一種毛蓮菜提取物的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種毛蓮菜提取物的制備方法及其應用。其制備方法是將毛蓮菜提取后，通過高速逆流色譜法、聚酰胺等色譜純化技術(shù)，得到毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C，將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C按一定比例混合，即為毛蓮菜提取物。該毛蓮菜提取物，可與藥學上可接受的載體或其他適宜輔料相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服給藥的劑型，可用于制備預防和治療糖尿病的藥物。
【專利說明】一種毛蓮菜提取物的制備方法及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種中藥材提取物的制備方法及應用，具體是涉及一種毛蓮菜提取物的制備方法及其在制備預防和治療糖尿病藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著世界人口的老齡化，糖尿病已經(jīng)成為一種常見病、多發(fā)病，在工業(yè)發(fā)達國家其發(fā)病率呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，全世界約有1.5億糖尿病患者，80%為非胰島素依賴型糖尿病(2型)，其中我國約有3000萬。由糖尿病并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)在發(fā)達國家已是繼心腦血管疾病、癌癥之后列第三位，引起了世界各國的高度重視，紛紛對糖尿病的發(fā)病機制、藥物防治等進行研究。由于I型糖尿病病因已基本明確，只需補充胰島素即可，而2型糖尿病則較復雜，目前我國醫(yī)學界對其采取的是包括飲食療法、藥物治療與其它輔助療法的綜合治療措施。西藥雖然層出不窮，但不能從根本上解決問題，而且西藥治療具有一定的副作用及“治療失效”。中醫(yī)藥治療糖尿病歷史悠久，臨床經(jīng)驗豐富，療效顯著，已成為近年來國內(nèi)外研究熱點。中醫(yī)學對糖尿病的認識與西醫(yī)不同，中醫(yī)強調(diào)整體觀，以陰、陽二者的變化反映疾病的本質(zhì)。正常機體是“陰平陽秘”，陰陽平衡，即機體內(nèi)環(huán)境維持穩(wěn)態(tài)，糖代謝也維持穩(wěn)定；并且中藥的毒副作用相對較小，病人可長期服用，這是西藥所不能比擬的獨特的優(yōu)勢。
[0003]毛蓮菜:本品為菊科植物毛蓮菜(Picris japonica T hunb.)的干燥地上部分。夏、秋二季花開時采收，除去雜質(zhì)，曬干。收載于1998年《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準蒙藥分冊》。性涼、糙，味苦。殺“粘”，止痛，清熱，消腫，解毒。用于瘟疫，結(jié)喉，乳腺炎，胸刺痛，腮腺炎，陣刺痛。為我國藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關(guān)毛蓮菜的基礎(chǔ)研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應用受到限制?，F(xiàn)代研究表明，毛蓮菜含有毛連菜苷(picriside)A、B、C，山萵苣素(lactucin)，11 β-13-二氫山萵苣素(11 β -13-dihydrolac tucin),假還陽參式(caepidiaside) A 及苦荬菜內(nèi)酯(ixerin) F 等，還含有多糖和黃酮類化合物，其他化學成分不詳；藥理作用研究表明，毛蓮菜水提取，過DlOl大孔樹脂，水洗脫部分具有降血糖，調(diào)節(jié)血脂作用。詳見文獻:席嘯虎，葛睿，高建平。日本毛連菜水洗部位降血糖、調(diào)血脂作用研究，中國醫(yī)藥導報，2011，8 (13):34-36。其他藥理作用未見報道。
[0004]國內(nèi)專利檢索結(jié)果，未見毛蓮菜相關(guān)專利。
[0005]上述文獻及專利等，尚未見采用高速逆流色譜法、聚酰胺等色譜純化技術(shù)制備毛蓮菜提取物的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種毛蓮菜提取物的制備方法及其在制備預防和治療糖尿病藥物中的應用。
[0007]本發(fā)明所用毛蓮菜為菊科植物毛蓮菜(Picris japonica T hunb.)的干燥地上部分。[0008]一種毛蓮菜提取物的制備方法及其應用，所述毛蓮菜提取物的制備方法為:
(1)毛蓮菜，用濃度65%乙醇作為溶劑，在10°C-35°C溫浸提取，提取次數(shù)為1-5次，每次提取時間為12-48小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21-25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ；
(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加5-20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A；將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%-70%的乙醇溶液進行洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物C ；
(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0009]毛蓮菜提取物的制備方法為:
(1)毛蓮菜，用濃度65%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為24小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇,濃縮,干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-7K (2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進行洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物C ；
(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
[0010]本發(fā)明的毛蓮菜提取物的制備方法，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物B在毛蓮菜提取物中的含量為質(zhì)量分數(shù)10%-90%。
[0011]本發(fā)明的毛蓮菜提取物的制備方法，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物B主要含有:中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 α -羥基-11 β，13-二氧中美菊素C 3_0_β-批喃別苷(9 a-Hydroxy-1Iβ，13-dihydrozaluzanin C 3-0-β -allopyranoside)；10 β,14 -Dihydroxy-1O (14) , 10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picrisideB);毛連菜苷C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ；11 β -13- 二氫山萵苣素(11 β -13-dihydrolactucin)等成分。
[0012]本發(fā)明的毛蓮菜提取物的制備方法，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物C在毛蓮菜提取物中的含量為質(zhì)量分數(shù)10%-90%。
[0013]本發(fā)明的毛蓮菜提取物的制備方法，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物C主要含有:木犀草素(Iuteolin),木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)等成分。
[0014]本發(fā)明的毛蓮菜提取物，可通過加入藥劑學允許的各種輔料，制成藥劑學上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
[0015]本發(fā)明的毛蓮菜提取物的制備方法應用為毛蓮菜提取物在制備預防和治療糖尿病藥物中的應用。[0016] 本發(fā)明的毛蓮菜提取物、以及毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C,可用于制備預防和治療糖尿病藥物。
[0017]本發(fā)明的毛蓮菜提取物、毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C與化學藥或中藥或天然藥物組成預防和治療糖尿病藥物。
[0018]本發(fā)明的毛蓮菜提取物與化學藥或中藥或天然藥物組成預防和治療糖尿病藥物。
[0019]本發(fā)明首次對毛蓮菜采用高速逆流色譜、聚酰胺色譜技術(shù)進行降糖提取物制備研究，分離得到了具有降糖活性的提取物，包括毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C，二者按一定比例混合即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。制備工藝操作簡便，生產(chǎn)成本低，適于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0020]本發(fā)明提供的毛蓮菜提取物，通過觀察對鏈脲霉素性大鼠糖尿病的治療作用，結(jié)果表明，毛蓮菜提取對STZ-DM大鼠糖代謝有明顯的改善作用，對葡萄糖引起的血糖升高有明顯的拮抗作用；對STZ-DM大鼠血脂代謝障礙有明顯的改善作用，表現(xiàn)在血CHO，TG, LDL水平的降低，HDL水平的升高；對STZ-DM大鼠血MDA水平有顯著的降低作用，表明本品有一定的抗氧化作用；對鏈脲霉素造成胰島細胞損傷有一定的修復作用。毛蓮菜提取等對正常大鼠的空腹血糖和血清胰島素沒有明顯的影響，對正常大鼠的血脂代謝亦沒有顯著的影響。
【具體實施方式】
[0021]下面通過具體實驗例和實施例對一種毛蓮菜提取物的制備方法及其應用做進一步說明但不限于本發(fā)明。
[0022]實施例1:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(1)毛蓮菜30kg，用濃度65%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為24小時，每次溶劑用量為藥材重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物，其中毛蓮菜提取物B占65%和毛蓮菜提取物C占35%。
[0023]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 α -羥基-11 β，13-二氫中美菊素 C 3-0-β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13-dihydrozaluzanin C3-0-β -allopyranoside)；10 β , 14 -Dihydroxy-1O (14)，10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11β_13_ 二氫山萵苣素(11 β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化學結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。[0024]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素(Iuteolin),木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)等成分，以上各化合物的化學結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0025]實施例2:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(1)毛蓮菜10kg，用濃度65%乙醇作為溶劑，在10°C溫浸提取，提取次數(shù)為5次，每次提取時間為48小時，每次溶劑用量為藥材重量的25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ； (3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%的乙醇溶液進行梯度洗脫，收集10%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；
(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物，其中毛蓮菜提取物B占90%和毛蓮菜提取物C占10%。
[0026]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 α -羥基-11 β，13-二氫中美菊素 C 3-0-β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13-dihydrozaluzanin C3-0-β -allopyranoside)；10 β , 14 -Dihydroxy-1O (14)，10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11β_13_ 二氫山萵苣素(11 β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化學結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。
[0027]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素(Iuteolin),木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)等成分，以上各化合物的化學結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0028]實施例3:毛蓮菜提取物及單體化合物制備
(I)毛蓮菜10kg，用濃度65%乙醇作為溶劑，在35°C溫浸提取，提取次數(shù)為I次，每次提取時間為12小時，每次溶劑用量為藥材重量的21倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ;
(2 )將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加5倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A ;將沉淀A，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，即得到毛蓮菜提取物B ；
(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液進行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得毛蓮菜提取物C ；(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物，其中毛蓮菜提取物B占10%和毛蓮菜提取物C占90%。
[0029]如上所述方法制備毛蓮菜提取物B，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:0.5-5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，丙酮-乙烷(1:2)重結(jié)晶，分別得到中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 α -羥基-11 β，13-二氫中美菊素 C 3-0-β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13-dihydrozaluzanin C3-0-β -allopyranoside)；10 β , 14 -Dihydroxy-1O (14)，10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11β_13_ 二氫山萵苣素(11 β-13-dihydrolactucin)等成分，以上各化合物的化學結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98.5%。
[0030]如上所述方法制備毛蓮菜提取物C，再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脫(100:1-2.5:1)，薄層跟蹤檢測，合并相同流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，分別得到木犀草素(Iuteolin),木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷,金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)等成分，以上各化合物的化學結(jié)構(gòu)均經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測均大于98%。
[0031]實施例4:毛蓮菜提取物片的制備
取實施例1毛蓮菜提取物155g，加入淀粉60g，混勻，制粒，干燥，過篩，加15g微晶纖維素，0.5g硬脂酸鎂，混勻，壓制成1000片，即得毛蓮菜提取物片。
[0032]實施例5:毛蓮菜提取物顆粒的制備
取實施例2毛蓮菜提取物155g，加入糊精100g，混勻，制粒，干燥，整粒，，即得毛蓮菜提取物顆粒。
[0033]實施例6:毛蓮菜提取物膠囊的制備
取實施例3毛蓮菜提取物155g，加入淀粉80g，混勻，制粒，干燥，過篩，裝膠囊1000粒，即得毛蓮菜提取物膠囊。
[0034]實驗例1:毛蓮菜提取物對鏈脲霉素糖尿病大鼠的治療作用
鏈脲霉素糖尿病動物模型造模:將鏈脲霉素(STZ)溶于0.lmol/L檸檬酸緩沖液(pH4.5)中，臨用前配制。大鼠常用量為60-80mg/kg (ip或iv)。一次足量給予動物鏈脲霉素，造成β細胞大量損傷，胰島素合成和分泌減少，引起糖代謝紊亂，導致糖尿病。將STZ溶液用0.lmol/L無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液新鮮配制成2%溶液，調(diào)節(jié)pH至4.5，濾菌器過濾除菌。大鼠禁食IOh按50-65 mg/kg體重腹腔內(nèi)或尾靜脈一次性注射STZ溶液，24h內(nèi)隨機血糖≥16.7 mmol/L，穩(wěn)定5d即可作為成功模型。
[0035]藥物:毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C、毛蓮菜提取物(實施例1方法制備得到，批號分別為:20120203、20120204、20120205、20120206)。藥物配制:分別取粉末200mg溶于40ml蒸懼水中，制成混懸液。
[0036]陽性藥:降糖靈，山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所制藥廠出品，批號120115。優(yōu)降糖，山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所制藥廠出品，批號120136。鏈脲霉素(STREPT0Z0CIN，STZ)，規(guī)格:lg/瓶，批號:015K1279, SIGMA 公司。
[0037]儀器:日本京都II型GLUC0CAR0血糖儀，全自動生化測定儀，美國產(chǎn)12孔y-放免測定儀。
[0038]試劑:京都血糖儀所用血糖電極片、全自動生化儀所用血脂試劑，天津德普公司(DPC)提供的胰島素放免試劑盒。
[0039]動物:Wistar大鼠，購于山東省實驗動物中心。合格證號:魯動質(zhì)130101。
[0040]鏈脲霉素糖尿病大鼠的試驗:取上述Wistar大鼠280只，雌雄各半，體重160-200g。穩(wěn)定飼料lw，期間取血測空腹血糖2次，以3.6-5.4mmol/L為入選動物標準。其中40只作為正常對照備用。其余240只用鏈脲霉素(STZ)造模，造模后7-10d復測空腹血糖，以大于13.8mmol/L作為模型成功大鼠。
[0041]將鏈脲霉素性糖尿病(STZ—DM)大鼠60只隨機分為造模，毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C、毛蓮菜提取物、降糖靈共6組，每組各10只，并設正常對照組10只。毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C、毛蓮菜提取物，均按生藥量0.5g/kg給藥，降糖靈9 mg/kg給藥，連續(xù)口服葡萄糖耐量試驗(1.5 g/kg)，尾靜脈取血分別測空腹、口服葡萄糖后30min，60min，90min，120min的血糖水平，計算空腹血糖及葡萄糖灌胃后60min血糖區(qū)線面積(AUC)。
[0042]另取STZ-DM大鼠60只，分組、給藥劑量和方法同前。試驗前禁食8h，末次給藥后12h,空腹眶靜脈取血檢測膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平。
[0043]另取STZ-DM大鼠60只，分組、給藥劑量和方法同前。試驗前禁食8h，末次給藥后12h,空腹眶靜脈取血，按文獻TCA-TBA法，于波長535nm檢測樣品吸收值，以反映MDA水平。
[0044]另取STZ-DM大鼠60只，分組、給藥劑量和方法同前。試驗前禁食8h，末次給藥后12h，按口服葡萄糖耐量試驗(1.5 g/kg)方法進行，尾靜脈取血分別測空腹、口服葡萄糖后30min,60min, 120min的胰島素水平,之后將動物處死,迅速取胰腺固定,進行病理學檢查。
[0045]正常大鼠的試驗:取上述Wistar大鼠120只，雌雄各半,體重160_200g。穩(wěn)定飼料lw，期間取血測空腹血糖2次，以3.6-5.4mmol/L為入選動物標準。然后隨機分為正常，毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C、毛蓮菜提取物，降糖靈共6組。毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C、毛蓮菜提取物，均按生藥量0.5g/kg給藥，降糖靈組1.35mg/kg給藥，連續(xù)給藥20d。正常對照組給等體積水灌胃。試驗前禁食8h，末次給藥后12h，空腹每組各10只尾靜脈取血測血糖、胰島素水平；每組各10只眶靜脈取血測血脂水平。
[0046]試驗結(jié)果:
(1)毛蓮菜提取物對STZ-DM大鼠糖代謝的影響表1結(jié)果可見，毛蓮菜提取物對STZ-DM大鼠空腹血糖升高有明顯的降低作用，與造模組比較均有極顯著差異。表1結(jié)果表明，毛蓮菜提取物等對STZ-DM大鼠糖代謝有顯著的改善作用，對葡萄糖引起的血糖升高有顯著的降低作用，明顯降低血糖區(qū)線面積，與造模組比較均有極顯著差異。其對STZ-DM大鼠葡萄糖耐量的影響見表2 ；
表1毛蓮菜提取物等對STZ-DM大鼠空腹血糖的影響(mmol/L)
【權(quán)利要求】
1.一種毛蓮菜提取物的制備方法及其應用，所述毛蓮菜提取物的制備方法為:(1)毛蓮菜，用濃度65%乙醇作為溶劑，在10°C-35°C溫浸提取，提取次數(shù)為1-5次，每次提取時間為12-48小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的21-25倍；濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得毛蓮菜提取物A ；(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加5-20倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A；將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物B ；(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度10%-70%的乙醇溶液進行洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物C ；(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C按一定比例混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛蓮菜提取物的制備方法為:(1)毛蓮菜，用濃度65%乙醇作為溶劑，在25°C溫浸提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時間為24小時，每次溶劑用量為毛蓮菜重量的23倍；濾過，合并提取液，回收乙醇,濃縮,干燥，得毛蓮菜提取物A ;(2)將步驟(1)得到的毛蓮菜提取物A加15倍量水溶解，濾過，得藥液A和沉淀A;將沉淀A，采用高速逆流色譜法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:1:1)為溶劑系統(tǒng)，進行分離純化，回收溶劑，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物B ；(3)將步驟(2)得到的藥液A，通過聚酰胺柱柱，用水洗脫，再用濃度60%的乙醇溶液進行洗脫，收集60%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，得到毛蓮菜提取物C ；(4)將上述毛蓮菜提取物B和毛蓮菜提取物C混勻，即得本發(fā)明的毛蓮菜提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，所述的毛蓮菜提取物的制備方法，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物B在毛蓮菜提取物中的含量為質(zhì)量分數(shù)10%-90%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的毛蓮菜提取物的制備方法，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物B主要含有:中美菊素C (Zaluzanin C) ;9 α -羥基-11 β，13-二氫中美菊素 C 3-0-β -吡喃別苷(9 a-Hydroxy-1l β，13-dihydrozaluzanin C3-0-β -allopyranoside)；10 β , 14 -Dihydroxy-1O (14)，10 β (13)-tetrahydro-8, 9-didehydro-3-deoxyzaluzanin C 10-0-β-glucopyranoside ;毛連菜苷 A (picriside A);毛連菜苷 B (picriside B);毛連菜苷 C (picriside C);山萵苣素(lactucin) ;11β_13_ 二氫山萵苣素(11 β -13-dihydrolactucin)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，所述的毛蓮菜提取物的制備方法，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物C在毛蓮菜提取物中的含量為質(zhì)量分數(shù)10%-90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，權(quán)利要求2所述的毛蓮菜提取物的制備方法，其特征在于:所述的毛蓮菜提取物C主要含有:木犀草素(Iuteolin),木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖苷，金絲桃素(hypericin),金絲桃苷(hyperoside)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛蓮菜提取物，通過加入藥劑學允許的各種輔料，制成藥劑學上的片劑、顆粒劑、膠囊等口服劑型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用為毛蓮菜提取物在制備預防和治療糖尿病藥物中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛蓮菜提取物A、毛蓮菜提取物B、毛蓮菜提取物C在制備預防和治療糖尿病藥物中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的毛蓮菜提取物與化學藥或中藥或天然藥物組成預防和治療糖尿病藥物?！?br> 【文檔編號】A61K9/16GK103585226SQ201310525676
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請人:濟南星懿醫(yī)藥技術(shù)有限公司