的固定的疏水基團之間的表面疏水性分離天然蛋白。通常，在HIC柱中上樣在高鹽緩沖液中制備的蛋白。緩沖液中的鹽與水分子相互作用以減少溶液中的蛋白溶劑化，由此將蛋白的疏水區(qū)暴露，然后被基質(zhì)上的疏水基團吸附。分子疏水性越強，促進結(jié)合所需的鹽就越少。通常，降低的鹽梯度用于將蛋白從柱上洗脫。隨著離子強度的降低，蛋白親水區(qū)的暴露增多，蛋白以疏水性增加的順序從柱上洗脫。參見例如Protein Purification (蛋白純化)，第 2 版，Springer-Verlag, New York, 176-179 (1988)。在某些實施方案中，通過使用高分辨率柱和減少柱保留時間來加強分離。例如參見例如Chicz 等，Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)182，第 392-421 頁(1990)。其他的典型的監(jiān)測蛋白穩(wěn)定性的方法可見Lee，V.，編著.Peptide and Protein Drug Delivery (肽和蛋白藥物遞送)(Marcel Dekker, Inc.,New YorkiNew York, 1991) □在某些實施方案中，蛋白的穩(wěn)定性在某一溫度下一段特定時間后測量。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑在儲存于室溫下(介于21°C和29°C之間)的組合物中穩(wěn)定化。典型的儲存時間包括但不限于至少I個月、至少3個月、至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月和至少24個月。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑在儲存于2°C和8°C之間的組合物中穩(wěn)定化。典型的儲存時間包括但不限于至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月和至少24個月。
[0178]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑被制備、純化和配制為液態(tài)藥物組合物。在某些實施方案中，在制備和純化后，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑在配制前被儲存。在某些上述實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑被冷凍，比如在_20°C或更低溫度下。在某些上述實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑在室溫下解凍用于進一步配制。在某些實施方案中，液態(tài)藥物制劑包含治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，根據(jù)例如給藥途徑和期望劑量體積，制劑中配制RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的量由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。在某些實施方案中，藥物制劑包含濃度為Img / ml到150mg / ml的RANKL特異性結(jié)合劑。在某些上述實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為aRANKL-Ι。在某些實施方案中，藥物制劑包含濃度為Img /ml到150mg / ml的TNF特異性結(jié)合劑。在某些上述實施方案中，該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR:Fc。在某些實施方案中，藥物制劑包含濃度為Img / ml到200mg / ml的IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些上述實施方案中，該IL-1Rl特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，該抗體選自15C4、26F5和27F2，如第2004 / 0097712號美國專利公布中描述。在某些實施方案中，藥物制劑包含治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑和維持制劑pH值低于6.6的緩沖劑。在某些實施方案中，緩沖劑將該制劑的PH值維持于4.5與5.5之間。在某些上述實施方案中，緩沖劑將該制劑的PH值維持于5.2。在某些實施方案中，藥物制劑包含治療有效量的IL-1Rl特異性結(jié)合劑和維持制劑pH值低于6.6的緩沖劑。在某些實施方案中，緩沖劑將該制劑的PH值維持于4.5與5.5之間。在某些上述實施方案中，緩沖劑將該制劑的pH值維持于5.0。在某些實施方案中，藥物制劑包含治療有效量的TNF特異性結(jié)合劑和維持制劑PH值于5.5與6.5之間的緩沖劑。在某些上述實施方案中，緩沖劑將該制劑的pH值維持于6.3。
[0179]在某些實施方案中，包括但不限于與特定蛋白結(jié)合并阻止其與其他結(jié)合化合物相互作用的抗體和可溶性多肽的特異性結(jié)合劑可能具有治療用途。在此種應(yīng)用中，當(dāng)討論到使用抗體或可溶性多肽治療疾病或疾患的時候，所述用途可包括使用包含抗體或可溶性多肽的組合物；和/或包含抗體或可溶性多肽和一種或多種另外的活性成分的聯(lián)合療法。當(dāng)抗體或可溶性多肽用于“治療”疾病或疾患時，所述治療可包括或不包括對疾病或疾患的預(yù)防。
[0180]在某些實施方`案中，包括但不限于抗體或可溶性多肽的特異性結(jié)合劑單獨給藥。在某些實施方案中，抗體或可溶性多肽在至少一種其他治療劑之前給藥。在某些實施方案中，抗體或可溶性多肽與至少一種治療劑同時給藥。在某些實施方案中，抗體或可溶性多肽在至少一種治療劑之后給藥。典型治療劑包括但不限于至少一種癌癥治療劑。典型癌癥治療劑包括但不限于放療和化療。
[0181]在某些實施方案中，包含例如抗體或可溶性多肽等特異性結(jié)合劑的藥物組合物可用于在聯(lián)合療法中給藥，也就是說，和其他藥劑組合。典型藥劑包括但不限于體外合成制備的化學(xué)組合物、抗體、抗原結(jié)合區(qū)、放射性核素，和其組合或共軛物。在某些實施方案中，藥劑可起到激動劑、拮抗劑、變構(gòu)調(diào)節(jié)劑或毒素的作用。在某些實施方案中，藥劑可起到抑制或刺激其靶標(biāo)(例如受體或酶的活化或抑制)的作用，由此促進細(xì)胞死亡或阻滯細(xì)胞生長。在某些實施方案中，所述聯(lián)合療法包括RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑與至少一種抗血管生成劑的組合。在某些實施方案中，該RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為aRANKL-Ι。在某些實施方案中，該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR =Fc0在某些實施方案中，該IL-1Rl特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，該抗體選自15C4、26F5和27F2，如第2004 / 0097712號美國專利公布中描述。
[0182]典型化療療法包括但不限于抗腫瘤劑，其包括但不限于烷化劑，包括但不限于:氮芥；亞硝基脲；氮雜環(huán)丙烷/甲基密胺；烷基磺酸鹽；抗代謝藥物；嘧啶類似物；嘌呤類似物；天然產(chǎn)品，包括但不限于:抗有絲分裂藥物、長春花生物堿、鬼白毒素；抗生素；酶；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑；各種藥劑，包括但不限于:鉬配位絡(luò)合物；蒽醌類(anthracenediones);取代脲；甲基肼衍生物；腎上腺皮質(zhì)抑制劑；激素和拮抗劑。
[0183]可與RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑共同給藥的典型癌癥療法包括但不限于靶向治療。典型靶向治療包括但不限于使用治療性抗體。典型治療性抗體包括但是不限于小鼠抗體、小鼠-人類嵌合抗體、CDR嫁接抗體、人源化抗體和完全人類抗體，以及合成抗體，包括但不限于由篩選抗體文庫而選擇的抗體。典型抗體包括但不限于結(jié)合于腫瘤細(xì)胞上呈現(xiàn)的細(xì)胞表面蛋白Her2、⑶C20、⑶C33、粘蛋白樣糖蛋白、VEGF、和表皮生長因子受體(EGFR)，并任選地在呈現(xiàn)所述蛋白的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞抑制性和/或細(xì)胞毒性效應(yīng)的抗體。`
[0184]在某些實施方案中，癌癥治療劑為降低血管生成的抗血管生成劑。在某些實施方案中，癌癥治療劑為血管生成抑制劑。
[0185]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑可在癌癥治療劑治療之前、同時、或之后給藥。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑可進行預(yù)防性給藥以阻止或減輕癌轉(zhuǎn)移開始的骨丟失。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑被給藥以治療由于轉(zhuǎn)移的骨丟失的現(xiàn)存疾患。
[0186]典型癌癥包括但不限于乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、遺傳性和散發(fā)性乳頭狀腎癌、白血病、淋巴瘤、李弗勞梅尼綜合征、惡性胸膜間皮瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌和膀胱移行細(xì)胞癌。
[0187]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑可單獨使用或與至少一種另外的治療劑一起使用以治療癌癥。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑與治療有效量的另外一種治療劑共同使用。
[0188]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑與一種或多種特定治療劑一起使用以治療各種癌癥。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑與一種或多種特定治療劑一起使用以治療或預(yù)防瘧疾。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑與一種或多種特定治療劑一起使用以治療或預(yù)防糖尿病增生性視網(wǎng)膜病變。在某些實施方案中，視疾患和期望治療水平而定，可給藥兩種、三種或更多種藥劑。在某些實施方案中，所述藥劑可通過被包含于同一制劑中而一起提供。在某些實施方案中，所述藥劑與RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑可通過被包含于同一制劑中而一起提供。在某些實施方案中，所述藥劑可單獨配制并通過被包括在治療藥盒中而一起提供。在某些實施方案中，所述藥劑與RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑可單獨配制并通過被包括在治療藥盒中而一起提供。在某些實施方案中，可分別提供所述藥劑。在某些實施方案中，當(dāng)使用基因治療給藥時，編碼蛋白藥劑和/或RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的各基因可被包含于同一載體中。在某些實施方案中，編碼蛋白藥劑和/或RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的各基因可處于同一啟動子區(qū)的控制之下。在某些實施方案中，編碼蛋白藥劑和/或RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的各基因可處于不同載體中。
[0189]應(yīng)了解的是，個體患者對前述藥物或聯(lián)合治療可產(chǎn)生不同反應(yīng)，可由醫(yī)生決定對于每個患者適合的有效的藥物組合。
[0190]在某些實施方案中，提供包含RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑以及 藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。
[0191]在某些實施方案中，提供包含RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑和治療有效量的至少一種另外的治療劑、以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。
[0192]在某些實施方案中，提供包括RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑以及至少一種絲氨酸蛋白酶抑制劑的療法，以及使用該療法的治療方法。在某些實施方案中，療法包括RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、以及至少一種本文所述的另外的藥劑。
[0193]在某些實施方案中，打亂蛋白酶/蛋白酶抑制劑的平衡可導(dǎo)致蛋白酶介導(dǎo)的組織破壞，包括但不限于由腫瘤入侵正常組織導(dǎo)致的癌癥轉(zhuǎn)移。
[0194]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑可與用于炎癥的至少一種治療劑一起使用。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑可與用于免疫功能紊亂的至少一種治療劑一起使用。某些典型的用于炎癥的治療劑已描述在，例如，C.A.Dinarello和 L.L.Moldawer Proinflammatory and Ant1-1nflammatory Cytokines in RheumatoidArthritis:A Primer for Clinicians (在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的促炎性和抗炎性的細(xì)胞因子:臨床醫(yī)生初級讀本)第3版(2001) Amgen Inc.Thousand Oaks, CA中。
[0195]在某些實施方案中，藥物組合物包括多于一種的不同的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些上述實施方案中，所述多于一種RANKL特異性結(jié)合劑與多于一個表位結(jié)合。在某些上述實施方案中，所述多于一種TNF特異性結(jié)合劑與多于一個表位結(jié)合。在某些上述實施方案中，所述多于一種IL-1Rl特異性結(jié)合劑與多于一個表位結(jié)合。
[0196]在某些實施方案中，包含一種或多種RANKL特異性結(jié)合劑、一種或多種TNF特異性結(jié)合劑、和/或一種或多種IL-1Rl特異性結(jié)合劑的液態(tài)組合物被制備為含水或非含水溶液或懸浮液，用于后來為患者給藥。
[0197]在某些實施方案中，組合物的材料在所用劑量和濃度對接受者無毒。
[0198]在某些實施方案中，藥物 組合物包含用于修改、維持或保持以下方面的材料:例如組合物的pH值、滲透壓、粘度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌、穩(wěn)定性、溶出或釋放率、吸附或滲透。典型配制材料包括但不限于油類、維生素、鹽類、氨基酸(包括但不限于非極性氨基酸(包括但不限于丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸))；抗菌素；抗氧化劑(包括但不限于抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(包括但不限于醋酸鹽、組氨酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽或丙酸鹽)；增量劑(包括但不限于甘露醇或甘氨酸)；螯合劑(包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA));絡(luò)合劑(包括但不限于咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、環(huán)糊精或羥丙基環(huán)糊精)；填料；糖或糖醇(包括但不限于單糖、二糖、多糖或水溶性聚糖)；其他碳水化合物，比如，糖類或葡聚糖(包括但不限于果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、α與β環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉、羧甲基纖維素、或其混合物)；糖醇(包括但不限于甘露醇或山梨醇)；蛋白質(zhì)(包括但不限于血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮，包括但不限于平均分子量2，000至3，000的聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇，包括但不限于平均分子量3，000至5，000的聚乙二醇)；低分子量多肽；鹽形成平衡離子(包括但不限于鈉)；防腐劑(包括但不限于苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、洗必泰、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(包括但不限于甘油或丙二醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(包括但不限于聚氧丙烯-聚氧乙烯酯(Pluronic? )、聚乙二醇、山梨糖醇酯、聚山梨酯，包括但不限于聚山梨酯20、聚山梨酯80、三硝基甲苯、氨丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal));穩(wěn)定劑(包括但不限于非極性氨基酸)；張力促進劑(包括但不限于堿金屬鹵化物，例如，氯化鈉或氯化鉀、甘露醇山梨醇)；遞送運載體；稀釋劑；賦形劑和/或藥物佐劑。(Remington, s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科學(xué))，第18版，A.R.Gennaro 編著，Mack Publishing Company (1990)。
[0199]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑連接于本領(lǐng)域已知的延長半衰期的運載體上。所述運載體包括但不限于Fe結(jié)構(gòu)域、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯化多元醇和葡聚糖。所述運載體與方法已描述在，例如第 4，179，337 ;4，495，285 ;4，609，546 ;4，766，106 ;6，660，843 號美國專利和已公布的第W099 / 25044號PCT申請中。在某些情況中，PEG在室溫下溶于水并具有通式=R(O-CH2-CH2)n0-R，其中R為氫，或保護基，包括但不限于烷基或烷醇基，并且其中“η”為正整數(shù)。在某些實施方案中，該保護基具有I到8個碳原子。在某些上述實施方案中，該保護基為甲基。在某些實施方案中，“η”介于I到1，OOO之間。在某些實施方案中，PEG的平均分子量介于
I,000到40，000之間。所述范圍和本申請中所討論的任何范圍均包括端點和端點間的所有值。在某些實施方案中，PEG具有至少一個羥基。在某些所上實施方案中，該羥基為末端羥基。在某些上述實施方案中，該末端羥基被N-羥基琥珀酰亞胺活化，以與RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑上的自由氨基反應(yīng)生成共價地共軛的分子。在某些實施方案中，可改變反應(yīng)性基團的類型和量以獲得共價地共軛的PEG /特異性結(jié)合劑。共軛的PEG分子的制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。
[0200]在某些實施方案中，延長半衰期的運載體為聚氧乙烯化多元醇。典型聚氧乙烯化多元醇包括但不限于聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖和聚氧乙烯化甘油(POG)。在某些實施方案中，POG的平均分子量介于1，000到40，000之間。所述范圍和本申請中所討論的任何范圍均包括端點和端點間的所有值。POG的某些典型結(jié)構(gòu)見于，例如，Knauf等，J.Biol.Chem.263:15064-15070(1988)中。某些典型 POG 共軛物見于，例如第 4，766，106 號美國專利中。
[0201]在某些實施方案中，最佳的藥物組合物由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)以下所列決定:例如，預(yù)期給藥途徑、遞送安排和期望劑量。參見例如Remington ' s PharmaceuticalSciences (雷明頓藥物科學(xué))，同上。在某些實施方案中，所述組合物可能影響本發(fā)明抗體的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清除率。
[0202]在某些實施方案中，藥物組合物中的主要運載體或載體本質(zhì)上為含水的。例如，在某些實施方案中，合適的運載體或載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或合成腦脊髓液，并可能補充有腸胃外給藥組合物中常用的其他材料。在某些實施方案中，該運載體或載體是無菌的。在某些實施方案中，包括了另外的組分。典型的另外組分包括但不限于不揮發(fā)油；聚乙二醇；甘油；丙二醇和其他合成溶劑；抗菌劑，包括但不限于苯甲醇和尼泊金甲酯；抗氧化劑，包括但不限于抗壞血酸 和亞硫酸氫鈉；以及螯合劑，包括但不限于乙二胺四乙酸。在某些實施方案中，中性緩沖鹽水或鹽水與血清白蛋白混合為進一步的典型運載體。在某些實施方案中，藥物組合物包含pH值為約7.0-8.5的Tris緩沖液，或pH值為約5.0-5.5的醋酸鹽緩沖液，或pH值為約5.0-5.5的谷氨酸鹽緩沖液，或pH值為約5.0-5.5的琥珀酸鹽緩沖液，或PH值為約5.0-5.5的組氨酸緩沖液，或pH值為約5.0-5.5的天門氨酸鹽緩沖液，或PH值為約6.0-6.5的磷酸鹽緩沖液，其中可能還包含蔗糖、山梨醇、或其合適替代物。在某些實施方案中，藥物組合物具有自身緩沖性。參見例如，公開于2006年12月28日的第PCT / US2006 / 022599號國際專利申請。在某些實施方案中，包含RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑，且包括或不包括至少一種另外的治療劑的組合物，可通過將所選的具有所需純度的組合物與任選配制劑(Remington' sPharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科學(xué))，同上)混合為含水溶液形式而制備用于儲存。在某些實施方案中，藥物組合物密封于容器中。典型容器包括但不限于安瓿、一次性注射器，包括但不限于適用于預(yù)填充的一次性注射器，和玻璃或塑料制的多劑量管型瓶。在某些實施方案中，包含RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的組合物被放置于預(yù)充式注射器中。在某些實施方案中，該RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為aRANKL-Ι。在某些實施方案中，該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR =Fc0在某些實施方案中，該IL-1Rl特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，該抗體選自15C4、26F5和27F2，如第2004 / 0097712號美國專利公布中描述。適用于預(yù)填充的典型注射器已描述在，例如第5，607，400號美國專利中。適用于預(yù)填充的注射器于多家廠商有售，例如，Daikyo Seiko, Ltd (Tokyo, Japan) > Becton-Dickinson (FranklinLakes,NJ)、Bunder Glass(Diisseldorf, Germany)和Schott-Forma Vitrum(Lebanon,PA)。
[0203]在某些實施方案中，可為了腸胃外遞送而選擇藥物組合物。典型腸胃外遞送包括但不限于靜脈、肌內(nèi)、皮內(nèi)或皮下給藥。在某些實施方案中，可為了經(jīng)由消化道遞送，例如口月艮，而選擇組合物。所述藥學(xué)上可接受的組合物的制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。
[0204]在某些實施方案中，制劑中的成分以給藥位點可接受的濃度存在。在某些實施方案中，藥物組合物包含治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑以及緩沖劑。在某些實施方案中，該RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為aRANKL-Ι。在某些實施方案中，該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR =Fc0在某些實施方案中，該IL-1Rl特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，該抗體選自15C4、26F5和27F2，如第2004 / 0097712號美國專利公布中描述。在某些實施方案中，緩沖劑用于維持組合物在生理PH值或在稍低的pH值。在某些實施方案中，緩沖劑在pH值5.5和pH值8.0之間。在某些實施方案中，緩沖劑在pH值5.5和pH值6.5之間。在某些實施方案中，緩沖劑在pH值4.5和pH值5.5之間。典型緩沖劑包括但不限于酸類和/或其鹽類，包括但不限于丁二酸或丁二酸鹽、檸檬酸或檸檬酸鹽、乙酸或乙酸鹽、酒石酸或酒石酸鹽、磷酸或磷酸鹽、丙酸或丙酸鹽、葡糖酸或葡糖酸鹽、谷氨酸或谷氨酸鹽、組氨酸、甘氨酸、天門氨酸或天門氨酸鹽、馬來酸或馬來酸鹽、蘋果酸或蘋果酸鹽緩沖劑。在某些情況下，“鹽”指由酸的陰離子與帶相反電荷的離子生成的電中性物質(zhì)。在某些所述情況下，帶相反電荷的離子稱為“平衡離子”。典型平衡離子包括但不限于鈉、鉀、銨、鈣和鎂。在某些實施方案中，制劑中緩沖劑的濃度介于ImM和50mM之間。在某些實施方案中，制劑中緩沖劑的濃度介于5mM和30mM之間。在某些實施方案中，制劑中緩沖劑的濃度介于IOmM和25mM之間。所述范圍和本申請中所討論的任何范圍均包括端點和端點間的所有值。在某些實施方案中，制劑中緩沖劑的濃度為10mM。在某些實施方案中，制劑中緩沖劑的濃度為25mM。
[0205]在某些實施方案中，藥物制劑包含濃度為Img / ml到200mg / ml的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑以及緩沖劑。在某些實施方案中，該緩沖劑的濃度介于ImM和50mM之間，并且該制劑的pH值低于6.6。在某些上述實施方案中，該藥物制劑包含濃度為60mg / ml的RANKL特異性結(jié)合劑和濃度為IOmM的緩沖劑，并且該制劑的PH值為5.2。在某些實施方案中，該RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為a RANKL-1。在某些上述實施方案中，藥物制劑包含濃度為50mg / ml的TNF特異性結(jié)合劑和濃度為25mM的緩沖劑，并且該制劑的pH值為6.3。在某些實施方案中，該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR =Fc0[0206]在某些實施方案中，藥物制劑包含治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑以及緩沖液劑。在某些實施方案中，該緩沖劑為濃度為維持制劑PH值低于6.6的磷酸鹽緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑。在某些實施方案中，該制劑的PH值介于4.0到6.0之間。術(shù)語“磷酸鹽緩沖劑”指包含磷酸鹽的緩沖劑。術(shù)語“醋酸鹽緩沖劑”指包含醋酸鹽的緩沖劑。在某些實施方案中，磷酸鹽或醋酸鹽的平衡離子為鈉。在某些上述實施方案中，該緩沖劑為磷酸鈉或醋酸鈉。其他典型平衡離子包括但不限于鉀、銨、鈣和鎂。在某些實施方案中，制劑中磷酸鹽緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑的濃度介于ImM到50mM之間。在某些實施方案中，制劑中磷酸鹽緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑的濃度介于5mM到30mM之間。在某些實施方案中，制劑中磷酸鹽緩沖基或醋酸鹽緩沖劑的濃度介于IOmM到25mM之間。所述范圍和本申請中所討論的任何范圍均包括端點和端點間的所有值。在某些實施方案中，制劑中磷酸鹽緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑的濃度為10mM。在某些實施方案中，制劑中磷酸鹽緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑的濃度為25mM。在某些實施方案中，藥物制劑包含濃度為Img /ml到200mg / ml的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑以及緩沖劑。在某些實施方案中，該緩沖劑為磷酸鹽緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑，其濃度介于ImM和50mM之間，并且該制劑的pH值低于6.6。在某些上述實施方案中，藥物制劑包含濃度為60mg / ml的RANKL特異性結(jié)合劑和濃度為IOmM的醋酸鹽緩沖劑，該制劑的pH值為5.2。在某些實施方案中，該RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為aRANKL-Ι。在某些實施方案中，藥物制劑包含濃度為50mg / ml的TNF特異性結(jié)合劑和濃度為25mM的磷酸鹽緩沖劑，該制劑的pH值為6.3。在某些上述實施方案中，該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR=Fc0
[0207]在某些實施方案中，藥物制劑包含治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑；濃度為維持制劑的pH值低于6.6的緩沖劑；和足夠保證制劑為等滲的量的等滲劑。在某些實施方案中，該緩沖劑為磷酸鹽緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑。“等滲”的制劑具有介于270m0sm和370m0Sm之間的同滲濃度。在某些實施方案中，制劑的PH值介于4.0到6.0之間。確定溶液等滲性的某些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。參見例如,Setnikar等,J.Am.Pharm.Assoc.48:628-30 (1959)。典型等滲劑包括但不限于氯化鈉；氨基酸，包括但不限于丙氨酸、精氨酸、纈氨酸和甘氨酸；糖和糖醇(多元醇)，包括但不限于葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、海藻糖、甘油、山梨醇和木糖醇；醋酸，其他有機酸及其鹽類，以及相對少量的檸檬酸鹽或磷酸鹽。在某些實施方案中，等滲劑以至少為5%的濃度提供。在某些實施方案中，等滲劑為濃度為9%的蔗糖。
[0208]在某些實施方案中，藥物制劑包含治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑；濃度為維持制劑的pH值低于6.6的緩沖劑；和表面活性劑。在某些實施方案中，該緩沖劑為磷酸鹽緩沖劑或醋酸鹽緩沖劑。在某些實施方案中，制劑的pH值介于4.0到6.0之間。在某些實施方案中，該表面活性劑為非離子表面活性劑。某些典型的非離子表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯山梨醇酯(聚山梨酯)、聚氧丙烯-聚氧乙烯酯(Pluromc? )、聚氧乙烯醇、西甲硅油、聚乙二醇、溶血卵磷脂和聚氧乙烯-p-t-辛基苯酚。某些典型表面活性劑包括但不限于PEG8000、聚山梨酯80(Tween?80)和聚山梨酯20 (Tween? 20)。在某些實施方案中，提供濃度介于0.001%和1.0 %之間的表面活性劑。在某些實施方案中，提供濃度介于0.003%和0.3%之間的表面活性劑。在某些實施方案中，提供濃度為0.01%的表面活性劑。所述范圍和本申請中所討論的任何范圍均包括端點和端點間的所有值。
[0209]在某些實施方案中，當(dāng)預(yù)期腸胃外給藥的時候，治療組合物可能為藥學(xué)上可接受的運載體中的無熱原的、腸胃外可接受的水溶液形式，包含所需的RANKL特異性結(jié)合劑、所需的TNF特異性結(jié)合劑、和/或所需的IL-1Rl特異性結(jié)合劑，含有或不含有另外的治療劑。在某些實施方案中，用于腸胃外注射的運載體為無菌蒸餾水，其中RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑，以及帶有或不帶有至少一種另外的治療劑被配制為無菌的等滲溶液，并妥善保存。在某些實施方案中，制備可包括將所需分子與試劑一起配制，所述試劑比如可注射微球、可生物侵蝕顆粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚羥乙酸)、微珠或脂質(zhì)體，由此，當(dāng)該產(chǎn)品隨后以長效注射的方式遞送時，可提供產(chǎn)品的控制釋放或持續(xù)釋放。在某些實施方案中，也可以使用透明質(zhì)酸，并可具有促進在血液循環(huán)中持久的持續(xù)時間的效果。在某些實施方案中，可使用可植入式藥物遞送裝置來引入所需的分子。
[0210]在持續(xù)或控制遞送的制劑中的另外的藥物組合物對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，包括含有RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑，包含或不包含至少一種另外治療劑的制劑。在某些實施方案中，用于配制多種其他持續(xù)或控制遞送運載體的技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，所述運載體諸如脂質(zhì)體載體、生物可侵蝕性微粒、或多孔微珠和長效注射液。參見例如PCT申請第PCT/US93 / 00829號，其中描述了用于遞送藥物組合物的多孔聚合微粒的控制釋放。在某些實施方案中，持續(xù)釋放制品可包括成型形式的半透聚合物基質(zhì)，例如，薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(U.S.3，773，919和EP058, 481)、L-谷氨酸和Y -L-谷氨酸乙酯共聚體(Sidman 等., Biopolymers, 22:547-556 (1983))、聚(2-輕乙基甲基丙烯酸酯)(Langer 等,J.Biomed.Mater.Res., 15:167-277(1981)和 Langer, Chem.Tech., 12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等，同上)或聚D(-)-3-羥基丁酸(EP133, 988)。在某些實施方案中，持續(xù)釋放組合物也可包括脂質(zhì)體，并可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的多種方法中的任一種方法制備。參見例如，Gabizon 等，Cancer Research42:4734-4739 (1982) ;Eppstein 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82:3688-3692 (1985) ；Szoka 等，Ann.Rev.Biophys.Eng.9:467-508(1980) ；EP036, 676 ;EP088, 046和EP143, 949。在某些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的藥物遞送系統(tǒng)。所述藥物遞送系統(tǒng)已在下列文獻中描述，例如:Poznansky等，DrugDelivery Systems (藥物遞送系統(tǒng))，R.L.Juliano 編著，Oxford, N.Y.,第 253-315 頁(1980) ;Poznansky 等，Pharmacol Rev.36:277-336 (1984)。
[0211]體內(nèi)給藥所用的藥物組合物通常為無菌。在某些實施方案中，可通過使用無菌過濾膜過濾達到無菌。在某些實施方案中，腸胃外組合物通常被置于帶有無菌入口的容器中，例如，帶有可由皮下注射針刺破的塞子的靜脈注射袋或管。在某些實施方案中，腸胃外組合物被置于適于預(yù)填充組合物的注射器中。
[0212]在某些實施方案中，將用于治療的包含RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異 性結(jié)合劑、包含或不包含至少一種另外的治療劑的藥物組合物的有效量將依賴于，比如，治療環(huán)境和目標(biāo)。根據(jù)某些實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，用于治療的合適的劑量水平將因此部分地根據(jù)以下方面而變化:遞送的分子；所用的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑、包含或不包含至少一種另外的治療劑的適應(yīng)癥；給藥途徑；和患者尺寸(體重、身高、體表面積和/或器官大小)和/或患者情況(年齡、身體狀況、和/或總體健康狀況)。在某些實施方案中，臨床醫(yī)生在使用RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑、包含或不包含至少一種另外的治療劑時，要考慮到疾病的嚴(yán)重度和病史。在某些實施方案中，臨床醫(yī)生可效價劑量和調(diào)整給藥途徑以達到最優(yōu)治療效果。在某些實施方案中，根據(jù)以上所述因素，典型劑量可在約0.1yg / kg到多達約IOOmg / kg或更高的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，經(jīng)受治療的患者的體重越重，在治療中所用RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的劑量越大。在某些實施方案中，該劑量可在0.1 μ g / kg到多達約IOOmg / kg的范圍內(nèi)/ kg到多達約IOOmg / kg的范圍；或5 μ g / kg到多達約IOOmg / kg的范圍內(nèi)ο [0213]在某些實施方案中，給藥頻率要考慮到制劑中所用的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的藥代動力學(xué)參數(shù)。在某些實施方案中，臨床醫(yī)生將給藥組合物直到達到實現(xiàn)了所需效果的劑量。在某些實施方案中，該組合物可因此以單劑量給藥，或隨著時間以雙劑量或多劑量給藥(其中雙劑量或多劑量可包含相同或不相同量的所需分子)，或通過植入裝置或?qū)Ч艹掷m(xù)輸液。合適劑量的進一步明確由本領(lǐng)域技術(shù)人員例行地進行，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的例行工作范圍之內(nèi)。在某些實施方案中，治療中所用的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的有效劑量隨著患者的治療過程而增加。在某些實施方案中，治療中所用的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的有效劑量隨著患者的治療過程而減少。在某些實施方案中，可根據(jù)使用合適的劑量-反應(yīng)關(guān)系數(shù)據(jù)來確定合適的劑量。
[0214]在某些實施方案中，給藥方案包括在治療階段的第1、7、14和21天使用治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑進行初始給藥，包含或不包含至少一種另外的治療劑。在某些實施方案中，給藥方案包括在治療階段中一周的第1、2、3、4、5、6和7天使用治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑進行初始給藥，包含或不包含至少一種另外的治療劑。在某些實施方案中，給藥方案包括在治療階段中一周的第1、3、5和7天使用治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑進行初始給藥，包含或不包含至少一種另外的治療劑。在某些實施方案中，給藥方案包括在治療階段中一周的第I天和第3天使用有效劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑進行初始給藥，包含或不包含至少一種另外的治療劑。在某些實施方案中，給藥方案包括在治療階段中一周的第I天使用治療有效量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑進行初始給藥，包含或不包含至少一種另外的治療劑。在某些實施方案中，治療階段包括I周、兩周、3周、I個月、3個月、6個月、I年或更長時間。在某些實施方案中，治療階段以I天、I周、2周、I個月、3個月、6個月、一年或更長時間彼此相繼或相隔。
[0215]在某些實施方案中，在治療階段中可在每次給藥時使用相同治療有效劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，在治療階段中可在每次給藥時使用不同治療有效劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些實施方案中，在治療階段中可在某些給藥時使用相同治療有效劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑給藥，而在某些其它給藥時使用不同治療有效劑量。
[0216]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的初始治療有效劑量在較低劑量范圍內(nèi)，例如，從0.1yg / kg到多達20mg / kg,后續(xù)劑量在更高的劑量范圍，例如，從20mg / kg到多達IOOmg / kg。在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的初始治療有效劑量在較高劑量范圍內(nèi)，例如，從20mg / kg到多達IOOmg / kg，后續(xù)劑量在更低的劑量范圍，例如，從0.lyg/ kg到多達20mg / kg。所述范圍和本申請中所討論的任何范圍均包括端點和端點間的所有值。
[0217]在某些實施方案中，初始治療有效劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑以“負(fù)荷劑量”給藥?！柏?fù)荷劑量“指對患者進行RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑給藥的初始劑量，其中所給藥的該RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的劑量在較高劑量范圍內(nèi)，例如從20mg / kg到多達IOOmg / kg。所述范圍和本申請中所討論的任何范圍均包括端點和端點間的所有值。在某些實施方案中，該負(fù)荷劑量以單次施用給藥，例如，包括但不限于單次靜脈輸液。在某些實施方案中，該負(fù)荷劑量以多次施用給藥，例如，包括但不限于多次靜脈輸液。在某些實施方案中，該負(fù)荷劑量經(jīng)24小時的階段給藥。在某些實施方案中，負(fù)荷劑量給藥以后，向患者給藥一個或多個另外的治療有效劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。在某些上述實施方案中，該后續(xù)治療有效劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑根據(jù)以周計的給藥計劃來給藥，例如，包括但不限于每兩周一次、每三周一次、或每四周一次。在某些上述實施方案中，后續(xù)治療有效劑量的劑量在較低劑量范圍內(nèi)，例如，從0.1yg / kg到多達20mg / kg ο
[0218]在某些實施方案中，在負(fù)荷劑量給藥后，向患者根據(jù)“維持計劃”給藥一個或多個另外的治療有效劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。典型維持計劃包括但不限于每月一次、六周一次、兩個月一次、十周一次、三個月一次、14周一次、四個月一次、18周一次、五個月一次、22周一次、六個月一次、七個月一次、八個月一次、九個月一次、十個月一次、十一個月一次、十二個月一次給藥。在某些實施方案中，后續(xù)劑量以較頻繁的間隔給藥，例如，每兩周一次到每個月一次。在某些上述實施方案中，后續(xù)劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑在較低劑量范圍內(nèi)，例如從0.1yg / kg到多達20mg / kg。在某些實施方案中，后續(xù)劑量以較不頻繁的間隔給藥，例如，每月一次到每十二個月一次。在某些上述實施方案中，后續(xù)劑量的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑在較高劑量范圍內(nèi)，例如從20mg / kg到多達IOOmg / kg。
[0219]在某些實施方案中，藥物組合物的給藥途徑與已知方法相符合，例如，口服、通過靜脈、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(腦實質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、或病灶內(nèi)途徑注射；通過持續(xù)性釋放系統(tǒng)或通過植入裝置。在某些實施方案中，組合物可由推注注射或持續(xù)輸液，或植入裝置給藥。`[0220]在某些實施方案中，靜脈給藥通過持續(xù)I到10小時的輸液來進行。在某些實施方案中，靜脈給藥通過持續(xù)I到8小時的輸液來進行。在某些實施方案中，靜脈給藥通過持續(xù)2到7小時的輸液來進行。在某些實施方案中，靜脈給藥通過持續(xù)4到6小時的輸液來進行。所述范圍和本申請中所討論的任何范圍均包括端點和端點間的所有值。在某些實施方案中，輸液時間決定于將用于給藥的RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑。確定某些合適的輸液時間在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。在某些實施方案中，初始輸液經(jīng)4到6小時的時間段提供,后續(xù)輸液遞送較快。在某些實施方案中,后續(xù)輸液經(jīng)I到6小時的時間段給藥。
[0221]在某些實施方案中，RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑和/或任何另外的治療劑可被放置于注射器中并被塞住，使得預(yù)充式注射器的頂空最小。在某些實施方案中，該RANKL特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于RANKL的抗體。在某些實施方案中，該抗體為a RANKL-1。在某些實施方案中，該TNF特異性結(jié)合劑為可溶性TNF受體。在某些實施方案中，該可溶性TNF受體為sTNFR =Fc0在某些實施方案中，該IL-1Rl特異性結(jié)合劑為特異性結(jié)合于IL-1Rl的抗體。在某些實施方案中，該抗體選自15C4、26F5和27F2，如第2004 / 0097712號美國專利公布中描述。在某些實施方案中，裝有RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的注射器使用如下所述的真空塞放置方法或者機械塞放置方法由Flurotec / B2涂層的柱塞塞住，所述柱塞例如，包括但不限于 Daikyo / West (Becton Dickinson,零件號 47165910 和 47165919)和 Dupont (BectonDickinson，零件號 5080958 和 5115079)。
[0222]在某些實施方案中，真空塞放置方法包括使用真空塞放置裝置，例如，包括但不限于 Autoclavable Stopper Placement Unit (ASPU)、Impro Systems Hypak filler,產(chǎn)品號897400。在某些實施方案中，將裝有RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的注射器放置在所述裝置中，并在每平方英寸75磅的入口壓力和設(shè)定為FCl-21”Hg、FC2-6.5” Hg、FC326.5” Hg的真空循環(huán)下塞住。在某些實施方案中，這些設(shè)定導(dǎo)致至少3_的頂空。 在某些實施方案中，由有至少3mm頂空的塞住并預(yù)填充的注射器生成最小頂空的塞住并預(yù)填充的注射器，通過如下人工操縱該塞住并預(yù)填充的注射器以從針頭排出空氣:將注射器的針頭一端向上，使得氣泡上升到針頭底部，將空氣排出針頭，并重新封住針頭。
[0223]在某些實施方案中，機械塞放置方法包括使用機械塞放置裝置，例如，包括但不限于Groninger，SVH200型。在某些具體實施中，將裝有RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的注射器放置在所述裝置中，并機械放置塞子。在某些實施方案中，塞子使用真空放置。在某些實施方案中，在置塞過程中使用排氣管。為了產(chǎn)生具有最小頂空的塞住的預(yù)充式注射器，將塞子放置在含有RANKL特異性結(jié)合劑、TNF特異性結(jié)合劑、和/或IL-1Rl特異性結(jié)合劑的液態(tài)組合物的上表面，以使該塞子盡可能地與液體表面接近，并使塞子下表面與液體上表面之間最大范圍接觸。在某些實施方案中，塞子下表面與彎液面之間的距離最小。
[0224]在某些實施方案中，預(yù)充式并塞住的注射器的頂空由校準(zhǔn)過的卡尺來人工測量。一種典型的校準(zhǔn)卡尺的方法是將其置于完全合上的位置(0.00”)，然后根據(jù)制造商的說明書使用0.050”和4.000”的量塊進行校準(zhǔn)。在某些實施方案中，預(yù)充式并塞住的注射器的頂空由顯微鏡和顯微鏡尺來測量。在某些上述實施方案中，卡尺用于記錄彎液面頂部到柱塞扁平體底部的距離。在某些實施方案中，預(yù)充式并塞住的注射器頂空由光學(xué)比較器測量。典型的光學(xué)比較器是Deltronic DH216,水平光學(xué)比較器(Horizontal OpticalComparator)。在某些所述的實施方案中，通過將注射器垂直放置與光學(xué)透鏡平行來進行測量。將放大的圖像投影到屏幕上用以檢查。光學(xué)比較器上的卡尺用于記錄彎液面頂部與柱塞的扁平體底部之間的距離。在某些實施方案中，頂空為彎液面頂部與柱塞扁平體底部之間以毫米計的距離。
[0225]在某些預(yù)充式注射器中，頂空由2mm到5mm不等。在某些預(yù)充式注射器中，頂空為3mm±0.00254mm。在某些具有最小化頂空的預(yù)充式注射器中，該頂空小于2.9mm、或小于2.7mm、或小于2.5mm、或小于2.3mm、或小于2mm、或小于1.5mm或小于1.0mm,或沒有可檢測
的頂空。
[0226]在某些實施方案中，注射器針筒包含以下材料，比如但不限于玻璃、環(huán)烯烴聚合物(“C0P”)或環(huán)烯烴共聚物(“C0C”)。在某些實施方案中，硅酮涂層被施加于注射器針筒。在某些上述實施方案中，該硅酮涂層為交聯(lián)硅酮、烘烤的高粘度硅酮或噴涂的硅油。在某些實施方案中，硅酮涂層由注射器的制造商施加。某些注射器制造商包括但不限于Daikyo、Schott-Forma Vitrum、Bunder和Becton-Dickinson。在某些實施方案中，注射器針筒不含有硅酮涂層。
[0227]在某些實施方案中，將注射器柱塞涂層。典型注射器柱塞涂層包括但不限于聚四氟乙烯(PTFE)、Teflon?和乙烯四氟乙烯(ETFE)、Flurotee?。在某些實施方案中，涂層由制造商施加。某些制造商包括但不限于Daikyo和Becton-Dickinson。
實施例
[0228]實施例1
[0229]進行以下實驗來評價在某些`條件下，儲存于容器中的特異性結(jié)合劑組合物的穩(wěn)定性。于靜態(tài)儲存條件和運輸后監(jiān)測穩(wěn)定性。具體來說，研究注射器的某些方面以鑒定影響蛋白聚集并在某些條件下導(dǎo)致組合物中形成可見顆粒的參數(shù)。研究了容器和預(yù)充式注射器的封口的多種硅酮涂層。在以下實驗中所使用的特異性結(jié)合劑為aRANKL-1。
[0230]一般方法
[0231]以下實驗中a RANrL-1的濃度在30mg / ml與105mg / ml之間不等。a RANKL-1在IOmM醋酸鈉、5%山梨醇、pH值5.2中配制。在使用管型瓶的實驗中，最終體積為Iml的組合物被放置于3-cc的管型瓶中。在使用注射器的實驗中，使用Iml注射器。容器中的組合物被儲存最多24個月。使用非變性SEC-HPLC或非還原、變性SEC-HPLC監(jiān)測容器中組合物的抗體單體、高分子量物質(zhì)(聚集體)、或低分子量物質(zhì)(例如，由剪切造成的分子)。如下所述目測容器來評估容器中組合物的可見顆粒。
[0232]非變性SEC-HPLC的操作使用兩個具有5 μ m粒度和250人孔徑的串聯(lián)的TSKgelG3000_SWxL7.8mmX300mm柱(Tosoh Bioscience)進行，在帶有二極管陣列的 AgilentllOO系列HPLC上進行檢測。流動相為IOOmM磷酸鈉、500mM氯化鈉、5%乙醇、pH值7.0。流速為0.5ml /分鐘。樣品上樣量為1201^蛋白，并在23511111和28011111監(jiān)測柱洗脫液。層析圖中的積分峰面積用于量化隨著主峰洗脫的單體的量；而高分子量物質(zhì)，又稱為聚集體，則隨著前峰洗脫。
[0233]對容器內(nèi)可見顆粒的目測在Phoenix Imaging Manual Inspection Booth目測柜里進行，產(chǎn)品編號為MIB-100。該目測柜有分開的、不反射的黑色和白色表面。在檢查過程中，該黑色和白色表面的尺寸足夠用作整個容器的背景。目測柜在樣品的位置有提供至少2000Lux的照明的光源。
[0234]為了檢測可見顆粒，將樣品直立于目測柜中眼的水平處，輕輕的晃動或上下翻轉(zhuǎn)容器。注意在晃動或翻轉(zhuǎn)容器的時候不要引入氣泡。每個容器在白色表面前目測大約五秒鐘。然后每個容器在黑色表面前目測大約五秒鐘。在某些情況下，除了光源，還使用放大鏡來確認(rèn)可見顆粒的存在或缺乏。
[0235]對可見顆粒的存在或缺乏如上所述地觀察。接下來每個容器都標(biāo)有一個顆粒計分并如下所述記錄下來。O分表示沒有觀察到顆粒；1分表示觀察到I或2個顆粒；2分表示觀察到3到9個顆粒；3分表示觀察到10到49個顆粒；4分表示觀察到50或更多顆粒。
[0236]靜態(tài)儲存條件下玻璃管型瓶內(nèi)的穩(wěn)定性
[0237]圖1顯示在靜態(tài)條件下于玻璃管型瓶儲存24個月的含有70mg / ml或105mg /ml蛋白濃度的a RANKL-1組合物的非變性SEC-HPLC分析結(jié)果，在如圖所示的多個時間點分析。分析了三批不同批次(批次A、B和C)。圖1㈧顯示主峰(單體)百分比，圖1(B)顯示聚集體(前峰)百分比。結(jié)果表明，靜態(tài)條件下在玻璃管型瓶中儲存于4°C多達24個月的a RANKL-1顯示出極少聚集體形成。該圖也顯示，含70mg / ml蛋白的制劑與含105mg /ml蛋白的制劑所得結(jié)果相似。
[0238] 靜態(tài)儲存條件下預(yù)充式玻璃注射器內(nèi)的穩(wěn)定性
[0239]圖2顯示儲存于預(yù)充式玻璃路厄鎖注射器或預(yù)充式玻璃押針注射器里的a RANKL-1組合物在不同蛋白濃度下的非變性SEC-HPLC結(jié)果，在如圖所示的多個時間點分析。結(jié)果表明，靜態(tài)條件下在預(yù)充式玻璃路厄鎖注射器或預(yù)充式玻璃押針式注射器中儲存于4°C多達24個月的a RANKL-1顯示出極少聚集體的形成。該圖也顯示，含30mg / ml蛋白、70mg / ml蛋白和105mg / ml蛋白的制劑所得結(jié)果相似。
[0240]運輸后預(yù)充式玻璃注射器內(nèi)的穩(wěn)定性
[0241]與以上所討論的穩(wěn)定性結(jié)果不同，含有60mg / ml蛋白的a RANKL-1的預(yù)充式押針注射器，在2°C到8°C的溫度下，空運1050英里以后顯現(xiàn)出目測評價的可見顆粒(未顯示數(shù)據(jù))。
[0242]容器和封口的硅酮涂層對運輸穩(wěn)定性的影響
[0243]進行以下實驗來研究各種注射器和柱塞的材料和涂層對于在運輸后預(yù)充式注射器中形成顆粒的影響。將蛋白濃度為60mg / ml的a RANKL-1組合物放置于不同類型的具有不同類型封口的容器內(nèi)，每個容器如表1和表2所示具有不同硅酮及其他的涂層。本實驗所用容器和封口的制造商和產(chǎn)品編號如表1和表2所示。測試了包含玻璃、環(huán)烯烴聚合物(“C0P”，[ResinCZ?])或環(huán)烯烴共聚物(“coc”)的容器。測試了三種不同的硅酮涂層:烘烤的高粘度硅酮、交聯(lián)硅酮和噴涂的硅油。某些容器沒有包含硅酮涂層。測試了兩種不同的封口涂層:聚四氟乙烯(PTFE) ,Teflon?和乙烯四氟乙烯(ETFE)，F(xiàn)krotee?。
[0244]列于表3的每個實驗組包括10個容器。這些容器在被置于運輸條件下之前在4°c下儲存了最多一周。根據(jù)美國測試與材料協(xié)會(ATSM)具體規(guī)定的條件，運輸條件為使用C167聚氨酯運輸箱在2°C到8°C的溫度下空運。將預(yù)充式注射器從Thousand Oaks,California 空運至 Boulder, Colorado,然后從 Boulder, Colorado 空運至 Thousand Oaks,California，一共兩次飛行(兩個氣壓循環(huán)；每次飛行有一個氣壓循環(huán)，包括起飛和降落)。運輸后，通過目測對每個容器內(nèi)的可見顆粒進行評估。檢查完畢后，對每個容器按照如上一般方法所述分配顆粒計分。結(jié)果(每組10個容器)如表3所示。
[0245]結(jié)果表明，COP注射器的顆粒計分為O或1，每個該種注射器都包括由不含硅酮的高分子量塑料材料制成的針筒。表3，第I組。第I組的注射器封口由PTFE涂層，不含硅酮。表3，第I組。另外，COC注射器的顆粒計分為O或1，每個該種注射器包括由交聯(lián)硅酮涂層的針筒。表3，第2組。第2組的注射器封口由不含硅酮的Flurotec B2涂層。玻璃注射器的顆粒計分也為O或1，每個該種注射器包括不含硅酮或者由烘烤的高粘度硅酮涂層的針筒，并且封口由不含娃酮的Flurotec B2,或Flurotec B2和交聯(lián)娃酮涂層。表3,第3組和第5組。另外，不含硅酮，但是封口涂有Flurotec B2和交聯(lián)硅酮的玻璃管型瓶的顆粒計分為O或I。表3，第6組。相反，針筒由噴涂硅油涂層，而封口由Flurotec B2和交聯(lián)硅酮涂層的玻璃注射器的顆粒計分為4，對應(yīng)最大量的可見顆粒。表3，第4組。由此可見，這些結(jié)果表明，在運輸過程中，預(yù)充式注射器針筒上噴涂上的硅油中的硅酮有助于可見顆粒的形成。
[0246]另外，根據(jù)本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)步驟進行了兩種不同的滅菌方法。這兩種方法為:E-束(伽瑪射線)和蒸汽。測試了兩種不同水平的E-束滅菌，15kGy和25kGy。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滅菌方法和E-束滅菌的水平均不影響顆粒計分(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0247]表1:容器
[0248]
【權(quán)利要求】
1.一種裝有包含特異性結(jié)合劑的組合物的預(yù)充式注射器，其中該組合物與注射器封口之間的頂空為: (a)介于2.5 mm到3.0 mm之間； (b)介于2.0 mm到2.5 mm之間； (c)介于1.5 mm到2.0 mm之間；或 (d)介于1.0 mm到1.5 mm之間， 并且其中該預(yù)充式注射器中所包含的該特異性結(jié)合劑為穩(wěn)定化的， 其中該特異性結(jié)合劑為抑制RANKL與RANK結(jié)合的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)充式注射器，其中該抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、其中重鏈與輕鏈被柔性連接子連接的抗體、Fv分子、最多體、抗原結(jié)合片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2分子、完全人類抗體、人源化抗體和嵌合抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)充式注射器，其中該抗體為aRANKL-Ι，其中aRANKL-1包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈含有SEQ ID NO:2的可變區(qū)和恒定區(qū)，并且該輕鏈含有SEQ IDNO:4的可變區(qū)和恒定區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)充式注射器，其中該抗體為aRANKL-Ι，其中aRANKL-1包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈含有SEQ ID NO:2的可變區(qū)，并且該輕鏈含有SEQ ID N0:4的可變區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)充式注射器，其中該組合物還包含至少` (a)一種另外的藥劑；或 (b)一種穩(wěn)定劑和緩沖劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)充式注射器，其中該至少一種穩(wěn)定劑為表面活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)充式注射器，其中該表面活性劑選自聚山梨酯和聚氧丙烯-聚氧乙烯酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的預(yù)充式注射器，其中該表面活性劑為聚山梨酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的預(yù)充式注射器，其中該聚山梨酯選自聚山梨酯20和聚山梨酯80。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)充式注射器，其中該表面活性劑以0.001%至1%的濃度存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的預(yù)充式注射器，其中該表面活性劑以0.002%至0.5%的濃度存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的預(yù)充式注射器，其中該表面活性劑以0.004%或0.01%的濃度存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)充式注射器，其中該組合物的pH值低于6.6。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的預(yù)充式注射器，其中該組合物的pH值介于5.5和6.5之間。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的預(yù)充式注射器，其中該組合物的pH值為6.3或5.2。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)充式注射器，其中該注射器包括含有硅酮的材料，其中該硅酮為交聯(lián)的或烘烤的。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)充式注射器，其中該注射器不含硅酮，并且該注射器的封口不含硅酮。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)充式注射器,其中該注射器包含高分子量塑料材料,其中該高分子量塑料材料不含硅酮。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的預(yù)充式注射器，其中該高分子量塑料材料包含環(huán)烯烴聚合物或環(huán)烯烴共聚物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)充式注射器，其中該特異性結(jié)合劑的濃度是Img/ml至150 mg/ml ο
21.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1 一 20中任一項所述的預(yù)充式注射器的方法，包括向注射器中引入根據(jù)權(quán)利要求1 一 20中任一項所述的包含特異性結(jié)合劑的組合物，以使該組合物與該注射器封口之間的頂空為: (a)介于2.5 mm到3.0 mm之間； (b)介于2.0 mm到2.5 mm之間； (c)介于1.5 mm到2.0 mm之間；或 (d)介于1.0 mm到1.5 mm之間， 并且其中該預(yù)充式注射器所包含的該特異性結(jié)合劑被穩(wěn)定化。
【文檔編號】A61J1/05GK103720587SQ201310467313
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2009年2月5日 優(yōu)先權(quán)日:2008年2月7日
【發(fā)明者】R.邦克, M.尤, A.惠恩克, M.帕利托, M.里奇, N.斯塔克豪斯 申請人:安姆根有限公司