一種阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。阿爾泰狗娃花提取物的制備方法是以阿爾泰狗娃花為原料，用不同濃度乙醇提取后，通過兩次大孔吸附樹脂純化得到，包括阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D。該阿爾泰狗娃花提取物，可與藥學(xué)上可接受的載體或其他適宜賦形劑相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服給藥的劑型。本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物可用于制備治療艾滋病藥物。
【專利說明】一種阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病是1981年發(fā)現(xiàn)的新病毒性傳染病，中醫(yī)過去對其未有記載。中醫(yī)對艾滋病辨證，認(rèn)為艾滋病屬于疫病范疇。病因為疫毒熱邪侵襲，正氣虛弱而致。病機(jī)主要為衛(wèi)外不固，陽氣損傷，臟腑受累，引起肺虛脾虛腎虛，繼發(fā)感染。熱傷脈絡(luò)，氣血凝滯，形成癥積腫塊腫瘤。
[0003]中醫(yī)辨“證”:主要辨別邪正消長和虛證實證。艾滋病病毒為邪毒，邪毒入里而傳變，與機(jī)體正氣的邪正抗?fàn)幍膭討B(tài)變化，為疾病的發(fā)展過程。感染早期以邪實為主，中期“因?qū)嵵绿摗保砥凇耙蛱撝聦崱?。艾滋病病情?fù)制多變，艾滋病及其繼發(fā)感染都可形成“病”，且有不同“型”和“期”。中醫(yī)對艾滋病有辨證辨病，分型分期等不同診治方案。
[0004]艾滋病的中醫(yī)藥治療目前仍屬于研究階段，目前國內(nèi)外尚未有公認(rèn)療效肯定被批準(zhǔn)生產(chǎn)的抗艾滋病病毒中藥或中藥單體化合物?？拱滩〔《局参锼幒椭兴幯芯恐饕?種途徑，煙具獲得的抗艾滋病病毒中藥植物藥及其成分，有些已在臨床試用。
[0005]自艾滋病病毒發(fā)現(xiàn)以來，國際上用艾滋病病毒細(xì)胞培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄酶,蛋白酶和整合酶等體外實驗方法，廣泛篩選化合物的同時，也大量篩選植物和中草藥提取物及其成分，也研究了一些中藥復(fù)方制劑，發(fā)現(xiàn)在體外抑制艾滋病毒的有效藥物，有的可抑制猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猴的病毒血癥。有些已在臨床試用，尚未明確效果。
[0006]我國自1987年派中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療隊去非洲治療艾滋病病人。國內(nèi)在2002年以前，缺乏特效抗艾滋病病毒藥物，中西醫(yī)在臨床根據(jù)中醫(yī)理論，對艾滋病病人辨病與辨證相結(jié)合，以清熱解毒，扶正固本，或涼血補(bǔ)腎，活血化瘀等治則，按中藥性能，選擇中藥，處方治療。通過臨床實踐，認(rèn)為有些中藥復(fù)方治療艾滋病可改善癥狀，緩解病情。近年來對實驗診斷確診的艾滋病病人，采用中藥治療，設(shè)對照組，在治療期間，定期檢測血液病毒載量(HIV-RNA)和CD4細(xì)胞水平，評價效果。有報道可改善癥狀，提高免疫力，大多仍在臨床驗證中。進(jìn)入臨床的抗HIV單味中藥或植物藥及中藥復(fù)方如下:
甘草甜素:甘草甜素(glycyrrhizin,GL)是中藥甘草(Glycyrrhiza glabra L)提取的甘草皂苷，有廣譜抗病毒作用，體外抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV細(xì)胞融合，也抗流感病毒和SARS病毒，體內(nèi)實驗證明可保護(hù)流感病毒感染小鼠引起的肺炎死亡和肺病變；保護(hù)小鼠的CCl4中毒性肝損傷；誘生Y-干擾素；有類激素作用。日本常用其靜脈點滴治療慢性乙型肝炎，也曾試用治療艾滋病病人，可抑制血清HIV-1-P24抗原，升高CD4細(xì)胞。呂維柏教授1988-1992年在非洲坦桑尼亞應(yīng)用甘草甜素口服制劑克艾可治療艾滋病病人可改善癥狀，CD4細(xì)胞略有上升。其效果尚未被驗證。
[0007]天花粉蛋白:天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS, GLQ223, Q物質(zhì))為中藥括樓(Trichosanthes kiri1wii)屬葫蘆科(Cucurbitaceae),我國民間用于流產(chǎn)的中藥復(fù)方的主要中藥成分為栝樓，我國科學(xué)家分離鑒定器抗早孕和引產(chǎn)的有效成分為天花粉蛋白，分子量為27kD，其一、二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)已完全弄清，為抑制蛋白合成的植物毒蛋白，是單鏈的核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein, RIP)。美國在篩選抗HIV-1藥物時，發(fā)現(xiàn)其在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1細(xì)胞融合，其后發(fā)現(xiàn)在單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)HIV-1的P24抗原和RNA，在3只猴艾滋病病毒(SIV)感染猴靜脈注射可抑制血漿HIV-1。美國在林場使用靜脈點滴治療艾滋病病人，可抑制外周血HIV-1感染的T淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞內(nèi)HIV-1-P24抗原，使⑶4/⑶8比例略有升高。由于可引起過敏性反應(yīng)死亡，神經(jīng)毒性的精神失常和腎毒性反應(yīng)，臨床實驗已中止。近年來從天花粉中分離出其他蛋白TAP29，分子量在29 kD，也有抑制HIV-1的作用，但毒性較小，未在臨床試用。此外苦瓜(MOmordicacharantia)的苦瓜蛋白和商陸(Phytolacca americana)的商陸蛋白(Pokeweed protein)等都有抑制HIV的作用。
[0008]金絲桃素:植物貫葉金絲桃(St.John Wort, Hypericum perforatum)民間傳統(tǒng)用其提取物治療抑郁癥，從花提出的活性成分是金絲桃素(hypericin)，是芳香族多環(huán)二聚蒽醌類化合物，為抗抑郁癥藥物，已全合成。金絲桃素具有多種抗病毒活性，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV，其作用機(jī)制為阻斷病毒的脫衣，裝配和釋放，有殺病毒作用，可通過血腦屏障。在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)可抑制鼠白血病病毒繁殖。在體內(nèi)可抑制鼠白血病病毒感染小鼠引起的脾腫大，也可抑制鴨乙型肝炎病毒感染鴨血請病毒DNA，并有廣譜抗細(xì)菌活性。曾在臨床I/II期試用治療艾滋病患者，因有光敏感作用已停止試驗。
[0009]右旋胡同素A:右旋胡同素A (+Calanolide A)是1992年報道從馬來西亞熱帶雨林植物Calophyllum Ianigerum中分離的天然化合物，鼠香豆素類化合物，抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，但對HIV-2無效。屬于非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)多對多住臨床分離的AZT敏感和耐藥HIV-1有效，并與AZT，NVP有協(xié)同作用。在HIV空纖維管小鼠體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ?HIV hollow fiber mouse model)中證明有抗艾滋病病毒作用，與AZT聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)藥效。已全合成，進(jìn)行了 1-1I其臨床試驗證明有抑制HIV-1感染的治療效果，毒性小，副作用輕，有頭痛和食欲不振等，與AZT聯(lián)合用藥有效。是目前唯一進(jìn)入II期臨床實驗的單一植物成分，正在觀察驗證療效中，尚未批準(zhǔn)生產(chǎn)。
[0010]小柴胡湯:小柴胡湯(柴胡，人參，半夏，黃芩，甘草，生姜，大棗)
是張仲景傷寒論方。日本用其治療乙型肝炎，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV。美國在臨床用于治療數(shù)例艾滋病病人，可降低血清P24抗原。我們證明其有抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶和在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1的作用。分別研究其7種成分中藥的效果，發(fā)現(xiàn)僅黃芩水提物及其成分黃芩苷(baicalin)有抑制HIV-1作用，在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，在人T細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1細(xì)胞病變，病毒熒光抗原和P24抗原，體內(nèi)鼠白血病病毒感染小鼠口服可抑制脾腫大和血白細(xì)胞升高。日本Ono報道黃芩苷元(baicalien)抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0011]中研I號:中研I號(主藥有紫花地丁，天花粉等組成)商品名為:艾
克沖劑，以清熱解毒為治則，由我國中藥研究院組方1992-1993年在非洲坦桑尼亞對早中期艾滋病臨床應(yīng)用，認(rèn)為有一定改善癥狀，提高免疫力的效果。實驗室證明該藥體外抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性，體內(nèi)對猴艾滋病毒感染猴實驗治療結(jié)果表明，能降低血漿病毒滴度，并且能提高⑶4細(xì)胞數(shù)目及⑶4/⑶8比值和T，B淋巴細(xì)胞數(shù)值，誘生干擾素和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)功能。曾在非洲和我國臨床試用，尚未批準(zhǔn)臨床驗證。
[0012]中研2號:中研2號(黃芪，人參，當(dāng)歸，枸杞和甘草等)是我國中醫(yī)
研究院醫(yī)療隊組方。1992年在非洲坦桑尼亞治療艾滋病病人。1998-1999年在非洲專科門診對29例艾滋病病人治療，2/16例HIV病毒載量下降，CD4 8/29例CD4升高。2001-2002年在北京佑安醫(yī)院治療15例艾滋病病人，3/15例病毒載量下降，⑶4 1/15例CD4升高。有改善癥狀的效果。實驗證明該藥在人體內(nèi)對猴艾滋病毒感染猴實驗治療表明，用藥4-12周能降低血漿病毒滴度，P27抗原，并且能提高CD4細(xì)胞數(shù)目，對感染猴淋巴細(xì)胞有激活作用。
[0013]阿爾泰狗娃花為菊科植物阿爾泰狗娃花(Heteropappus altaicus (Willd)Novopokr.)的干燥頭狀花序。夏、秋二季花開時采收，陰干。收載于1998年《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊》，其味甘、苦，性涼、淡、澀輕，功能為殺“粘”，清熱，解毒，用于瘟疫、麻疹、猩紅熱、血熱、毒熱，“寶日”熱。為我國藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關(guān)阿爾泰狗娃花的基礎(chǔ)研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應(yīng)用受到限制?，F(xiàn)代研究關(guān)于阿爾泰狗娃花的化學(xué)成分及藥理作用鮮有報道。
[0014]國內(nèi)專利檢索結(jié)果，未見阿爾泰狗娃花相關(guān)專利。
[0015]上述文獻(xiàn)及專利等，尚未見阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明的目的在于提供一種阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明是通過如下 技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明所用原料:阿爾泰狗娃花為菊科植物阿爾泰狗娃花(Heteropappus altaicus(Willd) Novopokr.)的干燥頭狀花序。
[0018]本發(fā)明一種阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用；所述阿爾泰狗娃花提取物的制備方法為:
(1)阿爾泰狗娃花，加水浸泡4-12小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間1-4小時，提取次數(shù)1-3次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的8-15倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ；
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度50%-95%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-3小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的8-15倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ；
(3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.10-1.20，濾過，藥液通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔吸附樹脂；再用濃度30%-70%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ；
(4)上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D，其中一種或兩種或三種或四種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
[0019]阿爾泰狗娃花提取物的物制備方法為:
(1)阿爾泰狗娃花，加水浸泡4-12小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間1-4小時，提取次數(shù)1-3次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的8-15倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ；
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度50%-95%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-3小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的8-15倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ;
(3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.10-1.20，濾過，藥液通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔吸附樹脂；再用濃度30%-70%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ；
(4)將上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
[0020]優(yōu)選的阿爾泰狗娃花提取物的制備方法為:
(1)阿爾泰狗娃花，加水浸泡6小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間2小時，提取次數(shù)2次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的12倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ；
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度60%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的12倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ；
(3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.12，濾過，藥液通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過的DM130極性大孔吸附樹脂；再用濃度60%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹脂，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度75%的乙醇溶液洗脫DM130極性大孔吸附樹脂，收集75%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ；
(4)將上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
[0021]本發(fā)明的一種阿爾泰狗娃花提取物的制備方法，其特征在于:所采用的非極性大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂、AB-8 ;所采用的極性大孔吸附樹脂為DM130大孔吸附樹月旨、ADS-17大孔吸附樹脂。
[0022]本發(fā)明的一種阿爾泰狗娃花提取物的制備方法及其在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
[0024]本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
[0026]本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物，通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
[0027]本發(fā)明首次探索研究以菊科植物阿爾泰狗娃花(Heteropappus altaicus(Willd) Novopokr.)的干燥頭狀花序為原料提取制備治療艾滋病提取物。本實驗研究表明，本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物可用于制備治療艾滋病藥物，阿爾泰狗娃花提取物對C8166細(xì)胞的毒性小，對HIV-1誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體具有顯著的抑制活性，可在制備治療艾滋病藥物中應(yīng)用。臨床治療艾滋病患者療效顯著。 【具體實施方式】
[0028]下面通過具體實驗例和實施例對本發(fā)明的一種阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用做進(jìn)一步說明，但不限于本發(fā)明。
[0029]實施例1:阿爾泰狗娃花提取物的制備
(1)阿爾泰狗娃花30kg，加水浸泡6小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間2小時，提取次數(shù)2次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的12倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ；
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度60%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的12倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ；
(3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.12，濾過，藥液通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過DM130極性大孔吸附樹脂；再用濃度60%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹脂，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度75%的乙醇溶液洗脫DM130極性大孔吸附樹脂，收集75%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ；
(4)將上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
[0030]實施例2:阿爾泰狗娃花提取物的制備
(1)阿爾泰狗娃花18kg，加水浸泡4小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間I小時，提取次數(shù)3次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的8倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ；
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度50%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為I次，每次提取時間為3小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的8倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ；
(3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.20，濾過，藥液通過AB-8非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過ADS-17極性大孔吸附樹脂；再用濃度30%的乙醇溶液洗脫AB-8非極性大孔吸附樹脂，收集30%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度50%的乙醇溶液洗脫ADS-17極性大孔吸附樹脂，收集50%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ；
(4)將上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
[0031]實施例3:阿爾泰狗娃花提取物的制備
(1)阿爾泰狗娃花25kg，加水浸泡12小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間4小時，提取次數(shù)I次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的15倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ；
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度95%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為I小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的15倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ；
(3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.10，濾過，藥液通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過DM130極性大孔吸附樹脂；再用濃度70%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹脂，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度95%的乙醇溶液洗脫DM130極性大孔吸附樹脂，收集95%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ；
(4)將上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
[0032]實施例4:阿爾泰狗娃花提取物片劑的制備
取實施例1阿爾泰狗娃花提取物400g，加入淀粉100g，混勻，制粒，干燥，過篩，加微晶纖維素15g，硬脂酸鎂5g，混勻，壓制成1000片，即得阿爾泰狗娃花提取物片劑。
[0033]實施例5:阿爾泰狗娃花提取物顆粒劑的制備
取實施例2阿爾泰狗娃花提取物365g，加入糊精160g，制粒，整粒，過篩，制成顆粒，即成本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物顆粒劑。
[0034]實施例6:阿爾泰狗娃花提取物膠囊的制備
取實施例3阿爾泰狗娃花提取物345g，加入85g淀粉，混勻，制粒，干燥，整粒，裝膠囊1000粒，即得阿爾泰狗娃花提取物膠囊。
[0035]實驗例1:阿爾泰狗娃花提取物膠囊治療艾滋病。
[0036]1、錢某某，男，43歲，吉林長春，低燒I月，伴有咽痛，到醫(yī)院檢查出艾滋病，用西藥制療三個月，不好轉(zhuǎn)，并出現(xiàn)瘤癢皮炎，后期出現(xiàn)帶血絲腹瀉。2010年6月10日開始服用本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物膠囊，每次服用5粒，每天服用3次，三天后腹瀉停止，服用三個月后皮炎消失，至今還能下地干活，身體很好。
[0037]2、孫某某，女，32歲，沈陽遼寧人，全身瘤癢，會陰部出現(xiàn)瘡面，到醫(yī)院檢查為艾滋病。經(jīng)西藥治療一月未能見效，反而出現(xiàn)少量便血瀉痢，服用本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物膠囊，每次服用5粒，每天服用3次，4天瀉痢停止，4個月后會陰部瘡面痊愈，還同時用本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物外洗，3天洗一次，共洗九次，至今身體好，能參加正常工作。
[0038]實驗例2:阿爾泰狗娃花提取物體外抗HIV-1活性試驗。
[0039]待測樣品:藥物:阿爾泰狗娃花提取物、阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D，均為按本發(fā)明實施例1方法制備得到，批號分別為:20100606、20100607、20100608、20100609。陽性對照化合物疊氮胸昔(AZT, 3’ -Azido-3' -deoxythymidine)購自Sigma公司。待測樣品溶解于二甲基亞帆(DMSO)中，分裝后4°C保存；AZT溶解于RPM工-1640完全培養(yǎng)基中，0.22um濾膜過濾除菌，分裝后-20°C保存。
[0040]試劑:HEPES (4-輕乙基呱嗦乙磺酸)、MTT (3- (4，5—二甲基曝哩_2) _2，5—二苯基四氮哩嗅鹽)、DMF (N, N —二甲基甲酞胺)、青霉素(Penicillin)、硫酸鏈霉素(Streptomycin sulfate)、谷氨酞胺(Glutamine)均購自Sigma公司;2-琉基乙醇(2-ME, 2-Mercaptoethanol)為 Bio-Rad 公司產(chǎn)品。RPM1-1640 和新生小牛血清為 Gibco 公
司產(chǎn)品。
[0041]培養(yǎng)基:RPM1-1640完全培養(yǎng)基，含有10%新生小牛血清，2mM L-谷氨酞胺，1OmMHEPES, 50uM 2-琉基乙醇，100000IU 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素。
[0042]細(xì)胞和病毒:人T淋巴細(xì)胞系C8166，HIV-1實驗株HIV-1 ⅡΙ B。均由英國MedicalResearch Council, A 工 DS Reagent Project 惠贈。所有細(xì)胞和病毒均含 10% 小牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備HIV-1 m B，滴定并計算出病毒的TCID5tlt5病毒貯存液分裝后，置-70°C保存。細(xì)胞和病毒按常規(guī)方法凍存和復(fù)蘇。
[0043]HIV-1感染性滴定:HIV-1 m B按Johnson&Byington (1990)所述方法改良進(jìn)行滴定，簡述如下:將HIV-1貯存液在96孔板上作4倍稀釋，10個梯度，每梯度6個重復(fù)孔，同時設(shè)置對照孔6孔。每孔加入C8166細(xì)胞50ul (4X 105/ml)，每孔終體積為200ul。37°C,CO2培養(yǎng)。第三天補(bǔ)加新鮮RPM1-1640完全培養(yǎng)基IOOul，第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中HIV-1誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CytopathicEffect, CPE),以每孔是否有合胞體(Syncytium)的形成確定。按 Reed &Muench 方法計算病毒的 TCID5tl(50% Tissue Culture InfectionDose,半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)。
[0044]對C8166細(xì)胞的毒性試驗:將4X 105/ml C8166細(xì)胞懸液IOOul與不同的待測藥物溶液混合，設(shè)三個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含藥物的對照孔。37°C，CO2培養(yǎng)3天，采用MTT比色法檢測細(xì)胞毒性。ELx800酶標(biāo)儀測定OD值，測定波長為595nm，參考波長為630nm。計算得到CC5tl值(50%Cytotoxic Concentration)，即對50%的正常T淋巴細(xì)胞系C8166產(chǎn)生毒性時的藥物濃度。實驗結(jié)果如表1。
[0045]表1阿爾泰狗娃花提取物對C8166細(xì)胞的毒性作用。
【權(quán)利要求】
1.一種阿爾泰狗娃花提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用；所述阿爾泰狗娃花提取物的制備方法為: (1)阿爾泰狗娃花，加水浸泡4-12小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間1-4小時，提取次數(shù)1-3次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的8-15倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ； (2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度50%-95%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-3小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的8-15倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ； (3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.10-1.20，濾過，藥液通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔吸附樹脂；再用濃度30%-70%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ； (4)上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D，其中一種或兩種或三種或四種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述阿爾泰狗娃花提取物的制備方法為: (1)阿爾泰狗娃花，加水浸泡4-12小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間1-4小時，提取次數(shù)1-3次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的8-15倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ； (2)將步驟(1)得到藥渣A用·濃度50%-95%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為1-3次，每次提取時間為1-3小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的8-15倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ; (3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.10-1.20，濾過，藥液通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔吸附樹脂；再用濃度30%-70%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ； (4)將上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述阿爾泰狗娃花提取物的制備方法為: (1)阿爾泰狗娃花，加水浸泡6小時，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間2小時，提取次數(shù)2次，加水量為阿爾泰狗娃花重量的12倍，收集揮發(fā)油，即得阿爾泰狗娃花提取物A ;將阿爾泰狗娃花水提取液濾過，分別得到藥液A和藥渣A ； (2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度60%乙醇為溶劑，加熱回流提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為阿爾泰狗娃花重量的12倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物B ； (3)將步驟(1)得到的藥液A，濃縮至相對密度d=l.12，濾過，藥液通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過的DM130極性大孔吸附樹脂；再用濃度60%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹脂，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物C ;再用濃度75%的乙醇溶液洗脫DM130極性大孔吸附樹脂，收集75%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得阿爾泰狗娃花提取物D ； (4)將上述阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D混勻，即得本發(fā)明的阿爾泰狗娃花提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的一種阿爾泰狗娃花提取物的制備方法，其特征在于:所采用的非極性大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂、AB-8 ;所采用的極性大孔吸附樹脂為DM130大孔吸附樹脂、ADS-17大孔吸附樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿爾泰狗娃花提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿爾泰狗娃花提取物A、阿爾泰狗娃花提取物B、阿爾泰狗娃花提取物C、阿爾泰狗娃花提取物D與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述的阿爾泰狗娃花提取物，通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)`上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
【文檔編號】A61K36/28GK103585219SQ201310525323
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請人:濟(jì)南星懿醫(yī)藥技術(shù)有限公司