一種方格星蟲多糖硫酸化修飾方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種方格星蟲多糖的硫酸化修飾方法。方格星蟲多糖具有抗菌、抗病毒、抗輻射、增強機體免疫力等功能。多糖的活性直接或間接地受到其分子結(jié)構(gòu)的影響，對多糖分子結(jié)構(gòu)進行適當(dāng)修飾可以改變多糖的活性，提高其功效。本發(fā)明用氯磺酸-吡啶法對方格星蟲多糖進行硫酸化修飾，通過方格星蟲多糖的純化，方格星蟲多糖的硫酸化修飾等具體技術(shù)措施，得到方格星蟲硫酸酯化多糖，采用紙片擴散法，以6種細(xì)菌為指示菌，對方格星蟲多糖和最優(yōu)修飾條件所得硫酸酯化多糖進行了抗菌活性測定。抗菌試驗結(jié)果顯示，本發(fā)明方法所得的方格星蟲硫酸化分子修飾產(chǎn)物，能進一步提高方格星蟲多糖的抗菌活性。
【專利說明】一種方格星蟲多糖硫酸化修飾方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種方格星蟲多糖硫酸化修飾方法，屬于多糖的結(jié)構(gòu)改造【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]多糖是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外又一類重要的生物大分子物質(zhì)，廣泛存在于動物細(xì)胞膜、植物和微生物細(xì)胞壁中，具有廣泛的生物活性。多糖類物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗輻射、抗菌、抗疲勞和抗衰老等作用。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，采取一定的方法對多糖分子結(jié)構(gòu)進行適當(dāng)修飾可以改變多糖活性，提高其功效。硫酸化修飾是多糖修飾中常見的方法之一，由于硫酸基的引入具有了聚陰離子特性，而聚陰離子特性是其生物學(xué)活性改變的主要因素，一些天然多糖經(jīng)過硫酸化修飾后得到了用途更為廣泛的多糖衍生物。
[0003]方格星蟲，素有“海洋冬蟲夏草”之稱，是一種食療兼優(yōu)的藥膳，具有顯著的延緩衰老、抗氧化、抗疲勞、耐缺氧、耐高溫、催乳以及滋陰降火、清肺化痰等功效，對心血管系統(tǒng)也有明顯的保護作用。多糖作為方格星蟲的主要有效成分，對其生物活性的研究日漸增多，根據(jù)文獻報道和本 申請人:的前期工作證明，方格星蟲多糖具有抗菌活性，但這種抗菌活性略顯不足，因此，尋找一種提高方格星蟲多糖抗菌活性的方法，更有利于提高方格星蟲的利用價值。對方格星蟲多糖進行結(jié)構(gòu)修飾，是提高方格星蟲多糖抗菌活性的途徑之一，在這方面經(jīng)過檢索沒發(fā)現(xiàn)有相關(guān)技術(shù)的披露。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種方格星蟲多糖硫酸化修飾方法，針對方格星蟲多糖抗菌活性低的問題，對方格星蟲多糖結(jié)構(gòu)進行硫酸化修飾，從而提高方格星蟲多糖的抗菌活性。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了下述技術(shù)方案，一種方格星蟲多糖硫酸化修飾方法，具體技術(shù)步驟是:
(1)方格星蟲多糖的純化
1)纖維素柱層析:取方格星蟲粗多糖進行纖維素柱層析，按常規(guī)柱層析操作方法，取方格星蟲粗多糖0.5g溶于IOmL超純水上樣，用0.3-0.5moL/L NaCL洗脫，流速為lmL/min，得到洗脫液，用玻璃紙透析除去鹽分，減壓濃縮至溫度30°C相對密度是0.9829 g/mL，進行冷凍干燥，得到含水量是1-5%的方格星蟲多糖凍干品備用；
2)凝膠柱層析:取方格星蟲多糖凍干品用超純水溶解，0.45 μ m濾膜過濾，按常規(guī)方法進行凝膠柱層析，用超純水以0.2 mL/min流速洗脫，得到洗脫液，減壓濃縮至溫度為28°C時測得相對密度是0.9856-0.9918 g/mL，進行冷凍干燥，得到含水量是1_5%的純化的方格星蟲多糖備用；
(2)方格星蟲多糖的硫酸化修飾1)硫酸化試劑制備:將附有冷凝裝置和磁力攪拌的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入10-15mL的吡唳,較為劇烈的攪拌5-10 min,按氯磺酸與吡唳是1:6-10的體積比，于40min內(nèi)邊攪拌邊逐滴加氯磺酸至吡啶中，至出現(xiàn)大量淡黃色固體，反應(yīng)結(jié)束，得酯化試劑備用；
2)硫酸化修飾操作:精確稱取0.500g純化的方格星蟲多糖，混溶于35mLDMF中，以磁力攪拌器攪拌30min混成均勻的懸液，倒入酯化試劑中并攪拌在水浴中使其反應(yīng)，水浴溫度是45-70°C，反應(yīng)時間是2-4小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入預(yù)冷至0-4°C的IOOmL冰水中，用15%的NaOH中和至pH7.0-7.2，加入三倍體積的無水乙醇，靜置24h，離心，熱水溶解沉淀，流水透析48h，冷凍干燥至含水量為1_2%，得到方格星蟲硫酸酯化多糖(sulfated SPS,sSPS)。
[0006]采取上述措施的本發(fā)明，其中硫酸酯化多糖中糖含量測定采用苯酚-硫酸法；硫酸基含量的測定采用BaCl2_明膠比濁法，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度，由回歸方程計算硫酸基濃度，按下式計算取代度DS:DS= (1.62XS%)/ (32_1.02XS%)。將本發(fā)明所得方格星蟲硫酸酯化多糖進行抗菌活性比較，采用紙片擴散法，以6種細(xì)菌(大腸桿菌Escheri chi a co71、枯草芽抱桿菌 Baci Ilus sub i i7i5.、金黃色葡萄球菌 51 taphylococcusaares、藤黃八疊球菌5krci/?a hiea、副溶血弧菌Vibrio和獲弧菌Vibrio 為指示菌,對方格星蟲多糖和最優(yōu)修飾條件所得硫酸酯化多糖sSPS5進行了抗菌活性測定。結(jié)果如下表所示:
方格星蟲多糖和硫酸酯化多糖對細(xì)菌的抑制作用(mm)
【權(quán)利要求】
1.一種方格星蟲多糖硫酸化修飾方法，具體技術(shù)步驟是: (O方格星蟲多糖的純化 1)纖維素柱層析取方格星蟲粗多糖進行纖維素柱層析，按常規(guī)柱層析操作方法，取方格星蟲粗多糖0.5g溶于IOmL超純水上樣，用0.3-0.5moL/L NaCL洗脫，流速為lmL/min，得到洗脫液，用玻璃紙透析除去鹽分，減壓濃縮至溫度30°C相對密度是0.9829 g/mL，進行冷凍干燥，得到含水量是1-5%的方格星蟲多糖凍干品備用； 2)凝膠柱層析取方格星蟲多糖凍干品用超純水溶解，0.45 μ m濾膜過濾，按常規(guī)方法進行凝膠柱層析，用超純水以0.2 mL/min流速洗脫，得到洗脫液，減壓濃縮至溫度為28°C時測得相對密度是0.9856-0.9918 g/mL，進行冷凍干燥，得到含水量是1_5%的純化的方格星蟲多糖備用； (2)方格星蟲多糖的硫酸化修飾 1)硫酸化試劑制備將附有冷凝裝置和磁力攪拌的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入10-15mL的吡唳,較為劇烈的攪拌5-10 min,按氯磺酸與吡唳是1:6-10的體積比，于40min內(nèi)邊攪拌邊逐滴加氯磺酸至吡啶中，至出現(xiàn)大量淡黃色固體，反應(yīng)結(jié)束，得酯化試劑備用； 2)硫酸化修飾操作精確稱取0.500g純化的方格星蟲多糖，混溶于35mLDMF中，以磁力攪拌器攪拌30min混成均勻的懸液，倒入酯化試劑中并攪拌在水浴中使其反應(yīng)，水浴溫度是45-70°C，反應(yīng)時間是2-4小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入預(yù)冷至0-4°C的100mL冰水中，用15%的NaOH中和至pH7.0-7.2，加入三倍體積的無水乙醇，靜置24h，離心，熱水溶解沉淀，流水透析48h，冷凍干燥至含水量為1-2%，得到方格星蟲硫酸酯化多糖(sulfated SPS, sSPS)
【文檔編號】A61P31/04GK103613678SQ201310579582
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】董蘭芳, 張琴, 童潼, 許明珠, 童萬平, 王志成 申請人:廣西壯族自治區(qū)海洋研究所