壁衣提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種壁衣提取物的新用途，該新用途是壁衣提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。所述壁衣提取物是按如下方法制備的：將壁衣提取后，通過兩次大孔吸附樹脂純化得到。本發(fā)明所提供的壁衣提取物對制備治療艾滋病藥物具有重要意義。
【專利說明】壁衣提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種中藥材提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，具體是涉及壁衣提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病是1981年發(fā)現(xiàn)的新病毒性傳染病，中醫(yī)過去對其未有記載。中醫(yī)對艾滋病辨證，認為艾滋病屬于疫病范疇。病因為疫毒熱邪侵襲，正氣虛弱而致。病機主要為衛(wèi)外不固，陽氣損傷，臟腑受累，引起肺虛脾虛腎虛，繼發(fā)感染。熱傷脈絡(luò)，氣血凝滯，形成癥積腫塊腫瘤。
[0003]中醫(yī)辨“證”:主要辨別邪正消長和虛證實證。艾滋病病毒為邪毒，邪毒入里而傳變，與機體正氣的邪正抗?fàn)幍膭討B(tài)變化，為疾病的發(fā)展過程。感染早期以邪實為主，中期“因?qū)嵵绿摗保砥凇耙蛱撝聦崱?。艾滋病病情?fù)制多變，艾滋病及其繼發(fā)感染都可形成“病”，且有不同“型”和“期”。中醫(yī)對艾滋病有辨證辨病，分型分期等不同診治方案。
[0004]艾滋病的中醫(yī)藥治療目前仍屬于研究階段，目前國內(nèi)外尚未有公認療效肯定被批準生產(chǎn)的抗艾滋病病毒中藥或中藥單體化合物?？拱滩〔《局参锼幒椭兴幯芯恐饕?種途徑，煙具獲得的抗艾滋病病毒中藥植物藥及其成分，有些已在臨床試用。
[0005]自艾滋病病毒發(fā)現(xiàn)以來，國際上用艾滋病病毒細胞培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄酶,蛋白酶和整合酶等體外實驗方法，廣泛篩選化合物的同時，也大量篩選植物和中草藥提取物及其成分，也研究了一些中藥復(fù)方制劑，發(fā)現(xiàn)在體外抑制艾滋病毒的有效藥物，有的可抑制猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猴 的病毒血癥。有些已在臨床試用，尚未明確效果。
[0006]我國自1987年派中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療隊去非洲治療艾滋病病人。國內(nèi)在2002年以前，缺乏特效抗艾滋病病毒藥物，中西醫(yī)在臨床根據(jù)中醫(yī)理論，對艾滋病病人辨病與辨證相結(jié)合，以清熱解毒，扶正固本，或涼血補腎，活血化瘀等治則，按中藥性能，選擇中藥，處方治療。通過臨床實踐，認為有些中藥復(fù)方治療艾滋病可改善癥狀，緩解病情。近年來對實驗診斷確診的艾滋病病人，采用中藥治療，設(shè)對照組，在治療期間，定期檢測血液病毒載量(HIV-RNA)和CD4細胞水平，評價效果。有報道可改善癥狀，提高免疫力，大多仍在臨床驗證中。進入臨床的抗HIV單味中藥或植物藥及中藥復(fù)方如下:
甘草甜素:甘草甜素(glycyrrhizin,GL)是中藥甘草(Glycyrrhiza glabra L)提取的甘草皂苷，有廣譜抗病毒作用，體外抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，在細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV細胞融合，也抗流感病毒和SARS病毒，體內(nèi)實驗證明可保護流感病毒感染小鼠引起的肺炎死亡和肺病變；保護小鼠的CCl4中毒性肝損傷；誘生Y-干擾素；有類激素作用。日本常用其靜脈點滴治療慢性乙型肝炎，也曾試用治療艾滋病病人，可抑制血清HIV-1-P24抗原，升高CD4細胞。呂維柏教授1988-1992年在非洲坦桑尼亞應(yīng)用甘草甜素口服制劑克艾可治療艾滋病病人可改善癥狀，CD4細胞略有上升。其效果尚未被驗證。
[0007]天花粉蛋白:天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS, GLQ223, Q物質(zhì))為中藥括樓(Trichosanthes kiri1wii)屬葫蘆科(Cucurbitaceae),我國民間用于流產(chǎn)的中藥復(fù)方的主要中藥成分為栝樓，我國科學(xué)家分離鑒定器抗早孕和引產(chǎn)的有效成分為天花粉蛋白，分子量為27kD，其一、二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)已完全弄清，為抑制蛋白合成的植物毒蛋白，是單鏈的核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein, RIP)。美國在篩選抗HIV-1藥物時，發(fā)現(xiàn)其在淋巴細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1細胞融合，其后發(fā)現(xiàn)在單核巨噬細胞培養(yǎng)內(nèi)HIV-1的P24抗原和RNA，在3只猴艾滋病病毒(SIV)感染猴靜脈注射可抑制血漿HIV-1。美國在林場使用靜脈點滴治療艾滋病病人，可抑制外周血HIV-1感染的T淋巴細胞和單核巨噬細胞內(nèi)HIV-1-P24抗原，使⑶4/⑶8比例略有升高。由于可引起過敏性反應(yīng)死亡，神經(jīng)毒性的精神失常和腎毒性反應(yīng)，臨床實驗已中止。近年來從天花粉中分離出其他蛋白TAP29，分子量在29 kD，也有抑制HIV-1的作用，但毒性較小，未在臨床試用。此外苦瓜(MOmordicacharantia)的苦瓜蛋白和商陸(Phytolacca americana)的商陸蛋白(Pokeweed protein)等都有抑制HIV的作用。
[0008] 金絲桃素:植物貫葉金絲桃(St.John Wort, Hypericum perforatum)民間傳統(tǒng)用其提取物治療抑郁癥，從花提出的活性成分是金絲桃素(hypericin)，是芳香族多環(huán)二聚蒽醌類化合物，為抗抑郁癥藥物，已全合成。金絲桃素具有多種抗病毒活性，在細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV，其作用機制為阻斷病毒的脫衣，裝配和釋放，有殺病毒作用，可通過血腦屏障。在細胞培養(yǎng)內(nèi)可抑制鼠白血病病毒繁殖。在體內(nèi)可抑制鼠白血病病毒感染小鼠引起的脾腫大，也可抑制鴨乙型肝炎病毒感染鴨血請病毒DNA，并有廣譜抗細菌活性。曾在臨床I/II期試用治療艾滋病患者，因有光敏感作用已停止試驗。
[0009]右旋胡同素A:右旋胡同素A (+Calanolide A)是1992年報道從馬來西亞熱帶雨林植物Calophyllum Ianigerum中分離的天然化合物，鼠香豆素類化合物，抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，但對HIV-2無效。屬于非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，在細胞培養(yǎng)內(nèi)多對多住臨床分離的AZT敏感和耐藥HIV-1有效，并與AZT，NVP有協(xié)同作用。在HIV空纖維管小鼠體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ?HIV hollow fiber mouse model)中證明有抗艾滋病病毒作用，與AZT聯(lián)合應(yīng)用可增強藥效。已全合成，進行了 1-1I其臨床試驗證明有抑制HIV-1感染的治療效果，毒性小，副作用輕，有頭痛和食欲不振等，與AZT聯(lián)合用藥有效。是目前唯一進入II期臨床實驗的單一植物成分，正在觀察驗證療效中，尚未批準生產(chǎn)。
[0010]小柴胡湯:小柴胡湯(柴胡，人參，半夏，黃芩，甘草，生姜，大棗)
是張仲景傷寒論方。日本用其治療乙型肝炎，發(fā)現(xiàn)其在細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV。美國在臨床用于治療數(shù)例艾滋病病人，可降低血清P24抗原。我們證明其有抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶和在細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1的作用。分別研究其7種成分中藥的效果，發(fā)現(xiàn)僅黃芩水提物及其成分黃芩苷(baicalin)有抑制HIV-1作用，在體外無細胞系統(tǒng)中抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，在人T細胞和外周血單核細胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1細胞病變，病毒熒光抗原和P24抗原，體內(nèi)鼠白血病病毒感染小鼠口服可抑制脾腫大和血白細胞升高。日本Ono報道黃芩苷元(baicalien)抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0011]中研I號:中研I號(主藥有紫花地丁，天花粉等組成)商品名為:艾
克沖劑，以清熱解毒為治則，由我國中藥研究院組方1992-1993年在非洲坦桑尼亞對早中期艾滋病臨床應(yīng)用，認為有一定改善癥狀，提高免疫力的效果。實驗室證明該藥體外抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性，體內(nèi)對猴艾滋病毒感染猴實驗治療結(jié)果表明，能降低血漿病毒滴度，并且能提高⑶4細胞數(shù)目及⑶4/⑶8比值和T，B淋巴細胞數(shù)值，誘生干擾素和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)功能。曾在非洲和我國臨床試用，尚未批準臨床驗證。
[0012]中研2號:中研2號(黃芪，人參，當(dāng)歸，枸杞和甘草等)是我國中醫(yī)
研究院醫(yī)療隊組方。1992年在非洲坦桑尼亞治療艾滋病病人。1998-1999年在非洲?？崎T診對29例艾滋病病人治療，2/16例HIV病毒載量下降，CD4 8/29例CD4升高。2001-2002年在北京佑安醫(yī)院治療15例艾滋病病人，3/15例病毒載量下降，⑶4 1/15例CD4升高。有改善癥狀的效果。實驗證明該藥在人體內(nèi)對猴艾滋病毒感染猴實驗治療表明，用藥4-12周能降低血漿病毒滴度，P27抗原，并且能提高CD4細胞數(shù)目，對感染猴淋巴細胞有激活作用。
[0013]壁衣為地衣類黃枝衣科植物壁衣Theloschestes flavicans (Sw.) Norm的干燥葉狀體。采集后，除去泥土，曬干。收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準藏藥(第一冊)》，標準編號:WS3-BC-0125-95。性涼，味苦。具有除熱，解毒之功效。用于肺熱，肝熱，脈熱，毒熱。為我國藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關(guān)壁衣的基礎(chǔ)研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應(yīng)用受到限制。有關(guān)壁衣化學(xué)成分及藥理作用研究未見報道。
[0014]國內(nèi)專利檢索結(jié)果，未見壁衣相關(guān)專利。
[0015]上述文獻及專利等，尚未見壁衣或壁衣提取物用于制備治療艾滋病藥物的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明的目的在于提供壁衣提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明是通 過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明所用壁衣為地衣類黃枝衣科植物壁衣Theloschestes flavicans (Sw.) Norm的干燥葉狀體。
[0018]本發(fā)明壁衣提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，所述壁衣提取物的制備方法為:
(1)壁衣，用濃度80%-100%乙醇作為溶劑，在20°C-70°C溫浸提取，提取次數(shù)為2_6次，每次提取時間為2-8小時，每次溶劑用量為壁衣重量的10-30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣提取物A ;
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度0-50%乙醇為溶劑，在30°C_80°C溫浸提取，提取次數(shù)為2-5次，每次提取時間為1-6小時，每次溶劑用量為壁衣重量的6-20倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=1.05-l.12，濾過，得藥液B ;
(3)將步驟(2)得到的藥液B，通過非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔樹脂柱，再用濃度60%-95%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂柱，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度60%-85%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂柱，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ；
(4)上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C，其中一種或兩種或三種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。
[0019]壁衣提取物的制備方法為:
(I)壁衣，用濃度80%-100%乙醇作為溶劑，在20°C -70°C溫浸提取，提取次數(shù)為2_6次，每次提取時間為2-8小時，每次溶劑用量為壁衣重量的10-30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣提取物A ;(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度0-50%乙醇為溶劑，在30°C_80°C溫浸提取，提取次數(shù)為2-5次，每次提取時間為1-6小時，每次溶劑用量為壁衣重量的6-20倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=1.05-l.12，濾過，得藥液B ;
(3)將步驟(2)得到的藥液B，通過非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔樹脂柱，再用濃度60%-95%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂柱，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度60%-85%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂柱，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ；
(4 )將上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。
[0020]優(yōu)選的本發(fā)明壁衣提取物的制備方法為:
(1)壁衣，用濃度90%乙醇作為溶劑，在50°C溫浸提取，提取次數(shù)為4次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為壁衣重量的20倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣提取物A ;
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度30%乙醇為溶劑，在70°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為3小時，每次溶劑用量為壁衣重量的15倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.12，濾過，得藥液B ;
(3)將步驟(2)得到的藥液B，通過AB-8非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過DM130極性大孔樹脂柱，再用濃度85%的乙醇溶液洗脫AB-8非極性大孔吸附樹脂柱，收集85%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度70%的乙醇溶液洗脫DM130極性大孔吸附樹脂柱，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ；
(4)將上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。
[0021]本發(fā)明的壁衣提取物的制備方法，其特征在于:所采用的非極性大孔吸附樹脂為AB-8大孔吸附樹脂、DlOl大孔吸附樹脂；所采用的極性大孔吸附樹脂為DM130大孔吸附樹脂、LSA-10大孔吸附樹脂。
[0022]本發(fā)明的壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的壁衣提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
[0024]本發(fā)明的壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
[0025]本發(fā)明的壁衣提取物，通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
[0026]本發(fā)明首次探索研究以地衣類黃枝衣科植物壁衣Theloschestes flavicans(Sw.) Norm的干燥葉狀體為原料提取制備治療艾滋病提取物。本實驗研究表明，本發(fā)明的壁衣提取物可用于制備治療艾滋病藥物，壁衣提取物口服可抑制FLV引起的脾腫大。脾臟為病毒的主要靶器官，F(xiàn)LV感染鼠的脾增重大小可定量反映病毒量，因此藥物能否抑制病毒，脾指數(shù)為一個直觀而可靠的指標。脾臟有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞，它們都參與體液免疫反應(yīng)，所以在實驗中壁衣提取物可抑制脾腫大，顯示其不僅具有體內(nèi)抗FLV作用，還可能具有提高體液免疫功能的作用。從免疫學(xué)指標的實驗結(jié)果來看，壁衣提取物對細胞免疫具有很好的上調(diào)作用，特別是在逆轉(zhuǎn)錄病毒造成的機體免疫功能低下時表現(xiàn)尤為顯著，顯示該藥可增強機體細胞免疫功能，抑制FLV引起的免疫缺陷，是一個較好的免疫調(diào)節(jié)劑?！揪唧w實施方式】
[0027]下面通過具體實驗例和實施例對壁衣提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用做進一步說明，但不限于本發(fā)明。
[0028]實施例1:壁衣提取物的制備
(1)壁衣15kg，用濃度90%乙醇作為溶劑，在50°C溫浸提取，提取次數(shù)為4次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為壁衣重量的20倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣提取物A ；
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度30%乙醇為溶劑，在70°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為3小時，每次溶劑用量為壁衣重量的15倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.12，濾過，得藥液B ;
(3)將步驟(2)得到的藥液B，通過AB-8非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過DM130極性大孔樹脂柱，再用濃度85%的乙醇溶液洗脫AB-8非極性大孔吸附樹脂柱，收集85%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度70%的乙醇溶液洗脫DM130極性大孔吸附樹脂柱，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ；
(4 )將上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。
[0029]實施例2:壁衣提取物的制備
(1)壁衣18kg，用濃度80%乙醇作為溶劑，在70°C溫浸提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為8小時，每次溶劑用量為壁衣重量的10倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣 提取物A ；
(2)將步驟(1)得到藥渣A用水為溶劑，在80°C溫浸提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為6小時，每次溶劑用量為壁衣重量的20倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.12，濾過，得藥液B ;
(3)將步驟(2)得到的藥液B，通過DlOl非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過LSA-10極性大孔樹脂柱，再用濃度95%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹脂柱，收集95%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度60%的乙醇溶液洗脫LSA-10極性大孔吸附樹脂柱，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ；
(4 )將上述壁衣提取物A、壁衣提取物B/壁衣提取物C混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。
[0030]實施例3:壁衣提取物的制備
(1)壁衣20kg，用100%乙醇作為溶劑，在20°C溫浸提取，提取次數(shù)為6次，每次提取時間為2小時，每次溶劑用量為壁衣重量的30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣提取物A ;
(2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度50%乙醇為溶劑，在30°C溫浸提取，提取次數(shù)為5次，每次提取時間為I小時，每次溶劑用量為壁衣重量的6倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.05，濾過，得藥液B ;
(3)將步驟(2)得到的藥液B，通過DlOl非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過DM130極性大孔樹脂柱，再用濃度60%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹脂柱，收集60%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度85%的乙醇溶液洗脫DM130極性大孔吸附樹脂柱，收集85%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ；(4)將上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。[0031 ] 實施例4:壁衣提取物片的制備
取實施例1壁衣提取物245g，加入淀粉80g，混勻，制粒，干燥，過篩，加微晶纖維素15g，硬脂酸鎂2.5g，混勻，壓制成1000片，即得壁衣提取物片。
[0032]實施例5:壁衣提取物顆粒的制備
取實施例2壁衣提取物235g，加入糊精95g，混勻，制粒，干燥，整粒，即得壁衣提取物顆粒。
[0033]實施例6:壁衣提取物膠囊的制備
取實施例3壁衣提取物255g，加入淀粉35g，半乳糖制粒25g，混勻，制粒，干燥，整粒，裝膠囊1000粒，即得壁衣提取物膠囊。
[0034]實驗例1:壁衣提取物對艾滋病小鼠治療作用。
[0035]1.材料與方法
藥物:壁衣提取物、壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C，均為實施例1方法制備得到，批號分別為:040810、040811、040812、040813，試驗時以30g/L的二甲基亞砜(DMSO)溶解，再用蒸餾水稀釋至所需濃度；陽性對照藥物齊多呋定(AZT)由廈門制藥廠生產(chǎn)，批號為 030907。
[0036]動物:SPF級BALB/C小鼠50只，雌性，體質(zhì)量13_15g，由廣東省實驗動物中心提供，合格證號:SCXK (粵)2003-0002粵監(jiān)證字2005A013。
[0037]毒種:Friend型鼠白血病病毒(FriendLeukemia virus, FLV)引自美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American Typical Culture Centre, ATCC),經(jīng)小鼠傳代增強毒力后制成100g / L脾懸液，_70°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0038]主要試劑:PE/Cy5ant1-mouse CD3e 單克隆雙標抗體；PE/Cy5 Mouse IgGl, KIsotype Ctrl 同型對照；FITC ant1-mouse CD4/PE ant1-mouse CD8a 單克隆單標抗體；FITC Mouse IgGl,K Isotype Ctrl/PEMouse IgGl,K Isotype Ctrl 同型對照，以上均為美國Biolegend公司產(chǎn)品。
[0039]病毒半數(shù)感染量(ID5tl)滴定:腹腔注射FLV，制成0.lg/L脾懸液，收集脾懸液按文獻方法計算ID5tl,實驗時以60倍ID5tl為小鼠艾滋病模型的實驗濃度。
[0040]壁衣各提取物對FLV致小鼠脾腫大的抑制作用:將70只小鼠分為正常組、模型組、壁衣提取物組、壁衣提取物A組、壁衣提取物B組、壁衣提取物C組、AZT組，每組各10只；除正常組外，均采用FLV腹腔注射感染小鼠。正常組和模型組每天以蒸餾水0.2 mL/只灌胃，壁衣提取物組、壁衣提取物A組、壁衣提取物B組、壁衣提取物C組劑量均為20mg/kg，AZT組劑量為100mg/kg，均以蒸餾水配成2mL溶液，在病毒攻擊后I d開始以灌胃方式給藥，
0.2 mL/只，I次/d，連續(xù)給藥21d ;給藥21d后剖殺小鼠，計算小鼠脾指數(shù)與脾指數(shù)抑制率，
脾指數(shù)(質(zhì)星比)ω#=πι脾(mg) / mbody(g)，P脾指數(shù)棚=(ω平均,麵組_(°平均,給藥組)/ ω平均,模
5^X100%。對所得實驗數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0進行分析，各組間比較采用單因素方差分析(LSD)。
[0041]血象檢查:摘眼球抗凝取血，以全自動血球計數(shù)儀進行紅細胞(RBC)計數(shù)、白細胞(WBC)計數(shù)。
[0042]對細胞免疫功能的影響:測定小鼠胸腺指數(shù)(質(zhì)量比)，wM=KIm; (mg) / mbody(g);外周血T細胞亞群水平檢測，采用流式細胞儀測定BALB / C小鼠外周血T淋巴細胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+、CD4 +/CD8.的水平。
[0043]2.結(jié)果。
[0044]2.1各組對FLV致小鼠脾腫大的抑制作用的比較
壁衣各提取物組的脾指數(shù)與模型組相比具有顯著性差異(P〈0.05)，顯示壁衣提取物等對FLV致小鼠脾腫大具有抑制作用，抑制率分別為:94.45%,85.33%,94.18%、81.98%。結(jié)果見表1。
[0045]表1壁衣各提取物對FLV感染小鼠脾腫大的抑制作用
【權(quán)利要求】
1.壁衣提取物在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，所述壁衣提取物的制備方法為: (1)壁衣，用濃度80%-100%乙醇作為溶劑，在20°C-70°C溫浸提取，提取次數(shù)為2_6次，每次提取時間為2-8小時，每次溶劑用量為壁衣重量的10-30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣提取物A ; (2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度0-50%乙醇為溶劑，在30°C_80°C溫浸提取，提取次數(shù)為2-5次，每次提取時間為1-6小時，每次溶劑用量為壁衣重量的6-20倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=1.05-l.12，濾過，得藥液B ; (3)將步驟(2)得到的藥液B，通過非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔樹脂柱，再用濃度60%-95%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂柱，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度60%-85%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂柱，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ； (4)上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C，其中一種或兩種或三種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述壁衣提取物的制備方法為: (1)壁衣，用濃度80%-100%乙醇作為溶劑，在20°C_70°C溫浸提取，提取次數(shù)為2_6次，每次提取時間為2-8小時，每次溶劑用量為壁衣重量的10-30倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣提取物A ; (2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度0-50%乙醇為溶劑，在30°C_80°C溫浸提取，提取次數(shù)為2-5次，每次提取時間為1-6小時，每次溶劑用量為壁衣重量的6-20倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=1.05-l.12，濾過，得藥液B ; (3)將步驟(2)得到的藥液B，通過非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔樹脂柱，再用濃度60%-95%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂柱，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度60%-85%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂柱，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ； (4 )將上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述壁衣提取物的制備方法為: (1)壁衣，用濃度90%乙醇作為溶劑，在50°C溫浸提取，提取次數(shù)為4次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為壁衣重量的20倍，濾過，得藥渣A和提取液，提取液回收乙醇，濃縮，干燥，得壁衣提取物A ; (2)將步驟(1)得到藥渣A用濃度30%乙醇為溶劑，在70°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為3小時，每次溶劑用量為壁衣重量的15倍，濾過，提取液回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.12，濾過，得藥液B ; (3)將步驟(2)得到的藥液B，通過AB-8非極性大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，水洗脫液直接通過DM130極性大孔樹脂柱，再用濃度85%的乙醇溶液洗脫AB-8非極性大孔吸附樹脂柱，收集85%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物B ;再用濃度70%的乙醇溶液洗脫DM130極性大孔吸附樹脂柱，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得壁衣提取物C ； (4 )將上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混勻，即得本發(fā)明的壁衣提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的壁衣提取物的制備方法，其特征在于:所采用的非極性大孔吸附樹脂為AB-8大孔吸附樹脂、DlOl大孔吸附樹脂；所采用的極性大孔吸附樹脂為DM130大孔吸附樹脂、LSA-10大孔吸附樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壁衣提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述的壁衣提取物，通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
【文檔編號】A61P31/18GK103585188SQ201310525371
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請人:濟南星懿醫(yī)藥技術(shù)有限公司