毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用；毛蓮菜提取物在制備通過提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-γ活性治療白血病藥物中的應(yīng)用。所述毛蓮菜提取物是按如下方法制備的：以毛蓮菜為原料，用30%-80%乙醇提取，通過高速逆流色譜法、聚酰胺色譜純化得到。
【專利說明】毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種中藥材提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用，具體是涉及毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]白血病是起源造血系統(tǒng)的、以骨髓或其他造血組織中產(chǎn)生和積聚大量幼稚和異常白細(xì)胞為特點(diǎn)的惡性疾病。從形式看白血病細(xì)胞大多數(shù)是未成熟和形態(tài)異常的白細(xì)胞；在功能上，白血病細(xì)胞有著與腫瘤細(xì)胞相同的特點(diǎn):白血病細(xì)胞呈腫瘤性增值，無法控制，常導(dǎo)致骨髓造血功能的抑制和衰竭，致病人出現(xiàn)貧血、中性粒細(xì)胞和血小板減少，白血病細(xì)胞可浸潤全身各種組織與臟器，使各個(gè)臟器的功能受損，如脾、肝、淋巴結(jié)、腦膜、皮膚等，產(chǎn)生肝、脾、淋巴結(jié)腫大、頭痛、頸強(qiáng)直等臨床癥狀和體征；也可表現(xiàn)為局部的腫瘤，例如浸潤骨膜下時(shí)，可聚集成淡綠色腫塊，俗稱綠色瘤，如乳突綠色瘤、硬腦膜綠色瘤、脊椎綠色瘤、骨盆綠色瘤等，并可早于白血病前出現(xiàn)于臨床。由于白血病細(xì)胞源于血液系統(tǒng)，又具有腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，所以人們習(xí)慣上稱他為血癌。白血病的分布是世界性的，占癌癥總發(fā)病率的5%左右，發(fā)病以兒童和青年居多。我國白血病患者約為3-4人/10萬人口，男性多于女性。在我國各年齡組惡性腫瘤的死亡率中白血病占第6位(男性)和第8位(女性)，在兒童及35歲以下的人群中則占第I位。白血病按白細(xì)胞發(fā)育成熟的程度區(qū)分，可分為急性、慢性兩種；按白細(xì)胞的不同類型來區(qū)分，可分為淋巴細(xì)胞型、粒細(xì)胞型、單核細(xì)胞型、漿細(xì)胞型、巨核細(xì)胞型白血病，有時(shí)也可由兩種細(xì)胞混合而成，如粒一單細(xì)胞性白血病。
[0003]目前白血病的治療主要依靠化療，治療白血病的藥物也比較多，中藥西藥均有，常見的西藥有甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、長春新堿、三尖杉酯堿、干擾素等，中成藥有珍香膠囊、復(fù)方斑蝥膠囊等，這些藥物通過不同的機(jī)制對白血病進(jìn)行治療，其中有細(xì)胞毒性藥物、誘導(dǎo)分化藥物等。細(xì)胞毒性藥物雖然可 以殺傷大量的白血病細(xì)胞，減少體內(nèi)的白血病負(fù)荷，但副作用較多，如殺傷、抑制正常造血細(xì)胞，導(dǎo)致貧血、出血；抑制正常免疫功能，機(jī)體免疫力下降，容易合并感染；損傷胃腸道粘膜，導(dǎo)致厭食惡心、嘔吐；還會(huì)影響心肝腎功能，而且還可使第二腫瘤發(fā)生率增加。此外,這些藥物劑量再大，也不可能完全殺滅體內(nèi)的白血病細(xì)胞,而殘留的白血病細(xì)胞是疾病復(fù)發(fā)的根源。誘導(dǎo)分化治療是指應(yīng)用能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞分化成熟或能夠調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞表型以增強(qiáng)其對藥物敏感性的誘導(dǎo)分化劑。目前應(yīng)用最有效的是全反式維甲酸治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，全反式維甲酸已成為急性早幼粒細(xì)胞白血病誘導(dǎo)緩解的首選藥物。
[0004]干擾素是一種單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。分為α、β、Y3種。自80年代以來，許多研究顯示，干擾素(尤其是α-干擾素及Y-干擾素)除具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)的作用外，還具有明顯的抗細(xì)胞增值作用。目前干擾素已被用于治療多種白血病。干擾素的治療主要顯示對慢粒(慢性期)、毛細(xì)胞白血病，慢淋等慢性白血病是有幫助的。由于干擾素治療費(fèi)用昂貴、大劑量是副作用多(如行動(dòng)能力降低、治理減退等)，目前國內(nèi)應(yīng)用尚不
曰 ο[0005]上述藥物有的具有較強(qiáng)的毒性，在治療白血病的同時(shí)對正常細(xì)胞液有殺傷作用，有的效果不明顯，有的效果雖然好但價(jià)格昂貴。中藥在白脈病治療上已表現(xiàn)出一定的效果，并且由于中藥毒性低，副作用少而越來越受到關(guān)注。
[0006]毛蓮菜:為菊科植物毛蓮菜(Picris japonica T hunb.)的干燥地上部分。夏、秋二季花開時(shí)采收，除去雜質(zhì)，曬干。收載于1998年《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊》。性涼、糙，味苦。殺“粘”，止痛，清熱，消腫，解毒。用于瘟疫，結(jié)喉，乳腺炎，胸刺痛，腮腺炎，陣刺痛。為我國藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關(guān)毛蓮菜的基礎(chǔ)研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應(yīng)用受到限制?，F(xiàn)代研究表明，毛蓮菜含有毛連菜苷(picriside) A、B、C，山萵苣素(lactucin)，11 β-13-二氫山萵苣素(11 β -13-dihydrolactucin),假還陽參式(caepidiaside) A 及苦荬菜內(nèi)酯(ixerin) F 等，還含有多糖和黃酮類化合物，其他化學(xué)成分不詳；藥理作用研究表明，毛蓮菜水提取，過DlOl大孔樹脂，水洗脫部分具有降血糖，調(diào)節(jié)血脂作用。詳見文獻(xiàn):席嘯虎，葛睿，高建平。日本毛連菜水洗部位降血糖、調(diào)血脂作用研究，中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8 (13):34-36。其他藥理作用未見報(bào)道。
[0007]國內(nèi)專利檢索結(jié)果，未見毛蓮菜相關(guān)專利。
[0008]上述文獻(xiàn)及專 利等，尚未見毛蓮菜或毛蓮菜提取物用于制備治療白血病藥物的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明所用毛蓮菜為菊科植物毛蓮菜(Picris japonica T hunb.)的干燥地上部分。[0011 ] 毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用，所述毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到:
(1)毛蓮菜，用濃度30%-80%乙醇作為溶劑，在10°C-35°C溫浸提取，提取次數(shù)為1_5次，每次提取時(shí)間為12-48小時(shí)，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21-25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的提取物A加5-20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%-70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物C ;
(4)上述毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0012]毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到:
Cl)毛蓮菜，用濃度30%-80%乙醇作為溶劑，在10°C -35°C溫浸提取，提取次數(shù)為1_5次，每次提取時(shí)間為12-48小時(shí)，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21-25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的提取物A加5-20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A ;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%-70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物C ；
(4)上述毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0013]毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到:
(1)毛蓮菜，用濃度75%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時(shí)間為24小時(shí)，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇,濃縮,干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-7K (2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物C ；
(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0014]本發(fā)明的毛蓮菜提取物中，毛蓮菜提取物B主要含有:中美菊素C (ZaluzaninC) ;9α-羥基-11β，13-二氫中美菊素 C 3_0_β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13_dihydrozaluzanin C 3-0-β -allopyranoside) ； 10 β , 14 -Dihydroxy-10 (14) , 10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10_0_β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11 β-13-二氫山萵苣素(11 β-13_dihydrolactucin);共8 個(gè)成分。
[0015]本發(fā)明的毛蓮菜提取物中，毛蓮菜提取物C主要含有:木犀草素(luteolin)，木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside);共4個(gè)黃酮類成分。
[0016]本發(fā)明的毛蓮菜提取物，通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
[0017]本發(fā)明首次對毛蓮菜采用高速逆流色譜、聚酰胺色譜技術(shù)進(jìn)行降糖提取物制備研究，分離得到了具有提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-Y活性，治療白血病的提取物，包括毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C，二者按一定比例混合即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。制備工藝操作簡便，生產(chǎn)成本低，適于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0018]本發(fā)明首次以菊科植物毛蓮菜(Picris japonica T hunb.)的干燥地上部分為原料，制備提取物用于治療白血病。本發(fā)明首次探索研究并分離得到了毛蓮菜具有治療白血病作用的提取物。所得毛蓮菜提取物可通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例及促進(jìn)這些細(xì)胞因子的分泌發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，恢復(fù)自身受抑的免疫功能來殺傷殘留的白血病細(xì)胞，從而證實(shí)毛蓮菜提取物具有誘生IL-2，IL-6和IFN- Y的作用，對白血病的治療機(jī)免疫功能重建有一定的作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，毛蓮菜提取物具有增強(qiáng)IL-2和NCK活性作用，說明毛蓮菜提取物對化療后P388白血病小鼠的免疫抑制有一定的保護(hù)作用。推測其作用機(jī)理可能與增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫粘附功能，促使紅細(xì)胞釋放NCK激活因子，調(diào)節(jié)NCK-1FN-1L-2免疫網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。[0019]本發(fā)明的毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明的毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備通過提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-Y活性治療白血病藥物中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的毛蓮菜提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療白血病藥物?！揪唧w實(shí)施方式】
[0022]下面通過具體實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例對毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用做進(jìn)一步說明，但不限于本發(fā)明。
[0023]實(shí)施例1:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(O毛蓮菜20kg，用濃度75%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時(shí)間為24小時(shí)，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0024]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 α -羥基-11 β，13-二氫中美菊素 C 3-0-β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13-dihydrozaluzanin C3-0-β -allopyranoside)；10 β , 14 -Dihydroxy-1O (14)，10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11β_13_ 二氫山萵苣素(11 β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。
[0025]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素(Iuteolin),木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0026]實(shí)施例2:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(I)毛蓮菜10kg，用濃度30%乙醇作為溶劑，在35°C溫浸提取，提取次數(shù)為I次，提取時(shí)間為48小時(shí)，溶劑用量為毛蓮菜重量的25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ；
(2 )將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加5倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A ;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集10%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
4)上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0027]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 α -羥基-11 β，13-二氫中美菊素 C 3-0-β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13-dihydrozaluzanin C3-0-β -allopyranoside)；10 β , 14 -Dihydroxy-1O (14)，10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11β_13_ 二氫山萵苣素(11 β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。
[0028]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素(Iuteolin),木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0029]實(shí)施例3:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(O毛蓮菜10kg，用濃度80%乙醇作為溶劑，在10°C溫浸提取，提取次數(shù)為5次，每次提取時(shí)間為12小時(shí)，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
(4)上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0030]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 α -羥基-11 β，13-二氫中美菊素 C 3-0-β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13-dihydrozaluzanin C3-0-β -allopyranoside)；10 β , 14 -Dihydroxy-10 (14)，10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11β_13_ 二氫山萵苣素(11 β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。
[0031]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素(luteolin),木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)等成分，以上各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0032]實(shí)施例4:毛蓮菜提取物片劑的制備
取實(shí)施例1毛蓮菜提取物115g，加入淀粉40g，混勻，制粒，干燥，過篩，加微晶纖維素15g，硬脂酸鎂0.5g，混勻，壓片，即得毛蓮菜提取物片劑。
[0033]實(shí)施例5:毛蓮菜提取物顆粒的制備 取實(shí)施例2毛蓮菜提取物105g，加入糊精100g，制粒，干燥，整粒，即得毛蓮菜提取物顆粒。
[0034]實(shí)施例6:毛蓮菜提取物膠囊的制備
取實(shí)施例3毛蓮菜提取物115g，加入淀粉30g，混勻，制粒，干燥，過篩，加硬脂酸鎂lg，混勻，裝膠囊，即得毛蓮菜提取物膠囊。
[0035]實(shí)驗(yàn)例1:毛蓮菜提取物對L615白血病小鼠的藥效試驗(yàn)。
[0036]1.造模方法:在無菌條件下取L615白血病小鼠脾制成25%生理鹽水細(xì)胞懸液，給成年L615小鼠皮下接種，結(jié)果均發(fā)生白血病，用發(fā)病小鼠脾瘤細(xì)胞在同系小鼠連續(xù)移植，建立穩(wěn)定的L615白血病模型。
[0037]L615白血病細(xì)胞株的建立，去L615白血病小鼠的脾，在Hanks液內(nèi)將脾剪碎，使白血病細(xì)胞游離出來，通過離心收集游離細(xì)胞，然后用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋成8*106/ml的細(xì)胞液，在37°C下培養(yǎng)。培養(yǎng)20d發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物中有貼壁的棱形細(xì)胞，其周圍有增殖的圓形細(xì)胞小島。將兩種形態(tài)不同的細(xì)胞分開培養(yǎng)時(shí)，梭形細(xì)胞可以正常貼壁生長，而懸浮細(xì)胞生長緩慢；再將兩種細(xì)胞重新混合培養(yǎng)，兩種細(xì)胞生長旺盛，45d后，將懸浮生長的圓形細(xì)胞再次單獨(dú)培養(yǎng)，一直傳到12代，細(xì)胞生長良好，從而建立此細(xì)胞株。
[0038]2.毛蓮菜提取物治療白血病藥效試驗(yàn)
材料:昆明種小鼠(山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。毛蓮菜提取物、毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C(實(shí)施例1方法制備，批號(hào)分別為:20120304、20120305、20120306、20120307)，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)重組人白介素-2 (北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司)，Yackl及IL-2依賴細(xì)胞株CTLL (中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心)，RPMII640細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清(華美生物工程公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，十二烷基磺酸鈉及刀豆球蛋白，二甲基甲酰胺為(Sigma公司產(chǎn)品)；加樣器，C02培養(yǎng)箱，ELX-800酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，Epics流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)。
[0039]方法:按上述方法造模。實(shí)驗(yàn)分組第一組為正常對照組，20只615系小鼠，常規(guī)飼養(yǎng)Iw后，腹腔注射生理鹽水0.2ml/d，生理鹽水灌腸0.3ml,上、下午各I次。第2組為模型組，常規(guī)飼養(yǎng)Iw后，接種L615白血病細(xì)胞，接種后處理同正常對照組。第3組為西藥組，20只常規(guī)飼養(yǎng)一周后，接種L615白血病細(xì)胞，接種后第3天開始ip環(huán)磷酰胺，200mg/kg，l次/d。第4組-第7組分別為毛蓮菜提取物組，毛蓮菜提取物A組、毛蓮菜提取物B組、毛蓮菜提取物C組，分別取20只常規(guī)飼養(yǎng)Id后，接種L615白血病細(xì)胞，接種后第3天分別給予毛蓮菜提取物，毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C灌胃,0.3ml,上、下午各I次。以上各組動(dòng)物每組取10只于第5天處死，取脾臟進(jìn)行相關(guān)免疫指標(biāo)檢測，余下各動(dòng)物進(jìn)行生存期觀察。[0040]觀察指標(biāo):①生存期觀察。②T細(xì)胞亞群測定。③IL-2，IL-6，IFN- Y活性測定。
[0041]統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)以x±s表示,采用M1-crosoft Excel進(jìn)行t檢驗(yàn)。
[0042]結(jié)果:
生存期:毛蓮菜提取物各組生存期較模型組和西藥組明顯延長，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異P〈0.01，見表 1.表1各實(shí)驗(yàn)組生存期比較
【權(quán)利要求】
1.毛蓮菜提取物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用，所述毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到: (1)毛蓮菜，用濃度30%-80%乙醇作為溶劑，在10°C-35°C溫浸提取，提取次數(shù)為1_5次，每次提取時(shí)間為12-48小時(shí)，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21-25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ; (2)將步驟(1)得到的提取物A加5-20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物B ; (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%-70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物C ; (4)上述毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到: Cl)毛蓮菜，用濃度30%-80%乙醇作為溶劑，在10°C _35°C溫浸提取，提取次數(shù)為1_5次，每次提取時(shí)間為12-48小時(shí)，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21-25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ; (2)將步驟(1)得到的提取物A加5-20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物B ; (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%-70%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物C ; (4)上述毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述毛蓮菜提取物是按如下方法制備得到: (1)毛蓮菜，用濃度75%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時(shí)間為24小時(shí)，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇,濃縮,干燥，得毛蓮菜提取物A ; (2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得毛蓮菜提取物C ； (4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述毛蓮菜提取物，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物中，毛蓮菜提取物B主要含有:中美菊素C ;9α-羥基-11β，13-二氫中美菊素 C 3-0-β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13-dihydrozaluzanin C3-0-β -allopyranoside)；10 β , 14 -Dihydroxy-1O (14)，10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11β_13_ 二氫山萵苣素(11 β -13-dihydrolactucin)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述毛蓮菜提取物，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物中，毛蓮菜提取物C主要含有:木犀草素(Iuteolin),木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖苷，金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用為毛蓮菜提取物在制備通過提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-Y活性治療白血病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛蓮菜提取物與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療白血病藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3所述的毛蓮菜提取物，通過加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)·上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
【文檔編號(hào)】A61P35/02GK103585220SQ201310525387
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請人:濟(jì)南星懿醫(yī)藥技術(shù)有限公司