表達(dá)新型鴨呼腸孤病毒外衣殼蛋白的重組桿狀病毒及其構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種表達(dá)新型鴨呼腸孤病毒NDRV外衣殼蛋白的重組桿狀病毒，所述重組桿狀病毒為vAcNDRV-σB／σC，該病毒高效雙表達(dá)NDRV外衣殼蛋白σB和σC。同時(shí)，涉及該重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，即，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，分別得到σB和σC基因的特異片段；通過(guò)基因克隆篩選獲得雙表達(dá)載體pFbDNDRV-σB／σC；將篩選得到的重組雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DH10Bac細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)座的AcNDRV-σB／σC?Bacmid；并將其轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，在sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得重組病毒vAcNDRV-σB／σC。
【專(zhuān)利說(shuō)明】表達(dá)新型鴨呼腸孤病毒外衣殼蛋白的重組桿狀病毒及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒學(xué)領(lǐng)域，特別是一種新型鴨呼腸孤病毒外衣殼蛋白的重組桿狀病毒及其構(gòu)建方法。本發(fā)明所用病毒株為新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus，縮寫(xiě)NDRV)安徽太湖11株。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨出血性壞死性肝炎是由呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus, NDRV)引起的各種品種鴨的一種以肝臟不規(guī)則壞死和出血混雜為主要特征的疫病。不同品種鴨均易感，日齡愈小或并發(fā)感染時(shí)其發(fā)病率死亡率愈高，以5~10日齡居多，病程5~7d，發(fā)病率5%~20%、死亡率2%~15%。
[0003]2005年以來(lái)，四川、廣東、安徽等省份陸續(xù)報(bào)道鴨群中出現(xiàn)一種新的病毒病，威脅著水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，后經(jīng)鑒定病原為新型鴨呼腸孤病毒。NDRV宿主相對(duì)ARV和MDRV要廣泛，自然狀態(tài)下對(duì)各種品種鴨(番鴨、半番鴨、北京鴨、麻鴨)均有致病性，人工感染亦可引起SPF雞的發(fā)病甚至死亡，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了一定得威脅。與其他禽源呼腸孤病毒相似，該病毒基因組由分節(jié)段的10個(gè)基因片段組成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:NDRV外衣殼蛋白O B和o C均為抗原蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，O B為群特異性抗原，0 C為型特異性抗原，而通過(guò)純化病毒得到的抗原蛋白十分有限，且原核表達(dá)無(wú)法對(duì)蛋白表達(dá)修飾加工，表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白有一定得差距，故有必要運(yùn)用真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該病毒蛋白在體外進(jìn)行高效重組表達(dá)，進(jìn)而為制備N(xiāo)DRV基因工程疫苗及開(kāi)`展抗病毒機(jī)理研究丌辟新的有效途徑。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用以下的技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明提供了高效雙表達(dá)NDRVA外衣殼蛋白o(hù) B和o C的重組病毒vAcNDRV-O B / o C。
[0007]本發(fā)明還提供了上述重組病毒AcNDRV-oB / o C的構(gòu)建方法，具體是:通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，分別得到2條編碼NDRV外衣殼蛋白o(hù)B和o C基因的特異片段，通過(guò)克隆篩選獲得了插入NDRV外衣殼蛋白o(hù)B和O C基因的重組pPastBacDual雙表達(dá)載體pFbDNDRV O B / o C ;將篩選得到的重組雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)座的AcNDRV- O B / O C Bacmid ;將 AcNDRV- o B / o C Bacmid 轉(zhuǎn)染 sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞，在 sf9 中獲得重組病毒vAcNDRV- O B / o C。
[0008]所述方法具體為:
[0009]①用于擴(kuò)增NDRV-o B / o C蛋白基因的新型鴨呼腸孤病毒毒株為NDRV THll株。
[0010]②以NDRV THll基因組dsRNA SI和S3片段為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增NDRVO C和O B基因片段，SI和S3 ；[0011]③擴(kuò)增的NDRV O B和O c DNA片段與pFastBacDual雙表達(dá)載體連接，獲得重組質(zhì)粒 pFbDNDRV oB / o C ；
[0012]④將篩選得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)座的AcNDRV-oB / o CBacmid ；
[0013]⑤采用cellfectin脂質(zhì)體,將純化的AcNDRV-O B / o C Bacmid轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得在sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)的重組病毒AcNDRV- oB/ o C。
[0014]具體而言，
[0015](I)根據(jù)NDRV O B和o C基因的GenBank序列以及pFastBacDual供體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物，NDRV O B和O C基因的GenBank序列分別為JX826588和JX826587.[0016](2)采用逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)與高保真Taq酶，進(jìn)行oB和0 C編碼基因片段的RT-PCR擴(kuò)增；
[0017](3)將O C基因插入到pFastBacDual多角體啟動(dòng)子下游，o B基因插入到PlO啟動(dòng)子下游。
[0018]本發(fā)明可采用以下的引物擴(kuò)增NDRV O B和O C編碼基因序列
[0019](I)用于擴(kuò)增NDRV O B的引物序列是:
[0020]上游引物O B-F:TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT(SEQ ID N0.1)
[0021]下游引物O B-R:GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG(SEQ ID N0.2)
[0022](2)用于擴(kuò)增NDRV o C基因的引物序列是:
[0023]上游引物O C-F:CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC(SEQ ID N0.3)
[0024]下游引物O C-R:GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA(SEQ ID N0.4)
[0025]O B編碼基因與載體連接的酶切位點(diǎn)分別是Sma I和Kpn I，o C編碼基因與載體連接的酶切位點(diǎn)分別是Bam I和Xba I。
[0026]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下主要優(yōu)點(diǎn):
[0027]①在體外同時(shí)表達(dá)2種NDRV外衣殼蛋白o(hù)B和o C。
[0028]②表達(dá)的蛋白產(chǎn)量高，保持天然蛋白活性。
[0029]③表達(dá)的蛋白產(chǎn)物為非融合蛋白，具有良好的免疫原性。
[0030]總之，本發(fā)明通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在體外成功構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)NDRV O B和O C外衣殼蛋白雙表達(dá)載體，并獲得在sf9中的高效表達(dá)，子代病毒的增殖培養(yǎng)證實(shí)其重組病毒高效表達(dá)的穩(wěn)定特性；其表達(dá)蛋白能用于研究NDRV外衣殼蛋白功能及制備基因工程疫苗。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為藍(lán)白斑篩選重組Bacmid
[0032]圖2為重組Bacmid的PCR鑒定，其中:
[0033]M:核酸 Marker ;1:空 Bacmid ；2:重組 Bacmid
[0034]圖3為western-blot鑒定o B和o C蛋白在重組桿狀病毒中的表達(dá)，其中:
[0035]M:蛋白Marker ；NC:野毒株2: o B(以兔抗NDRV o B血清為一抗);
[0036]3: O C (以兔抗NDRV o C血清為一抗)[0037]圖4為IFA檢測(cè)O B和o C蛋白在重組桿狀病毒中的表達(dá)，其中:
[0038]A:感染重組桿狀病毒sf9細(xì)胞(以兔抗NDRV o B血清為一抗)
[0039]B:感染重組桿狀病毒sf9細(xì)胞(以兔抗NDRV o C血清為一抗)
[0040]NC:感染野毒株sf9細(xì)胞(以兔抗NDRV oB / oC血清為一抗)
[0041]圖5為空斑實(shí) 驗(yàn)
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不限定本發(fā)明。
[0043]一、細(xì)胞與病毒毒株
[0044]采用Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)進(jìn)行重組NDRV衣殼蛋白桿狀病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
[0045]l)Sf9 細(xì)胞培養(yǎng)液為 SF-900II SFM(Invitrogen 公司、貨號(hào) 10902-088)
[0046]2)細(xì)胞培養(yǎng)方法為:取液氮中保存的sf9細(xì)胞，37°C水浴快速融化，在超凈臺(tái)內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入適量培養(yǎng)基，放入27°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2~3天，待鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0047]3) NDRV毒株為太湖11株(陳宗艷，朱英奇，王世傳，李傳峰，李露，王玢繽，付玉志，高景鵬，王超，劉光清.一株新型鴨源呼腸孤病毒(TH11株)的分離與鑒定.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2012，1:10-15.12.)
[0048]二、目的基因片段擴(kuò)增與克隆
[0049]采用RT-PCR方法進(jìn)行NDRV外衣殼蛋白o(hù) B和o C基因片段擴(kuò)增。基于GenBank序列進(jìn)行NDRV O B和O C基因片段設(shè)計(jì)引物,根據(jù)pFast BacDual donor plasmid提供的多克隆位點(diǎn)，以及插入片段的序列特征設(shè)計(jì)針對(duì)其含酶切位點(diǎn)的引物。
[0050]用于擴(kuò)增NDRV O B 的引物序列是:上游引物 o B_F:TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT (SEQ ID N0.1);下游引物 o B-R:GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG (SEQ ID N0.2)；
[0051]用于擴(kuò)增NDRV O C基因的引物序列是:上游引物O C_F:CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC(SEQ ID N0.3)下游引物 o C-R:GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA(SEQ IDN0.4), oB編碼基因與載體連接的酶切位點(diǎn)分別是Sma I和Kpn I，o C編碼基因與載體連接的酶切位點(diǎn)分別是Bam I和Xba I。
[0052]取NDRV THll分離株種毒經(jīng)尿囊腔途徑接種于9日齡SPF雞胚，37°C溫箱孵育，收集48h-72h之間尿囊液，離心后取上清備用；NDRV RNA提取按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；提取的RNA用于RT-PCR ;在PCR反應(yīng)管中分別加入7 ii L已制備的RNA，加A I u LNDRV-THll-o C-R 下游引物(IOuM) ,94 °C IOmin,冰浴 IOmin,繼續(xù)加入 5XM-MLVBuffer4 u L, IOmM dNTPsl iiL，0.5iiL 反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) 0.5u L,0.5u L RNA 酶抑制劑(40u)，用無(wú)RNA酶水調(diào)至總體積20uL，瞬時(shí)離心混勻；反應(yīng)程序:42°C 2h ;獲得的cDNA用于PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(50 ii L體系):以制備好的cDNA 2 y L作模版，加入相應(yīng)的上、下游引物(IOuM)各 I ii L，2.5mM dNTPs8u L, 10XBuffer5 u L, rTaql u L，滅菌水 32 u L, PCR 擴(kuò)增條件為:94°C 5min ；94°C 45s,55°C 45s,72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin 結(jié)束。PCR擴(kuò)增的O B和O C基因片段與pFastBacDual進(jìn)行連接。采用DH5 a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，于Ampicillin平板上進(jìn)行篩選，37°培養(yǎng)15h，對(duì)經(jīng)鑒定正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定。[0053]三.重組Bacmid的鑒定
[0054]經(jīng)鑒定正確的重組子pFbDNDRV-oB / o C轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，在含有50ug / ml Kanamycin ；7ug / ml Gentamicin ；IOug / ml Tetracycline ；200ug / mlX-gel ；40ug / ml IPTG的LB板上挑選白斑涂板劃線(xiàn)(如圖1所示)，然后挑斑接種于含有同樣濃度的Gent，K+和Tet的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行小量培養(yǎng)，用試劑盒提取重組BacmidDNA，提取質(zhì)粒用M13正反向引物進(jìn)行PCR鑒定(如圖2所示)，證明獲得正確的重組子。
[0055]四? Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染與重組病毒鑒定
[0056]1.將鑒定正確的重組質(zhì)粒用cellfectin轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)轉(zhuǎn)染空Bacmid作對(duì)照，具體轉(zhuǎn)染方法按試劑盒步驟進(jìn)行。轉(zhuǎn)染3天后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的變化，直至轉(zhuǎn)染細(xì)胞與正常細(xì)胞相比出現(xiàn)病變，收集細(xì)胞上清，為第一代Pl重組病毒，將Pl病毒進(jìn)行傳代培養(yǎng)獲得高效價(jià)病毒懸液。Pl子代病毒的增殖培養(yǎng)證實(shí)重組病毒vAcNDRV- oB / oC具有穩(wěn)定高效表達(dá)NDRV o B和o C蛋白的特性。
[0057]2.病毒滴度測(cè)定(如圖5所示):根據(jù)噬斑數(shù)計(jì)算病毒滴度，具體步驟:
[0058]①無(wú)菌條件下，2ml /孔細(xì)胞(5X IO5Cells / ml)種入6孔板,室溫孵育Ih使其貼壁，孵育后鏡檢其貼壁程度
[0059]②將4% agarose gel放入70°C水浴鍋融解，空100ml無(wú)菌瓶與SF-900II SFM放A 40°C水浴鍋預(yù)熱
[0060]③將桿狀病毒用SF-900II SFM梯度稀釋:10_1~1(T8
[0061]④棄6孔板內(nèi)上清，快速加入稀釋好的病毒，Iml /孔，室溫孵育Ih
[0062]⑤制備斑點(diǎn)培養(yǎng)基:混合30ml的`SF-900培養(yǎng)基(1.3x)和agarose gel在100ml滅菌瓶中，輕搖，使用前放入40°C水浴。
[0063]⑥棄6孔板內(nèi)上清，快速加2ml斑點(diǎn)培養(yǎng)基中，室溫靜止Ih
[0064]⑦將6孔板放入27°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7-10天
[0065]⑧計(jì)數(shù)板中曬菌斑,直至連續(xù)兩天無(wú)變化,加Img / ml中性紅0.5ml,室溫孵育2h后計(jì)數(shù)噬菌斑
[0066]病毒滴度(pfu / ml) = I /稀釋倍數(shù)X噬菌斑數(shù)X I /每孔接種體積
[0067]測(cè)定的病毒培養(yǎng)液的滴度為:2xl07pfu / ml
[0068]2.將擴(kuò)大培養(yǎng)的重組病毒細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，western-blot,IFA鑒定(如圖4所示)所得到的重組病毒含有目的蛋白的表達(dá)(陳宗艷，朱英奇，王世傳，李傳峰，李露，王玢繽，付玉志，高景鵬，王超，劉光清.一株新型鴨源呼腸孤病毒(TH11株)的分離與鑒定.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2012，1:10-15.12.)，其分子量分別為41Ku和34Ku，與oB和oC蛋白預(yù)期值相吻合(如圖3所示)。從中可以看出，利用本發(fā)明所述的pFbDNDRV- O B / o C可以同時(shí)高效雙表達(dá)NDRV外衣殼蛋白o(hù)B和o C。
[0069]上游引物O B-F:TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT(SEQ ID N0.1)
[0070]下游引物O B-R:GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG (SEQ ID N0.2)
[0071](2)用于擴(kuò)增NDRV O C基因的引物序列是:
[0072]上游引物O C-F:CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC(SEQ ID N0.3)
[0073]下游引物O C-R:GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA(SEQ ID N0.4)。
【權(quán)利要求】
1.一種表達(dá)新型鴨呼腸孤病毒NDRV外衣殼蛋白的重組桿狀病毒，其特征是所述重組桿狀病毒為vAcNDRV- O B / o C，該病毒高效雙表達(dá)NDRV外衣殼蛋白o(hù) B和o C。
2.權(quán)利要求1所述重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征是通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，分別得到2條編碼NDRV外衣殼蛋白O B和O C基因的特異片段；通過(guò)基因克隆篩選獲得插入的NDRV O B和oC基因的重組pFastBacdual雙表達(dá)載體pFbDNDRV- o B / o C ;將篩選得到的重組雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)座的AcNDRV- o B / o C Bacmid ;并將其轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，在sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得重組病毒vAcNDRV- o B / o C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是采用以下步驟: (1)用于擴(kuò)增NDRV-oB / O C蛋白基因的新型鴨呼腸孤病毒毒株為NDRV THll株；
(2)以NDRVTHll基因組dsRNA SI和S3片段為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增NDRV o C和oB基因片段； (3)擴(kuò)增的NDRVO B和O C DNA片段與pFastBacDual雙表達(dá)載體連接，獲得重組質(zhì)粒pFbDNDRVO B / o C ； (4)將篩選得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)座的AcNDRV-o B / o CBacmid ； (5)采用celIfectin脂質(zhì)體，將純化的AcNDRV-O B / oC Bacmid轉(zhuǎn)染sf 9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得在sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)的重組病毒vAcNDRV- oB / o C。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟(3)具體為: (1)根據(jù)NDRVO B和O C基因的GenBank序列以及pFastBacDual供體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物，NDRV O B和O C基因的GenBank序列號(hào)分別為JX826588和JX826587 ； (2)采用逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)與高保真Taq酶，進(jìn)行oB和oC編碼基因片段的RT-PCR擴(kuò)增； (3)將OC基因插入到pFastBacDual多角體啟動(dòng)子下游，o B基因插入到PlO啟動(dòng)子下游。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是擴(kuò)增OB和O C編碼基因序列的引物是: (1)用于擴(kuò)增NDRVO B基因的引物序列是:
上游引物 O B-F:TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT
下游引物 O B-R: GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG (2)用于擴(kuò)增NDRVO C基因的引物序列是:
上游引物 O C-F:CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC
下游引物 O C-R:GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征是OB基因的酶切位點(diǎn)分別是Sma I和Kpn I。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征是OC基因的酶切位點(diǎn)分別是Bam I和Xba I。
8.權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒vAcNDRV-OB / o C在制備抗新型鴨呼腸孤病毒制劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，所述應(yīng)用為制備抗新型鴨呼腸孤病毒基因工程疫苗。
【文檔編號(hào)】A61K35/76GK103642758SQ201310541349
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】劉光清, 陳宗艷, 畢莊莉, 朱音奇, 李傳峰, 孟春春 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所