一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)的制作方法
【專利摘要】一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，包括以下步驟：(1)從紅斑狼瘡患者的非發(fā)病期采集外周靜脈血；(2)通過密度梯度分離法，從血液中分離得到單個(gè)核細(xì)胞；(3)將單個(gè)核細(xì)胞用培養(yǎng)液在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)2h后將上清液倒入新的培養(yǎng)容器中，原培養(yǎng)容器中貼壁細(xì)胞用來分化為DC，新容器中的懸浮細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞；(4)在DC分化的培養(yǎng)液中加入特異抗原，進(jìn)行DC功能化處理；(5)DC和Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)擴(kuò)增；(6)擴(kuò)增后的細(xì)胞用生理鹽水清洗后進(jìn)行靜脈滴注回輸治療紅斑狼瘡。本發(fā)明通過細(xì)胞免疫技術(shù)恢復(fù)免疫系統(tǒng)正常狀態(tài)，而且DC和Treg細(xì)胞屬于人體細(xì)胞，能在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間駐留體內(nèi)，達(dá)到長(zhǎng)期治療效果。
【專利說明】一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體為一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]紅斑狼瘡為全身性、慢性進(jìn)行性反復(fù)發(fā)作和緩解的典型自身免疫性結(jié)締組織病之一。女性發(fā)病多，可侵犯全身多臟器，免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展使早期輕型和不典型的病例能及時(shí)診治，因此除少數(shù)重癥或重要器官受損者外，有些病例可自行緩解，有些只呈一次性發(fā)作，經(jīng)數(shù)月或短暫病程后，癥狀完全消失。治療上由于合理應(yīng)用皮質(zhì)類固醇激素、免疫調(diào)節(jié)劑、血漿交換療法、中西醫(yī)結(jié)合等，紅斑狼瘡患者的十年存活率已達(dá)85%。近年有人認(rèn)為本病為病譜性疾病，其兩極為局限性盤狀紅斑狼瘡和系統(tǒng)性紅斑狼瘡，中間為亞急性皮膚型紅斑狼瘡和深部紅斑狼瘡，二者均可向兩端演變。
[0003]本病目前尚無根治的方法。普遍的西藥治療主要有:1，非甾體類抗炎藥:如消炎痛、阿斯匹林、萘普生、芬必得等，這類藥主要用于發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、肌痛、乏力等癥狀而無明顯臟器損害的患者，但因其對(duì)肝、腎易造成損害，故對(duì)狼瘡性腎炎患者使用時(shí)應(yīng)特別小心；2，抗瘧藥:并不是所有的抗瘧藥都可以治療紅斑狼瘡，這里主要指氯喹，羥基氯喹等。該類藥具有抗炎，免疫抑制作用，對(duì)人體具有光保護(hù)作用，可以緩解紅斑狼瘡患者的皮膚損害，對(duì)控制皮疹，關(guān)節(jié)癥狀，光敏感有一定效果。是治療盤狀紅斑狼瘡的主藥；3，糖皮質(zhì)激素類(簡(jiǎn)稱:激素類)藥:盡管糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期應(yīng)用有不少副作用，但對(duì)大多數(shù)紅斑狼瘡患者來說，選擇此類藥物 仍是最重要的治療方法，尤其對(duì)急性或暴發(fā)性狼瘡或有腎、心、腦、肺等主要臟器損害者更應(yīng)適時(shí)，足量應(yīng)用，其用藥原則是早期，足量，并持續(xù)用藥，早期用量大，隨病情好轉(zhuǎn)應(yīng)逐漸減量。減量速度應(yīng)根據(jù)病情恢復(fù)程度而定，多數(shù)患者一年以后能以5-15mg以下劑量維持；4，免疫抑制劑:此類藥常與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用，也可單獨(dú)使用，主要適用于狼瘡性腎炎、狼瘡肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的患者，對(duì)于撤減激素后疾病易復(fù)發(fā)，激素有效但用量過大出現(xiàn)毒性作用者也較為適宜。這類藥毒副作用較大，特別是引起骨髓抑制及肝、腎功能損害，應(yīng)用期間應(yīng)定期檢查血常規(guī)及肝腎功能指標(biāo)。此類藥目前常用的療效可靠的是環(huán)磷酰胺(CTX)，其主要副作用是骨髓抑制，性腺萎縮，致畸胎等。目前尚有用其他免疫調(diào)節(jié)劑治療紅斑狼瘡的，如胸腺肽，轉(zhuǎn)移因子等，也有使用肝素治療狼瘡腎炎的報(bào)道；5，其它療法:在用上述方法無效時(shí)，患者多臟器嚴(yán)重受損者，可采用血漿置換法、臟器移植法，嚴(yán)重的腎臟損害出現(xiàn)腎功衰竭者可采用透析療法或腎移植術(shù)。
[0004]綜合分析，紅斑狼瘡的治療主要針對(duì)自身免疫系統(tǒng)和綜合性組織器官疾病進(jìn)行治療，針對(duì)自身免疫的治療主要使用腎上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制劑兩類藥物。
[0005]這些治療存在著各自的缺陷:
[0006]1、綜合性組織器官疾病的治療為紅斑狼瘡引起的，對(duì)它們的治療只能起到緩解癥狀，治標(biāo)不治本，長(zhǎng)期治療會(huì)形成藥物依賴和抗性。
[0007]2、腎上腺皮質(zhì)激素會(huì)造成人體身體功能失調(diào)，機(jī)能紊亂。
[0008]3、免疫抑制劑在治療的冋時(shí),造成人體免疫能力下降，患者各易感染其他疾病。[0009]4、同時(shí)，藥物的長(zhǎng)期使用使身體長(zhǎng)期處于藥物導(dǎo)致的亞健康狀態(tài)，藥費(fèi)和醫(yī)療費(fèi)用聞昂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0011]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0012]一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，包括以下步驟:
[0013](I)從紅斑狼瘡患者的非發(fā)病期采集100ml外周靜脈血；
[0014](2)通過密度梯度分離法，從血液中分離得到單個(gè)核細(xì)胞；
[0015](3)將單個(gè)核細(xì)胞用培養(yǎng)液在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)2h，之后將上清液倒入新的培養(yǎng)容器中，原培養(yǎng)容器中貼壁的細(xì)胞用來分化為DC，新容器中的懸浮細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞；
[0016](4)在DC分化的培養(yǎng)液中加入特異抗原，進(jìn)行DC功能化處理；
[0017]向步驟(3)中的原培養(yǎng)容器中加入DC培養(yǎng)基和三種特異抗原⑶20、BLyS/BAFF、CD40的混合液，然后對(duì)步驟(3)中的原培養(yǎng)容器中的細(xì)胞用DC培養(yǎng)基和三種特異抗原CD20、BLyS/BAFF、CD40的混合液進(jìn)行半量換液，同時(shí)，對(duì)步驟(3)中的原培養(yǎng)容器中補(bǔ)加培養(yǎng)液；
[0018](5)將DC和Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)擴(kuò)增；
[0019]向步驟(3)中的新培養(yǎng)容器中加入TNF-α，同時(shí)，將新培養(yǎng)容器中的Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)液，然后，用細(xì)胞刮刀刮下原培養(yǎng)容器中的DC細(xì)胞，加入到新培養(yǎng)容器中的Treg細(xì)胞中，并補(bǔ)加培養(yǎng)液進(jìn)行混合擴(kuò)增培養(yǎng)；
[0020](6)擴(kuò)增后的細(xì)胞用生理鹽水清洗，最后進(jìn)行靜脈滴注回輸治療紅斑狼瘡
[0021]將所有的DC和CIK細(xì)胞離心后，用生理鹽水離心清洗兩次，然后，加入到注射用生理鹽水中，補(bǔ)加10 %人血白蛋白后進(jìn)行靜脈滴注回輸治療紅斑狼瘡。
[0022]所述外周靜脈血的供血者為紅斑狼瘡患者本人在非發(fā)病期從患者手臂等體表靜脈中抽取的血液，采集量根據(jù)患者血液質(zhì)量，可以具有少量的變動(dòng)。
[0023]所述密度梯度分離法為借助于混合樣品穿過密度梯度層的沉降或上浮來達(dá)到的分離細(xì)胞目的的技術(shù)，密度梯度分離法中的密度值是1.077g/ml。
[0024]所述單個(gè)核細(xì)胞為經(jīng)過密度梯度離心分離后得到的白膜層的細(xì)胞。
[0025]所述DC細(xì)胞由白膜層中貼壁細(xì)胞分化而來，而Treg則由未貼壁的懸浮細(xì)胞分化而來，貼壁細(xì)胞經(jīng)過了兩步分化為成熟的DC細(xì)胞，第一步是分化為未成熟DC細(xì)胞，第二步是未成熟DC分化為成熟的功能DC細(xì)胞，貼壁的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過的第一步分化的誘導(dǎo)因子是GM-CSF和IL-4，第二步分化的誘導(dǎo)因子是GM-CSF和IL-4和TNF- α，所述進(jìn)行DC功能化是在DC的未成熟期進(jìn)行，也就是第一步期間。
[0026]所述特異性抗原⑶20、BLyS/3AFF、⑶40的抗原為人源性抗原，其中抗原⑶20、BLyS/BAFF和CD40屬于紅斑狼瘡治療相關(guān)特異抗原，如果應(yīng)用于其他疾病治療，可以改用相應(yīng)特異性抗原。
[0027]所述離心清洗的離心速度為200g_300g。
[0028]有益效果[0029]本發(fā)明通過細(xì)胞免疫技術(shù)，DC和Treg細(xì)胞調(diào)理體內(nèi)免疫系統(tǒng)平衡，恢復(fù)免疫系統(tǒng)正常狀態(tài)，防止自身免疫發(fā)生，而且DC和Treg細(xì)胞屬于人體細(xì)胞，能在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間駐留體內(nèi)，達(dá)到長(zhǎng)期治療效果，同時(shí)DC和Treg的細(xì)胞免疫治療一次治療，根據(jù)細(xì)胞在體內(nèi)駐留的時(shí)間，治療效果最長(zhǎng)超過半年，治療后，人體免疫系統(tǒng)正常，身體健康。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0031]實(shí)施例1
[0032]一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，包括以下步驟:
[0033](I)從紅斑狼瘡患者的非發(fā)病期采集100ml外周靜脈血；
[0034](2)通過密度梯度分離法，從血液中分離得到單個(gè)核細(xì)胞；
[0035]分離步驟如下:
[0036]I)取100ml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到四個(gè)50ml無菌離心管中；
[0037]2)300g離心lOmin，離心后，將所有的上層血漿轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新的無菌離心管中，56°C水浴滅活30min，再于 400g離心IOmin后，收集上層黃色液體即低血小板血漿(PoorPlatelet Plasma, PPP), 4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> [0038]3)向該四個(gè)下層含血細(xì)胞的離心管中加入注射用生理鹽水，直到每管30ml混合液，用移液器混勻；
[0039]4)再取四支含15ml淋巴細(xì)胞分離液的50ml離心管，緩慢的將血細(xì)胞混合液用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細(xì)胞分離液的上層；
[0040]5) 400g 離心 2O 分鐘；
[0041]6)離心后將中間白膜層吸入到新的50ml離心管中；
[0042]7)用注射用生理鹽水補(bǔ)液到45ml后，300g離心5分鐘，清洗單核細(xì)胞；
[0043]8)重新加入注射用生理鹽水45ml，混勻后離心清洗單核細(xì)胞；
[0044](3)將單個(gè)核細(xì)胞用培養(yǎng)液在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)2h，之后將上清液倒入新的培養(yǎng)容器中，原培養(yǎng)容器中貼壁的細(xì)胞用來分化為DC，新容器中的懸浮細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞；
[0045](4)在DC分化的培養(yǎng)液中加入特異抗原，進(jìn)行DC功能化處理；
[0046]步驟如下:
[0047]I)向步驟(3)中的原培養(yǎng)容器中加入DC培養(yǎng)基和三種終濃度為25ng/ml的特異抗原 CD20、BLyS/BAFF、CD40 的混合液；
[0048]2)對(duì)步驟(3)中的原培養(yǎng)容器中的細(xì)胞用DC培養(yǎng)基和三種終濃度為25ng/ml的特異抗原CD20、BLyS/BAFF、CD40的混合液，進(jìn)行半量換液，同時(shí)，對(duì)步驟(3)中的原培養(yǎng)容器中補(bǔ)加培養(yǎng)液到100ml ；
[0049](5)將DC和Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)擴(kuò)增；
[0050]I)向步驟(3)中的新培養(yǎng)容器中加入終濃度為20ng/ml TNF-α，同時(shí)，將新培養(yǎng)容器中的Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)液到300ml ；[0051]2)用細(xì)胞刮刀刮下原培養(yǎng)容器中的DC細(xì)胞，加入到新培養(yǎng)容器中的Treg細(xì)胞中，并將培養(yǎng)液補(bǔ)加到500ml，進(jìn)行混合擴(kuò)增培養(yǎng)；
[0052](6)擴(kuò)增后的細(xì)胞用生理鹽水清洗，最后進(jìn)行靜脈滴注回輸治療紅斑狼瘡
[0053]將所有的DC和CIK細(xì)胞離心后，用生理鹽水離心清洗兩次，然后，加入到注射用生理鹽水中，補(bǔ)加10 %人血白蛋白后進(jìn)行靜脈滴注回輸治療紅斑狼瘡。
[0054]所述外周靜脈血的供血者為紅斑狼瘡患者本人在非發(fā)病期從患者手臂等體表靜脈中抽取的血液，采集量根據(jù)患者血液質(zhì)量，可以具有少量的變動(dòng)。
[0055]所述密度梯度分離法為借助于混合樣品穿過密度梯度層的沉降或上浮來達(dá)到的分離細(xì)胞目的的技術(shù)，密度梯度分離法中的密度值是1.077g/ml。
[0056]所述單個(gè)核細(xì)胞為經(jīng)過密度梯度離心分離后得到的白膜層的細(xì)胞。
[0057]所述DC細(xì)胞由白膜層中貼壁細(xì)胞分化而來，而Treg則由未貼壁的懸浮細(xì)胞分化而來，貼壁細(xì)胞經(jīng)過了兩步分化為成熟的DC細(xì)胞，第一步是分化為未成熟D細(xì)胞C，第二步是未成熟DC分化為成熟的功能DC細(xì)胞，貼壁的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過的第一步分化的誘導(dǎo)因子是GM-CSF和IL-4，第二步分化的誘導(dǎo)因子是GM-CSF和IL-4和TNF- α，進(jìn)行DC功能化是在DC的未成熟期進(jìn)行，也就是第一步期間。
[0058]所述特異性抗原⑶20、BLyS/BAFF、⑶40的抗原為人源性抗原，其中抗原⑶20、BLyS/BAFF和CD40屬于紅斑狼瘡治療相關(guān)特異抗原，如果應(yīng)用于其他疾病治療，可以改用相應(yīng)特異性抗原。
[0059]所述離心清洗的離心速度為200g_300g。
[0060]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0061]此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。
【權(quán)利要求】
1.一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，其特征是，包括以下步驟: (1)從紅斑狼瘡患者的非發(fā)病期采集100ml外周靜脈血； (2)通過密度梯度分離法，從血液中分離得到單個(gè)核細(xì)胞； (3)將單個(gè)核細(xì)胞用培養(yǎng)液在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)2h，之后將上清液倒入新的培養(yǎng)容器中，原培養(yǎng)容器中貼壁的細(xì)胞用來分化為DC，新容器中的懸浮細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞； (4)在DC分化的培養(yǎng)液中加入特異抗原，進(jìn)行DC功能化處理； 向步驟⑶中的原培養(yǎng)容器中加入DC培養(yǎng)基和三種特異抗原⑶20、BLyS/BAFF、⑶40的混合液，然后對(duì)步驟(3)中的原培養(yǎng)容器中的細(xì)胞用DC培養(yǎng)基和三種特異抗原CD20、BLyS/BAFF、CD40的混合液進(jìn)行半量換液，同時(shí)，對(duì)步驟(3)中的原培養(yǎng)容器中補(bǔ)加培養(yǎng)液； (5)將DC和Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)擴(kuò)增； 向步驟(3)中的新培養(yǎng)容器中加入TNF-α，同時(shí)，將新培養(yǎng)容器中的Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)液，然后，用細(xì)胞刮刀刮下原培養(yǎng)容器中的DC細(xì)胞，加入到新培養(yǎng)容器中的Treg細(xì)胞中，并補(bǔ)加培養(yǎng)液進(jìn)行混合擴(kuò)增培養(yǎng)； (6)擴(kuò)增后的細(xì)胞用生理鹽水清洗，最后進(jìn)行靜脈滴注回輸治療紅斑狼瘡 將所有的DC和CIK細(xì)胞離心后，用生理鹽水離心清洗兩次，然后，加入到注射用生理鹽水中，補(bǔ)加10 %人血白蛋白后進(jìn)行靜脈滴注回輸治療紅斑狼瘡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述`的一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，其特征是，所述外周靜脈血的供血者為紅斑狼瘡患者本人在非發(fā)病期從患者手臂等體表靜脈中抽取的血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，其特征是，所述密度梯度分離法為借助于混合樣品穿過密度梯度層的沉降或上浮來達(dá)到的分離細(xì)胞目的的技術(shù)，密度梯度分離法中的密度值是1.077g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，其特征是，所述單個(gè)核細(xì)胞為經(jīng)過密度梯度離心分離后得到的白膜層的細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，其特征是，所述DC細(xì)胞由白膜層中貼壁細(xì)胞分化而來，而Treg則由未貼壁的懸浮細(xì)胞分化而來，貼壁細(xì)胞經(jīng)過了兩步分化為成熟的DC細(xì)胞，第一步是分化為未成熟D細(xì)胞C，第二步是未成熟DC分化為成熟的功能DC細(xì)胞，貼壁的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過的第一步分化的誘導(dǎo)因子是GM-CSF和IL-4，第二步分化的誘導(dǎo)因子是GM-CSF和IL-4和TNF- α，進(jìn)行DC功能化是在DC的未成熟期進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，其特征是，所述特異性抗原⑶20、BLyS/BAFF、⑶40的抗原為人源性抗原，其中抗原⑶20、BLyS/BAFF和⑶40屬于紅斑狼瘡治療相關(guān)特異抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一項(xiàng)DC和Treg細(xì)胞治療紅斑狼瘡的技術(shù)，其特征是，所述離心清洗的離心速度為200g-300g。
【文檔編號(hào)】A61K35/14GK103720719SQ201310491515
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】易銀沙, 張萬明, 朱海強(qiáng), 鄒義洲, 許澎, 李娜, 劉彩云, 袁炳秋, 吳小寧 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙贏潤生物技術(shù)有限公司