一種紅參提取物及其制備方法和用途
【專利摘要】一種紅參提取物，其特征是：該提取物含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、三七皂苷R2、人參皂苷Ro，該提取物的制備方法為，將紅參藥材剪碎后加入3-10倍量水浸泡0.5-2小時，加熱回流提取1-2小時，提取1-3次，合并提取液，濾過，濃縮；將濃縮液用反相硅膠柱對其分離純化；以30%-40%的甲醇-水洗脫4-10L，棄去；以50%-70%甲醇-水洗脫4-6L，收集洗脫液濃縮后得到有效組分。
【專利說明】一種紅參提取物及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬中藥化學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及一種從紅參中提取的有效組分及其制備方法，以及該組分在制備血虛癥藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生活節(jié)奏的加快，人們的生活越來越不規(guī)律，中醫(yī)所說的“血虛”也越來越見于年輕人群，它是由各種原因引起的血虧虛而出現(xiàn)的一系列病癥；因此尋找可靠治療血虛藥物具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]血虛癥是指體內(nèi)陰血虧損的病理現(xiàn)象，可能是失血過多或者脾胃功能失調(diào)所致，表現(xiàn)為面色蒼白或萎黃，頭暈?zāi)垦?，心悸怔忡，疲倦乏力等，更為?yán)重的是其引發(fā)氣虛的慢性失血證。而骨髓干細(xì)胞具有多向分化潛能、造血支持和促進肝細(xì)胞植入和免疫調(diào)控等特點，是造血干細(xì)胞的主要來源。5-氟尿嘧啶在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為胸苷酸，從而干擾DNA的合成，引起骨髓抑制。腹腔注射5-氟尿嘧啶的小鼠骨髓細(xì)胞是一種骨髓抑制的細(xì)胞模型，可用于評價藥物的補血造血作用。
[0004]目前，治療血虛證的方法很多，但主要以治療缺鐵性貧血為主，且療效并不確切。另一方面，實驗和臨床研究證實，中藥在益氣補血、增強抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能以及降血糖等方面顯示出良好的療效，且安全可靠，進一步顯示出中醫(yī)辨證論治的合理性，顯示了中藥在治療血虛證方面的良好的應(yīng)用前景。
[0005]紅參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根,其味甘、微苦，性溫。歸脾、肺、心經(jīng)。益氣攝血，可用于氣不攝血、肢冷脈微、體虛，心力衰竭等病癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅參提取物對大鼠離體主動脈有劑量依賴性的舒張血管活性；此外，紅參對糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)·胞有神經(jīng)保護作用，還有提高免疫力、抗疲勞等作用。但目前的藥理研究主要集中在多糖和含量較高的皂苷等單體成分，對于紅參中的皂苷組分缺乏整體的研究；而分離獲得紅參具有藥理活性的皂苷組分，不僅可以節(jié)約制備單體化合物過程的消耗，也符合中藥多成分協(xié)同作用的起效機制，有利于紅參藥效機制的研究和中藥制劑的質(zhì)量控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種從紅參中提取的有效組分及其制備方法，以及該組分在制備血虛癥治療藥物中的應(yīng)用。
[0007]具體的，該紅參提取物包括以下有效組分:人參皂苷Rgl、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、三七皂苷R2、人參皂苷Ro，其中人參皂苷Rgl5-25%，人參皂苷Rel0%_30%，人參皂苷Rfl5%-30%,三七皂苷 R25%-20%，人參皂苷 Rol0%_35%。
[0008]優(yōu)選的，該提取物包括:人參皂苷Rgl 10-20%,人參皂苷Re20%_30%，人參皂苷Rf20%-25%,三七皂苷 R210%-15%，人參皂苷 Ro20%_25%。
[0009]本發(fā)明還提供該紅參提取物的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn):將紅參藥材剪碎后加入3-10倍量水浸泡0.5-2小時，加熱回流提取1-2小時，提取1-3次，合并提取液，濾過，濃縮；將濃縮液用反相硅膠柱對其分離純化；以30%-50%的甲醇-水洗脫4-10L，棄去；以50%-70%甲醇-水洗脫4-6L，收集洗脫液濃縮后得到有效組分。
[0010]優(yōu)選的，供該紅參提取物的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn):
[0011]將紅參藥材剪碎后加入5倍量水浸泡I小時，加熱回流提取2小時，提取3次，合并提取液，濾過，濃縮；將濃縮液用反相硅膠柱對其分離純化；以50%的甲醇-水洗脫8L，棄去；以60%甲醇-水洗脫5L，收集洗脫液濃縮后得到有效組分。
[0012]本發(fā)明還提供該紅參有效組分在制備血虛癥治療藥物中的應(yīng)用。
[0013]優(yōu)選的，本發(fā)明還提供該紅參提取物在制備治療骨髓細(xì)胞減少所致的血虛癥的藥物中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的紅參有效組分可以作為活性部位，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。
[0015]所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。
[0016]本發(fā)明的有益效果為:
[0017]1.本發(fā)明的提取分離工藝簡單，能快速準(zhǔn)確地得到有效組分。
[0018]2.本發(fā)明提供的紅參有效組分化學(xué)成分簡單明確，具有生物活性的皂苷成分集中，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。
[0019]3.本發(fā)明首次在5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)骨髓抑制的細(xì)胞模型上，評價了紅參皂苷類提取物對骨髓干細(xì)胞的增殖作用，得到較好的藥理活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖la，紅參組分VI提取物高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析譜圖1b ；
[0021]圖1b，人參皂苷Rgl化合物確認(rèn)圖；
[0022]圖lc，人參皂苷Re化合物確認(rèn)圖；
[0023]圖ld，人參皂苷Rf化合物確認(rèn)圖；
[0024]圖le，三七皂苷R2化合物確認(rèn)圖；
[0025]圖1f,人參皂苷Ro化合物確認(rèn)圖；
[0026]圖2a_2d.依次為紅參中組分VI及單體化合物對骨髓干細(xì)胞的增殖作用實驗的對照組，組分組分VI組，人參皂苷Re組、三七皂苷R2組；
[0027]圖3.不同濃度三七皂苷R2對骨髓細(xì)胞增殖活性的影響。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明結(jié)合附圖和下面實施例進一步詳細(xì)說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，該實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。
[0029]實施例1紅參提取物的制備方法
[0030](I)取藥用紅參為原料，加入10倍量水浸泡I小時，第一次加熱回流提取2小時，第二次加5倍量水加熱回流提取2小時，第三次加3倍量水加熱回流I小時，合并所有提取液，過濾，濃縮。
[0031](2)提取液用反向0DS-C18中壓柱色譜分離，用30%的甲醇-水洗脫8L，棄去；用50%的甲醇-水洗脫10L，減壓濃縮，冷凍干燥，得到組分。
[0032]實施例2紅參提取物的制備方法
[0033](I)取藥用紅參為原料，加入10倍量水浸泡I小時，第一次加熱回流提取2小時，第二次加8倍量水加熱回流提取1.5小時，第三次加3倍量水加熱回流0.5小時，合并所有提取液，過濾，濃縮。
[0034](2)取液用反向0DS-C18中壓柱色譜分離，用40%的甲醇-水洗脫6L，棄去；用60%的甲醇-水洗脫5L，減壓濃縮，冷凍干燥，得到組分。
[0035]實施例3紅參提取物的制備方法
[0036](I)取藥用紅參為原料，加入8倍量水浸泡I小時，第一次加熱回流提取2小時，第二次加8倍量水加熱回流提取2小時，第三次加3倍量水加熱回流I小時，合并所有提取液，過濾，濃縮。
[0037](2)取液用反向0DS-C18中壓柱色譜分離，用40%的甲醇-水洗脫8L，棄去；用70%的甲醇-水洗脫4.5L，減壓濃縮，冷凍干燥，得到組分。
[0038]實施例4紅參有效組分的分析
[0039]稱取如實施例1所示紅參組分溶解，取適量轉(zhuǎn)移至液相進樣瓶，用于高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析?！?br> [0040]分析條件如下:
[0041]AgilentllOO系列-Thermo Finnigan LCQ Deca液相-質(zhì)譜聯(lián)用；色譜柱:AgilentZorbax C18 (250mmX 14mm, 5 μ m);流動相:A 相為 0.02% 甲酸-水溶液，B 相為 0.02% 甲酸-乙腈有機相；進樣量:20 μ L0
[0042]質(zhì)譜的條件參數(shù):全離子掃描(QlMS)的掃描方式，分子量掃描范圍為300-1500，掃描時間為0.5041s,負(fù)離子模式。
[0043]高效液相的洗脫梯度(A相為0.02%甲酸-水溶液，B相為0.02%甲酸-乙腈):0~20min，A 相 82% ~77%，B 相 18% ~23% ；20 ~45min，A 相 77% ~69%，B 相 23% ~31% ；45 ~65min，A 相 69% ~73%，B 相 31% ~37% ；65 ~73min，A 相 63% ~61%，B 相 37% ~39% ；73 ~80min，A 相 61% ~35%，B 相 39% ~65% ；80 ~87min，A 相 35% ~27%，B 相 65% ~73% ；87 ~95min, A 相 27% ~20%, B 相 73% ~80%。流速:500 μ L.mirT1。
[0044]液相質(zhì)譜聯(lián)用分析顯示紅參提取液在35.12，35.40，56.21，59.59和65.02min有5個明顯色譜峰，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比對后鑒定這，5個峰代表的化合物分別是人參皂苷Rgl，人參皂苷Re，人參皂苷Rf，三七皂苷R2和人參皂苷Ro，見圖1a-圖1f。
[0045]定量分析結(jié)果顯示，紅參分離組分VI中主要成分為人參阜苷Rgll0-20%,人參阜苷Re20%-30%，人參皂苷Rf20%-30%，三七皂苷R210%_15%，人參皂苷Rbl5%_10%，人參皂苷Ro20%-30%o
[0046]實施例5滴丸劑
[0047]取實施例1所得的紅參有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6~8°C液體石蠟中，除油，制得滴丸500粒。[0048]實施例6片劑
[0049]取實施例1所得的紅參有效組分0.5g，磨成細(xì)粉，與約30%的淀粉混勻，加淀粉漿混勻制成軟材，16目篩制粒，70°C干燥，干粒過14目篩整粒，加剩余淀粉(預(yù)先在100 -105°C干燥)與吸附有液狀石蠟的滑石粉(將輕質(zhì)液狀石蠟噴于滑石粉中混勻)，再通過14目篩，壓片，即得。
[0050]實施例7紅參有效組分補血活性評價
[0051 ] 將待測組分溶解于DMSO中，得50mg.mL—1儲備液，與細(xì)胞孵育的終濃度為50 μ g.mL—1，在5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的骨髓抑制細(xì)胞模型評價其補血活性。
[0052]將原代骨髓干細(xì)胞以每35萬細(xì)胞的密度接種于6孔板，20%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁后(約24小時)，分對照組和給藥組處理，平行三次實驗，對照組不加任何藥物。將培養(yǎng)板置于371:、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周棄去一半上清，并加入新配制的終濃度為50 μ g.ml/1的1250 μ L藥物。每周倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，連續(xù)觀察4周，于第四周記錄結(jié)果(見圖2a-圖2d)。
[0053]結(jié)果表明，實施例1所得紅參組分在50 μ g -πm1濃度下有明顯的骨髓細(xì)胞增殖作用。有文獻(xiàn)報道人參皂苷Rgl具有對骨髓細(xì)胞增殖的刺激作用，而實驗結(jié)果表明:在該組分中，人參皂苷Re和三七皂苷R2單體同樣具有較明顯的骨髓細(xì)胞增殖作用。
[0054]用DMSO將三七皂苷R2配制終濃度為50 μ Μ、25 μ M、10 μ M、I μ M和0.1 μ M各IOOyL0將從5-氟尿嘧啶 造成骨髓抑制的小鼠提取原代骨髓干細(xì)胞，并以每空1000細(xì)胞的密度接種于96孔板，20%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液。分對照組和給藥組處理:每個藥物設(shè)5個濃度，平行三次實驗，對照組不加藥物。將培養(yǎng)板置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周棄去一半上清，并加入不同濃度的藥物。細(xì)胞板于3天、6天后用CCK8試劑盒測細(xì)胞增殖活性。結(jié)果如圖3所示，表明紅參中三七皂苷R2的含量與骨髓增殖活性呈量效關(guān)系。
【權(quán)利要求】
1.一種紅參提取物，其特征是:該提取物含有人參皂苷Rgl、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、三七皂苷R2、人參皂苷Ro，其中人參皂苷Rgl5-25%，人參皂苷Rel0%_30%，人參皂苷Rfl5%-30%,三七皂苷 R25%-20%，人參皂苷 Rol0%_35%。
2.根據(jù)如權(quán)利要求1所述的紅參提取物，其特征是:該提取物含有人參皂苷Rgl 10-20%,人參皂苷Re20%-30%，人參皂苷Rf20%_25%，三七皂苷R210%_15%，人參皂苷Ro20%-25%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅參提取物的制備方法，其特征是通過以下步驟實現(xiàn):將紅參藥材剪碎后加入3-10倍量水浸泡0.5-2小時，加熱回流提取1-2小時，提取1-3次，合并提取液，濾過，濃縮；將濃縮液用反相硅膠柱對其分離純化；以30%-40%的甲醇-水洗脫4-10L,棄去；以50%-70%甲醇-水洗脫4-6L，收集洗脫液濃縮后得到有效組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅參提取物的制備方法，其特征是通過以下步驟實現(xiàn):將紅參藥材剪碎后加入10倍量水浸泡I小時，加熱回流提取2小時，提取3次，合并提取液，濾過，濃縮；將濃縮液用反相硅膠柱對其分離純化；以50%的甲醇-水洗脫8L，棄去；以60%甲醇-水洗脫5L，收集洗脫液濃縮后得到有效組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的紅參提取物在制備治療血虛癥的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的紅參提取物在制備治療骨髓細(xì)胞減少所致的血虛癥的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的紅參提取物作為活性部位，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑，所述藥物的制劑形式包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸。
【文檔編號】A61K31/704GK103623021SQ201310503339
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】周祥山, 瞿海斌, 王毅, 沈麗娟, 張淹, 王春艷, 張路 申請人:山東東阿阿膠股份有限公司