格瑞克霉素b在制備抗膠質瘤的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學領域，公開了格瑞克霉素（Grincamycin）B化合物在制備抗膠質瘤的藥物中的應用。本發(fā)明中格瑞克霉素B對惡性膠質瘤細胞有選擇性作用，擁有非常好的生物活性，格瑞克霉素B通過誘導瘤細胞和腫瘤干細胞凋亡及阻滯細胞于G0-G1期；格瑞克霉素B有效抑制膠質瘤克隆的形成；格瑞克霉素B有效抑制膠質瘤干細胞的形成；格瑞克霉素B有效抑制膠質瘤干細胞干性基因的表達，能有效抑制膠質瘤干細胞的自我更新作用，是一個潛在的抗腫瘤藥物，為靶向腫瘤干細胞（CSC）的腫瘤治療提供了新的方案和藥物，對提高腫瘤治療效果，改善患者生存質量具有重要意義。
【專利說明】格瑞克霉素B在制備抗膠質瘤的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學領域，涉及格瑞克霉素B化合物的新應用，特別涉及格瑞克霉素B化合物在制備抗膠質瘤的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的高發(fā)病率和高致死率疾病。膠質瘤
[0003](glioma)是由神經(jīng)外胚層分化而來的膠質細胞(星形膠質細胞、少突膠質細胞和室管膜等)引發(fā)的腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率位列第一。根據(jù)WH02007年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，惡性膠質瘤定義為高于或等于WHO III級的膠質細胞瘤，具體包括間變性星形細胞瘤(III級)、間變性少突膠質細胞瘤(III級)、間變性少突星形細胞瘤(III級)、膠質母細胞瘤(IV級)和巨細胞膠質母細胞瘤(IV級)，其中前三者可統(tǒng)稱為“間變性膠質瘤”。惡性膠質瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,惡性膠質瘤的發(fā)病率約為5~8/10萬，約占所有膠質細胞瘤的50%。在美國，每年新增病例有14000例，近20年來發(fā)病率呈上升趨勢。而且，因惡性膠質瘤呈浸潤性無限制增生、與正常腦組織無明顯界限并富含血管，還具有高復發(fā)率和低治愈率。雖經(jīng)多年努力，其死亡率和致殘率仍很高，間變型星形細胞瘤的中位生存期為2~5年，膠質母細胞瘤僅為12~15個月。
[0004]目前惡性膠質瘤的治療已發(fā)展為手術、放療和化療聯(lián)合的綜合治療模式。各治療方法在改善患者生存、提高患者生活質量方面協(xié)同發(fā)揮作用，由于惡性膠質瘤具有侵襲性強的特點，致使神經(jīng)外科手術無法完全切除，而后續(xù)進行的放療和化療又難以徹底地消除殘存腫瘤細胞，這些細胞最終引起腫瘤的復發(fā)，導致患者預后差，死亡率高。惡性膠質瘤對傳統(tǒng)的放療和化療不敏感，即使經(jīng)過多年發(fā)展，目前治療效果仍并不能令人滿意，并且手術后一旦復發(fā)，愈后差，平均生存時間只有12~15個月。
[0005]近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種實體瘤中均有為數(shù)不多的細胞具有無限增殖、自我更新、多向分化等類似干細胞的特征，并由此提出了 “腫瘤干細胞假說”，該假說認為腫瘤中大部分細胞經(jīng)過短暫增殖分化后凋亡，只有一小部分細胞具有再生腫瘤的能力，將其與機體其它干細胞作比擬，稱之為腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)。腫瘤干細胞理論的提出，促使研究者重新審視惡性膠質瘤及其生物學特性。研究表明，惡性膠質瘤中存在膠質瘤干細胞(glioma stem cells, GSCs),這群細胞在膠質瘤中含量甚微,但卻有很強的自我更新和多向分化能力，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中都起著關鍵作用。人們先后從惡性膠質瘤組織中成功分離并證實了腦腫瘤干細胞的存在，人惡性膠質瘤干細胞已成功分離、鑒定。研究顯示，這部分細胞具有不同于腫瘤內(nèi)其它亞群細胞的增殖和自我更新能力，人膠質瘤干細胞能在無血清、無外源性生長因子的培養(yǎng)液(serum-free medium w ithout exogenous grow thfactor, SGFF-M)中增殖、更新形成神經(jīng)球樣細胞球,這些細胞球細胞具有膠質瘤干細胞的特點。惡性膠質瘤干細胞的自我更新不依賴于外源性細胞因子，它可能擁有自我更新的自身活化機制。腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生、復發(fā)、侵襲、轉移的“根源”。抑制腫瘤干細胞的自我更新作用可以消除腫瘤的復發(fā)、侵襲等惡性性質，因此，抑制腫瘤干細胞的自我更新是治愈腫瘤行之有效的新策略，具有重要的臨床意義。
[0006]目前從海洋微生物代謝產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)了幾類化合物結構新穎、抗腫瘤細胞生物活性強，海洋微生物代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為國內(nèi)外抗癌藥物研究與開發(fā)的熱點。
[0007]海洋放線菌包括鏈霉菌屬(Streptomyces)、小單孢菌屬(Micromonosporas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardias)、游動放線菌屬(Actinoplanes)等,近年還發(fā)現(xiàn)很多新菌屬，如Salinisporas屬、Verrucosisporas屬等。近年來,從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)的活性物質有很多種，如含氮雜環(huán)類、大環(huán)內(nèi)酯類、肽類、氨基糖苷類、醚類、酮類、萜類、酯類、醌類等。它們有廣泛的生物活性。由于自身特殊的生存環(huán)境，海洋放線菌具有復雜獨特的代謝途徑，產(chǎn)生了諸多結構新穎、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物，為新藥物的發(fā)現(xiàn)提供了豐富的先導化合物，其中有些已經(jīng)進入臨床前研究。 [0008]格瑞克霉素系列化合物是深海放線菌次級代謝產(chǎn)物，最開始發(fā)現(xiàn)格瑞克霉素在 1987 (Hayakawa, Y.; Iwakiri, T.; Imamura, K.; Seto, H.; Otake, N.J.Antibiot.1987,40，1785-1787)，發(fā)現(xiàn)格瑞克霉素能夠抑制小鼠白血病細胞P388的生長。目前已研究證實了格瑞克霉素系列化合物能夠抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，具有抗HepG2肝癌，Sff-1990膜腺癌，HeLa宮頸癌,NC1-H460肺癌和MCF-7乳腺癌的作用。但迄今為止，格瑞克霉素系列化合物是否具有抗腫瘤干細胞的作用及是否具有抑制惡性膠質瘤腫瘤干細胞的作用尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本申請的發(fā)明人通過對深海放線菌次級代謝產(chǎn)物抗腫瘤細胞株生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)深海放線菌次級代謝產(chǎn)物格瑞克霉素B對惡性膠質瘤細胞株擁有非常好的生物活性，格瑞克霉素B的化學結構式如式I所示:
[0010]

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[0011]本發(fā)明的目的在于提供了格瑞克霉素B化合物的新應用，尋找新的抗腫瘤先導化合物。
[0012]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為:
[0013]格瑞克霉素B在制備治療I父質瘤的藥物中的應用。
[0014]進一步，所述膠質瘤為惡性膠質瘤。
[0015]進一步，所述治療膠質瘤的藥物為抗膠質瘤干細胞的藥物。
[0016]進一步，所述治療膠質瘤的藥物為誘導膠質瘤細胞和/或膠質瘤干細胞凋亡的藥物。[0017]進一步，所述治療膠質瘤的藥物為阻滯膠質瘤細胞和/或膠質瘤干細胞細胞分裂周期的藥物。
[0018]進一步，所述治療膠質瘤的藥物為抑制膠質瘤克隆形成的藥物。
[0019]進一步，所述治療膠質瘤的藥物為抑制膠質瘤干細胞形成的藥物。
[0020]進一步，所述治療膠質瘤的藥物為抑制膠質瘤干細胞干性基因表達的藥物。
[0021]格瑞克霉素B在制備抗腫瘤的藥物中的應用，所述抗腫瘤的藥物為抗腫瘤干細胞的藥物。
[0022]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了格瑞克霉素B在制備抗膠質瘤的藥物中的應用，格瑞克霉素B有效抑制膠質瘤干細胞的自我更新作用，是一個潛在的抗腫瘤藥物，為靶向腫瘤干細胞(CSC)的腫瘤治療提供了新的方案和藥物，對提高腫瘤治療效果，改善患者生存質量具有重要意義。另一方面，格瑞克霉素B是深海放線菌次級代謝產(chǎn)物，提取工藝簡單；微生物發(fā)酵工藝成熟且簡單、不污染環(huán)境、生產(chǎn)成本低廉和無原料后顧之憂。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中:
[0024]圖1對照組U251腫瘤細胞株凋亡檢測Annexin-V FITC+PI+結果。
[0025]圖2格瑞克霉素B處理實驗組U251腫瘤細胞株凋亡檢測Annexin-V FITC+PI+結果O
[0026]圖3對照組與格瑞克霉素B實驗組處理U251腫瘤細胞株細胞周期檢測結果。
[0027]圖4膠質瘤克隆形成圖。
[0028]圖5膠質瘤克隆形成結果。
[0029]圖6格瑞克霉素B抑制膠質瘤干細胞的形成檢測圖。
[0030]圖7格瑞克霉素B抑制膠質瘤干細胞形成結果。
[0031]圖8膠質瘤干細胞干性基因表達結果。
【具體實施方式】
[0032]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。所舉實施例是為了更好地對本發(fā)明的內(nèi)容進行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實施例。所以熟悉本領域的技術人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對實施方案進行非本質的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0033]本發(fā)明所舉實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0034]統(tǒng)計學分析:定量數(shù)據(jù)均以均值土標準差表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析，使用獨立樣本t檢驗分析兩個組之間的差異，單因素方差分析比較多個組之間的差異。
[0035]惡性膠質瘤細胞系U251、U87和膠質瘤原代細胞株091214、9944及臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs-12培養(yǎng)用含10%胎牛血清的Gibco公司的DMEM培養(yǎng)基(貨號:12800-082，配置:按照說明書，使用新鮮的Millipore雙純水稀釋，補加NaHC032.0g/L (成都市科龍化工試劑廠，分析純)，HEPES2.38g/L (Scientific research special，貨號:7365-45-9_5009)，調(diào)pH值7.26，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，用前加Hyclone的雙抗青霉素和鏈霉素，都是IOOU/mL (貨號:SV30010)，放置于37°C、C02氣體體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每過2_3天換液，用PBS (0.01Μ，ρΗ7.2-7.4)(北京中杉金橋生物技術有限公司生產(chǎn)，貨號:ZLI_9062，配置:按照說明書，蒸懼水稀釋后使用)洗漆,0.25%的胰酶(Scientific Research Special,貨號:0458-10g，配置:按照說明書，用上述PBS稀釋，再加EDTA0.8g(Solarbio，貨號:E8030.))消化傳代，第3-10代用于做實驗。
[0036]惡性膠質瘤細胞系U251、U87及臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs_12購買于美國ACTT公司；膠質瘤原代細胞株091214和9944來自于我們醫(yī)院手術剛切除的臨床標本，并獲得病人的知情同意。實驗中所用的格瑞克霉素系列化合物是由廣州中科院南海海洋研究所鞠建華研究員所提供，格瑞克霉素系列化合物是深海放線菌次級代謝產(chǎn)物。
[0037]實施例1不同濃度的格瑞克霉素系列化合物惡性膠質瘤細胞株的抑制率
[0038]采用CCK8 (購自碧云天，貨號:C0038)檢測不同濃度的格瑞克霉素系列化合物對惡性膠質瘤細胞株的抑制率，按照如下步驟進行:
[0039]1、取第3-10代生長狀態(tài)良好的U251細胞株，調(diào)整至5X 104/mL濃度的細胞，每孔100 μ L，培養(yǎng)于96孔板，過夜貼壁；
[0040]2、實驗組加入格瑞克霉素系列化合物(其終濃度分別為8，4，2，1，0.5和0.25 μ Μ)(格瑞克霉素系列化合物母液濃度IOmM,溶解于二甲基亞砜(DMSO) (Amresco,貨號:D8370)，-20°C保存)，對照組為終濃度0.05%(v/v)DMS0的培養(yǎng)液，空白組只加入等量培養(yǎng)基未加細胞，每組設置3個重復實驗孔；
[0041]3、放置于37 °C> CO2氣體體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48小時后，每孔加CCK810 μ L，培養(yǎng)2小時后，再用酶標儀(Thermo公司)測定450nm波長的吸光度(0D值)。
[0042]抑制率的計算公式如下:
[0043]抑制率=(對 照組OD值-處理組OD值-2 X空白組OD值)/ (對照組OD值-空白組 OD 值)X 100%
[0044]用藥物抑制濃度計算軟件1.0.0版(L0GIT法)軟件獲得格瑞克霉素系列化合物對惡性膠質瘤細胞株半數(shù)抑制濃度(IC5tl)，結果如表1。
[0045]表1格瑞克霉素(GCN)系列化合物抑制膠質瘤細胞及臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs-12的IC5tl值
【權利要求】
1.格瑞克霉素B在制備治療I父質瘤的藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述膠質瘤為惡性膠質瘤。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述治療膠質瘤的藥物為抗膠質瘤干細胞的藥物。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述治療膠質瘤的藥物為誘導膠質瘤細胞和/或膠質瘤干細胞凋亡 的藥物。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述治療膠質瘤的藥物為阻滯膠質瘤細胞和/或膠質瘤干細胞細胞分裂周期的藥物。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述治療膠質瘤的藥物為抑制膠質瘤克隆形成的藥物。
7.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述治療膠質瘤的藥物為抑制膠質瘤干細胞形成的藥物。
8.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述治療膠質瘤的藥物為抑制膠質瘤干細胞干性基因表達的藥物。
9.格瑞克霉素B在制備抗腫瘤的藥物中的應用，其特征在于，所述抗腫瘤的藥物為抗腫瘤干細胞的藥物。
【文檔編號】A61K31/7032GK103550231SQ201310582666
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權日:2013年11月18日
【發(fā)明者】姚月良, 平軼芳, 卞修武 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院