豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)的保護(hù)性抗原決定子的鑒定及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)保護(hù)性抗原決定子多肽(PAD多肽)以及編碼PAD的核酸。PAD通過PRRSV的GP5蛋白和M蛋白組成的異源二聚體產(chǎn)生，其中GP5的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有不同的N糖基化狀態(tài)。PAD及其編碼核酸可用于開發(fā)抗PAD抗體，有效提供抗PRRSV感染保護(hù)作用的疫苗，以及檢測PAD特異性疫苗產(chǎn)生的PAD抗體的存在的診斷方法中。本發(fā)明還涉及抗PAD抗體的產(chǎn)生方法，用于接種豬以提供抗PRRSV的保護(hù)作用的方法，制備所述疫苗的方法，以及治療豬中的PRRSV感染的方法和檢測抗PRRSV的PAD的抗體的方法。
【專利說明】豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的保護(hù)性抗原決定子的鑒定及其用途
[0001]本申請是申請日為2006年11月29日的申請?zhí)枮?00680044869.X標(biāo)題為“豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的保護(hù)性抗原決定子的鑒定及其用途”的申請的分案申請
[0002]交叉申請
[0003]本申請根據(jù)35U.S.C.§ 119要求2005-11-29提交的臨時申請60/740，519的優(yōu)先權(quán)，該申請全文包含在本文中作為參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明的實(shí)施方案總體涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，更具體涉及PRRSV的新保護(hù)性抗原決定子(PAD)的發(fā)現(xiàn)，以及其在疫苗、治療和診斷分析中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0005]1987年中，美國豬生產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷了一種未知的感染性疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響。該疾病綜合征在歐洲包括德國、比利時、荷蘭、西班牙和英格蘭都有報道。
[0006]該疾病的特征在于繁殖不能，呼吸疾病和各種臨床癥狀包括喪失胃口，發(fā)熱，腹瀉以及輕微的神經(jīng)癥狀。該綜合征的主要組成部分是繁殖不能，表現(xiàn)為早產(chǎn)，晚期流產(chǎn)，先天體弱，死產(chǎn)，木乃伊胎，產(chǎn)崽率降低，以及動情期恢復(fù)延遲。臨床呼吸疾病癥狀在3周齡以下的豬中最為明顯，并據(jù)報道出現(xiàn)于所有生產(chǎn)期。受累幼豬生長緩慢，皮毛粗糙，呼吸窘迫(“喘粗氣”)，并且死亡率增加。
[0007]該疾病綜合征由很多名稱，包括豬神秘病(mystery swine disease) (MSD)，豬流行性流產(chǎn)(porcine epidemic abortion)以及呼吸綜合征(respiratory syndrome)(PEARS)，豬不孕與呼吸綜合征(swine infertility and respiratory syndrome) (SIRS)?，F(xiàn)在通常使用的名稱是豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS);該術(shù)語在本專利申請中通篇使用。
[0008]PRRSV優(yōu)選在肺泡肺巨噬細(xì)胞中生長(Wensvoort et al.，1991)。一些細(xì)胞系，諸如CL2621以及其他從猴腎細(xì)胞系MA-104克隆的其他細(xì)胞系也對病毒敏感。一些已知的 PRRSV 毒株的保藏號為 CNCM 1-1102，1-1140，1-1387，1-1388，ECACC V93070108,或ATCC VR2332, VR2385, VR2386, VR2429, VR2474,和 VR2402。PRRSV 基因組長度為 15kb,包含編碼RNA依賴性RNA聚合酶的基因(ORFla和ORFlb)以及編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因(0RFs2_7;Meulenberg et al., 1993and Meulenberg et al.，1996)。0RF5 編碼主要包膜糖蛋白，稱為GP5。0RFs2，3和4分別編碼糖蛋白GP2，GP3和GP4。這些糖蛋白在PRRSV的Lelystad病毒分離株的純化病毒粒子中以較低的豐度存在。GP5蛋白長度大約200個氨基酸，分子量25kDa，并與ER中的0RF6編碼的基質(zhì)蛋白M形成二硫鍵連接的異源二聚體。M蛋白長度大約190氨基酸，19kDa，并且是非糖基化。核殼體蛋白N由0RF7編碼。來自歐洲和北美的PRRSV分離株的基因組序列的分析，以及其與單克隆抗體的反應(yīng)性已經(jīng)證實(shí)了它們代表兩種不同的抗原類型。這些洲的分離株在遺傳上不同并且從共同祖先在較早以前分離(Murtaugh et al., 1995)。[0009]動脈炎病毒(arteriviruses)的基因組組成類似冠狀病毒和托羅病毒，它們的復(fù)制涉及亞基因組mRNA的3’ -共末端嵌套組的形成mRNAs (Sg mRNAs)(Chen et al.，1993，J.Gen.Virol.74: 643-660 ; Den Boon et al., 1990, J.Virol., 65:2910-2920;De Vries et al., 1990, Nucleic Acids Res.，18:3241-3247;Kuoet al., 1991, J.Virol., 65:5118-5123; Kuo et al.，1992 ; U.S.application Ser.Nos.08/131，625and08/301，435)。幾種北美分離株的部分序列也被測定(美國申請08/131，625 和 08/301，435 ;Mardassi et al.，1994，J.Gen.Virol.，75:681-685)。目前可得的疫苗不誘導(dǎo)病毒中和型VN抗體或誘導(dǎo)的抗體水平不適合對抗PRRSV感染。目前沒有商業(yè)可得的含有預(yù)防PRRSV感染或治療PRRS的抗體的產(chǎn)品。目前商業(yè)可得的疫苗不提供對抗PRRS的適當(dāng)保護(hù)。保守估計表明PRRS造成每年美國工業(yè)花費(fèi)$60億。
[0010]為了上述和其他原因，需要本發(fā)明。
[0011]發(fā)明簡述
[0012]本發(fā)明人首次識別了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的保護(hù)性抗原決定子(PAD)，其可治療并提供抗PRRSV感染保護(hù)作用。令人吃驚的，本發(fā)明人鑒定出PRRSV的糖蛋白5(GP5)，基質(zhì)(M)蛋白，或者GP5和M蛋白通過二硫鍵連接形成的異源二聚體可產(chǎn)生提供抗PRRSV保護(hù)作用的PAD。連接M蛋白與GP5蛋白的二硫鍵來自北美PRRSV毒株位置9和EUPRRSV位置8上M蛋白的半胱氨酸以及北美PRRSV毒株位置48和歐洲PRRSV毒株位置50上的GP5蛋白的半胱氨酸。
[0013]一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一或多種分離的多肽，包含含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的糖蛋白5(GP5)的抗原序列，其中GP5蛋白在北美PRRSV毒株中天冬酰胺GP5蛋白的位置1-44或在歐洲PRRSV毒株中GP5蛋白的位置1_46的天冬酰胺具有不同的N-糖基化模式。另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的多肽，其包含含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基質(zhì)(M)蛋白的抗原序列。另一個實(shí)施方案中，抗原序列包括上述的PRRSV GP5序列和基質(zhì)蛋白(M蛋白)，其中GP5蛋白通過二硫鍵連接所述M蛋白，所述二硫鍵由北美PRRSV毒株中第9位以及EU PRRSV毒株中第8位的M蛋白的半胱氨酸與北美PRRSV毒株GP5蛋白的第48位或歐洲PRRSV毒株中第50位的半胱氨酸形成，從而產(chǎn)生GP5-M異源二聚體。本發(fā)明的一個方面中，PAD包括GP5-M異源二聚體，其中包含GP5的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以及M的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
[0014]另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸，其編碼本發(fā)明的任何PAD多肽。因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生針對PRRSV的一或多個保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體的方法，用于制備對抗PRRSV的至少一種PAD的疫苗的方法，給豬接種的方法，預(yù)防或治療豬中的PRRSV感染的方法，以及檢測動物中針對PRRSV的至少一種保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體的方法。
[0015]本發(fā)明涉及產(chǎn)生針對PRRSV的至少一種保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體的方法，包括提供至少一種PAD多肽或編碼PAD多肽的核酸，并將所述肽或核酸給予動物對象。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生針對PRRSV的至少一種保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體的方法，包括:提供PAD多肽或編碼PAD多肽的核酸，并將所述多肽或核酸給予動物對象。本發(fā)明還提供制備針對PRRSV的至少一種PAD的疫苗的方法，所述疫苗包括PAD多肽或編碼PAD多肽的核酸。另一個實(shí)施方案中， 對豬疫苗接種的方法包括給予豬在給予易感豬時有效對抗PRRSV感染的量的包含至少一種PAD多肽或編碼PAD多肽的核酸疫苗。本發(fā)明涉及預(yù)防或治療豬中的PRRSV感染的方法，包括給予豬治療有效量的疫苗，所述疫苗具有至少一種PAD多肽或編碼至少一種PAD多肽的核酸。治療豬中的PRRSV感染的另一種方法包括給予需要治療的動物針對PRRSV的至少一種保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體。還涉及檢測動物中針對PRRSV的至少一種保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體。該方法包括保溫動物例如豬的生物學(xué)樣品包括抗血清與PAD多肽一段足以使得抗體結(jié)合發(fā)生的時間，并測定抗體與所述多肽的結(jié)合。
[0016]另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗至少一種PAD多肽或編碼PAD多肽的核酸的抗體。本發(fā)明還公開了對抗PRRSV感染的疫苗，其中包含有效對抗PRRSV感染的量的至少一種PAD多肽或編碼至少一種PAD多肽的核酸。另一方面，所述疫苗包括生理學(xué)接受的載體。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供試劑盒，其中包含以下物質(zhì)的至少一種:PAD多肽，編碼PAD多肽的核酸，抗PAD多肽的抗體或包含PAD多肽或編碼PAD多肽的核酸的疫苗。
[0017]因此，本發(fā)明的一個目的是提供分離的多肽，其包含含有PRRSV的GP5的PRRSV的PAD。
[0018]本發(fā)明的另一目的是提供分離的多肽，包含含有PRRSV基質(zhì)蛋白(M)的PRRSV的PAD。
[0019]本發(fā)明的另一目的是提供分離的多肽，包含PRRSV的PAD，所述PAD中含有通過二硫鍵與PRRSV的M蛋白連接的PRRSV的GP5。
[0020]本發(fā)明的另一目的是提供分離的編碼PAD多肽的核酸。
[0021]本發(fā)明的另一目的是提供產(chǎn)生針對PRRSV的保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體。
[0022]本發(fā)明的另一目的是提供制備疫苗的方法。
[0023]本發(fā)明的另一目的是提供針對PRRSV的PAD對豬進(jìn)行免疫接種從而有效保護(hù)豬對抗PRRSV感染。
[0024]本發(fā)明的另一目的是提供針對PRRSV的PAD的疫苗，用于保護(hù)豬對抗PRRSV感染。
[0025]本發(fā)明的另一目的是提供治療或預(yù)防豬中的PRRSV感染的方法。
[0026]本發(fā)明的另一目的是提供檢測針對PRRSV的保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體的方法。
[0027]本發(fā)明的另一目的是提供免疫性結(jié)合PRRSV的PAD多肽的抗體。
[0028]本發(fā)明的另一目的是提供有效對抗PRRSV感染的疫苗。
[0029]本發(fā)明的另一目的是提供診斷試劑盒用于分析或檢測PRRSV的PAD的抗體。
[0030]本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方案通過以下具體描述顯而易見。所有公開內(nèi)容全文包含在此作為參考。
[0031]附圖簡述
[0032]圖1:PRRSV GP5信號序列與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1_60)的氨基酸比較。GP5的中和表位加下劃線。N-糖基化糖基化粗體顯示。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的N-聚糖的存在或位置與對PRRSV易感性或PRRSV中和抗體的出現(xiàn)有關(guān)。
[0033]圖2:包含VR2332和HLV013抗血清的非還原Western免疫印跡。豬用VR2332或HLV013在第一天攻擊。所有豬在第90天用VR2332攻擊。兩種檢測的抗原的蛋白濃度相同。抗血清1:4000稀釋。泳道I是標(biāo)準(zhǔn)梯。泳道2是IA97-7895抗原和正常豬血清。泳道3是HLVO13抗原和正常豬血清。 泳道4是LA97-7895抗原和接種(p.1.)42天后的HLVO13抗血清。泳道5是HLV013抗原和p.1.后42天的HLV013抗血清。泳道6是IA97-7895抗原和p.1.42天后的VR2332抗血清。泳道7是HLV013抗原和p.1.42天后的VR2332抗血清。泳道8是IA97-7895抗原和p.1.104天后的HLV013抗血清。泳道9是HLV013抗原和p.1.104天之后的HLVO13抗血清。泳道10是IA97-7895抗原和p.1.104天后的VR2332抗血清。泳道11是HLV013抗原和p.1.104天后的VR2332抗血清。泳道12是標(biāo)準(zhǔn)梯。
[0034]圖3:活PRRSV接種之后豬的不同血清樣品的非還原Western印跡。隨著中和抗體(FFN)效價的增加，對GP-M的抗體反應(yīng)強(qiáng)度的增加表明GP-M特異性抗體的保護(hù)性作用。然而抗GP5單體的抗體強(qiáng)度降低。反應(yīng)強(qiáng)度稍有降低也見于N-N同源二聚體和基質(zhì)單體，但以前的研究顯示這些蛋白的特異性抗體并非保護(hù)性的。泳道1-梯，泳道2-中和效價=256，泳道3-中和效價=1024，泳道4-中和效價=2048。
[0035]圖4:兩次接種HIV013或VR2332的豬中的中和抗體反應(yīng)。每組6只豬的幾何平均效價。*第I組豬(對照)在整個研究中中和抗體一直為陰性。與第2組相比，第3組豬具有更快、更強(qiáng)的抗同源和異源病毒的中和抗體產(chǎn)生。
[0036]圖5:接種異源毒株(麗184)后的中和抗體反應(yīng)。參照實(shí)施例2對各個泳道的描述。該試驗(yàn)提供證據(jù)表明對糖基化不同的各種毒株的保護(hù)性抗體反應(yīng)存在很大差異。缺乏aa44之前的糖基化的HLV013與VR2332相比具有更快、更強(qiáng)的攻擊前抗體反應(yīng)，所述反應(yīng)的交叉反應(yīng)性更強(qiáng)。HLV013接種的豬在攻擊后具有更快的記憶效應(yīng)和更快地產(chǎn)生抗攻擊毒株抗體。注意到麗184和VR2332的GP5-M異源二聚體由于存在另外的N-多肽而具有稍高的分子量。
[0037]圖6:比較實(shí)施例3中針對不同PRRSV聚糖類型組產(chǎn)生的中和抗體的幾何平均效價。
[0038]圖1:比較第I組和第2組的豬的抗體反應(yīng)性的非還原Western印跡。參見實(shí)施例3中的表關(guān)于泳道內(nèi)容物的描述。該圖顯示與單獨(dú)的HLV013相比，在HLV013-HLV093方案中產(chǎn)生的保護(hù)性抗體的增加是由于對GP5-M的反應(yīng)性增加。
[0039]圖8:比較HLV093接種的豬(泳道I)和VR2332-VR2332接種的豬(泳道3 )的抗體圖譜的非還原Western印跡。泳道2顯示梯。純化的VR2332蛋白用作受試抗原(IOug每泳道)。一級抗體稀釋度為1:100，二級抗體稀釋度為1:2000。泳道I中的抗-VR2332FFN效價為256，泳道3中的為16。因此HLV013-HLV093接種的豬與VR2332-VR2332接種的豬相比具有更高的抗-VR2332中和效價。對GP-M異源二聚體的反應(yīng)的明顯差異也見于Western印跡中。
[0040]圖9:VR2332GP5_M異源二聚體。虛線表示N-連接的聚糖(未按比例顯示(not toscale))。
[0041]圖10:HLV013GP5_M 異源二聚體。
[0042]圖11:HLV093GP5_M 異源二聚體。
[0043]圖12:HLV092GP5_M 異源二聚體。
[0044]圖13: Lelystad GP5-M 異源二聚體。
[0045]圖14:肽ELISA數(shù)據(jù)。肽ELISA檢測PRSSV GP5的病毒中和表位的抗體。豬(n=6每組)用相同效價的HLVO13或VR2332PRRSV在第0天接種。
[0046]圖15:用HLV013粗病毒抗原(CVA)或Intervet’s殺死的疫苗接種的豬中的平均IDEXX ELISA 反應(yīng)。
[0047]圖16.沒有聚糖封閉(block)或屏蔽(shield)的中和表位。
[0048]圖17.具有聚糖封閉的中和表位(BNE)。
[0049]圖18.僅僅具有聚糖屏蔽的中和表位。
[0050]圖19.具有聚糖封閉和聚糖屏蔽的高度糖基化毒株。
[0051]圖20.HLVO13完整0RF5和6，分別對應(yīng)GP5和M蛋白。
[0052]圖2IA和21B.編碼基質(zhì)蛋白的0RF6序列。 [0053]圖22A和22B.PRRSV GP5信號序列和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的實(shí)例。
[0054]圖23.對應(yīng) GP5 的 HLV092 完整 0RF5。
[0055]圖24.對應(yīng) GP5 的 HLV093 完整 0RF5。
[0056]優(yōu)選實(shí)施方案詳述
[0057]本發(fā)明人首先鑒定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的保護(hù)性抗原決定子(PAD)，其提供針對PRRSV感染的治療和保護(hù)。
[0058]本領(lǐng)域已知利用PRRSV疫苗的異源保護(hù)作用的降低或缺失。本發(fā)明人認(rèn)為PRRSV的糖蛋白5(GP5)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中天冬酰胺N-糖基化模式的改變或GP5與另一種蛋白例如PRRSV的M蛋白的相互作用導(dǎo)致GP5構(gòu)象的改變在提供針對PRRSV的保護(hù)作用中起重要作用。一方面，GP的結(jié)構(gòu)通過與PRRSV的M蛋白形成異源二聚體而改變。見圖9-12。核苷酸或氨基酸序列的改變可導(dǎo)致構(gòu)象改變或在GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上添加或減少N-連接的糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明人還表明對PRRSV的M蛋白的改變也可影響異源二聚體構(gòu)象。本發(fā)明人相信PRRSV的糖蛋白5(GP5)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或PRRSV的糖蛋白5 (GP5)與基質(zhì)蛋白(M蛋白)通過二硫鍵連接形成的GP5-M異源二聚體中天冬酰胺的N-糖基化模式的改變導(dǎo)致提供抗PRRSV感染保護(hù)的PAD。連接M蛋白和GP5蛋白的二硫鍵來自位于北美毒株位置48和歐洲毒株位置50的GP5蛋白的半胱氨酸。一方面，所述半胱氨酸位于北美PRRSV毒株M蛋白的位置9以及歐洲PRRSV毒株中的位置8。
[0059]一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一或多個包含分離的多肽的PAD，所述分離的多肽包含含有PRRSV的糖蛋白5 (GP5)的抗原序列，其中GP5蛋白具有不同的天冬酰胺N-糖基化模式，所述天冬酰胺位于北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置1-44或者位于歐洲PRRSV毒株GP5蛋白的位置1-46。一方面，PAD包括GP5的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。另一方面，PAD包括GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的中和表位。一方面，所述中和表位具有氨基酸序列SHLQLIYNL。
[0060]另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含分離的多肽的PAD，所述分離的多肽含有包含PRRSV的基質(zhì)(M)蛋白的抗原序列。一方面，所述抗原序列是M蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。一方面，所述所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括NA或EU PRRSV毒株的M蛋白的前30或更少個氨基酸。
[0061]另一個實(shí)施方案中，所述抗原序列包含本文所述的GP5序列以及PRRSV的基質(zhì)(M)蛋白，其中GP5蛋白通過二硫鍵連接于M蛋白，所述二硫鍵由北美PRRSV毒株位置9和EU PRRSV位置8上M蛋白的半胱氨酸以及北美PRRSV毒株位置48和歐洲PRRSV毒株位置50上的GP5蛋白的半胱氨酸形成，從而產(chǎn)生GP5-M異源二聚體。
[0062]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5的PAD可不具有位于NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的任何聚糖。另一方面，GP5的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖。另一方面，GP5的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖并且具有或不具有位于NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1_35的聚糖，例如在一些NA PRRSV毒株中所見。
[0063]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5-M異源二聚體的PAD可不具有位于NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的任何聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖并且具有或不具有NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1_35的聚糖，例如在一些NA PRRSV毒株中所見。
[0064]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5的PAD可不具有位于EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的任何聚糖，如在Lelystad中所見。另一方面，GP5的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖。另一方面，GP5的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖并且具有或不具有EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的聚糖，例如在一些EU PRRSV毒株中所見。
[0065]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5-M異源二聚體的PAD可不具有來自EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的任何聚糖，如在Lelystad中所見。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖并且具有或不具有EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的聚糖，例如在一些EU PRRSV毒株中所見。
[0066]另一個實(shí)施方案中，PAD包括抗原序列，所述抗原序列包含NA PRRSV的GP5的氨基酸36-45和PRRSV的M蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。另一方面，M蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含氨基酸1-30。本發(fā)明另一實(shí)施方案中，PAD包括抗原序列，所述抗原序列包含EU PRRSV的GP5的氨基酸38-47和PRRSV的M蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。GP5蛋白可具有不同的天冬酰胺N-糖基化模式，所述天冬酰胺位于北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置1-44或者位于歐洲PRRSV毒株GP5蛋白的位置1-46。這些變化也包括在本發(fā)明的PAD中。
[0067]因此，通過鑒定這樣的PAD可開發(fā)有效對抗PRRSV的疫苗，所述PAD包含N-糖基化的或非-N-糖基化的來自GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸1-46的GP5蛋白或M蛋白通過二硫鍵與來自PRRSV的GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸1-46的N-糖基化或非-N-糖基化GP5蛋白相連的GP5-M異源二聚體。
[0068]本發(fā)明的疫苗包括本文所述的PAD多肽，并可包括但不限于免疫原性片段，其衍生物，類似物或變體，包括與圖1所示任意PAD氨基酸序列至少65%相同，80%相同，95%相同或100%相同的氨基酸序列。SEQ ID N0S:—。
[0069]本發(fā)明的PAD包括下述片段的衍生物，類似物或變體，所述片段是免疫原活性易于篩選的片段，以及免疫原性片段，例如圖1和21所示片段(SEQ ID NOS:_)。因此，可利用中和分析來檢測其衍生物、類似物或變體，或利用諸如熒光聚焦中和(FFN)實(shí)驗(yàn)檢測所述衍生物、類似物或變體為異源PRRSV攻擊的豬提供保護(hù)作用的能力，或利用對異源二聚體進(jìn)行的Western印跡檢測來表明異源抗體的產(chǎn)生。因此，特異性片段可包括但不限于具有圖1和21所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:—)的片段。認(rèn)為GP5-M異源二聚體的片段可提供類似程度的保護(hù)作用是合理的。
[0070]一方面，所述疫苗可為減毒的疫苗、滅活的疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗、載體疫苗或基于DNA的疫苗。另一方面，所述疫苗可用于免疫計劃或方案中。本發(fā)明另一方面中，PAD可用于制備抗體診斷基于PAD的PRRSV接種是否成功或產(chǎn)生用于預(yù)防和/或治療PRRSV感染的疫苗。除了用作疫苗，本發(fā)明的PAD多肽可用作抗原刺激抗體產(chǎn)生，所述抗體可用于被動免疫治療，用作診斷劑，以及用作其他方法諸如親和層析的試劑。
[0071]定義:
[0072]本發(fā)明術(shù)語〃豬繁殖與呼吸綜合征病毒〃或"PRRSV 〃指病毒，其導(dǎo)致疾病PRRS, PEARS, SIRS, MSD和/或PIP (術(shù)語〃PIP〃不常用目前)，包括衣阿華PRRSV毒株，美國發(fā)現(xiàn)的其他PRRSV毒株(例如，VR2332)，加拿大發(fā)現(xiàn)的PRRSV毒株(例如，IAF-exp91)，歐洲發(fā)現(xiàn)的PRRSV毒株(例如，Lelystad病毒，PRRSV-10)，以及與這些病毒密切聯(lián)系的已經(jīng)出現(xiàn)或?qū)沓霈F(xiàn)的變體。
[0073]不受影響的豬是沒有暴露于豬繁殖與呼吸綜合征感染因子的豬，或已經(jīng)暴露于豬繁殖與呼吸綜合征感染因子諸如PRRSV但沒有顯示疾病癥狀的豬。受影響的豬是顯示PRRSV癥狀或從其可分離PRRSV的豬。
[0074]術(shù)語“治療”指減輕或緩解PRRSV感染的至少一種不良作用或癥狀。PRRS的臨床表征或癥狀包括體重下降(weight loss),體重增加減少(decreased weight gain),嗜眠癥(lethargy),呼吸窘迫(respiratory distress),“喘粗氣(thumping) ”(呼氣費(fèi)力(forcedexpiration)),發(fā)熱(fever),皮毛粗糙(roughened haircoats),打噴嚷(sneezing),咳嗽(coughing),眼睛水腫(eyeedema)以及偶發(fā)結(jié)膜炎(conjunctivitis)。病變可包括宏觀和/ 或微觀月市病變(gross and/or microscopic lung lesion),心肌炎(myocarditis),淋巴腺炎(lymphadenitis),腦炎(encephalitis)和鼻炎(rhinitis)。此外，PRRSV 以及衣阿華毒株的毒力較低和非毒性形式已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其可導(dǎo)致上述癥狀中的一部分或根本不產(chǎn)生癥狀。PRRSV的毒性較低和非毒性形式可根據(jù)本發(fā)明使用提供針對豬繁殖與呼吸疾病的保護(hù)作用。
[0075]術(shù)語“0RF”指開放框架，或編碼多肽的片段，其分離自病毒基因組，包括PRRSV基因組。本發(fā)明的多聚核酸中，ORF可部分(作為片段)或全部包括，并且可與相鄰ORF的5’或3’末端重疊。
[0076]“核酸”或“多核苷酸”指嘌呤和嘧啶，其中含有任何長度的聚合物，包括聚核糖核苷酸和聚脫氧核糖核苷酸或混合的聚核糖-聚脫氧核糖核苷酸。這包括單鏈-和雙鏈分子，即，cDNA，mRNA, DNA-DNA, DNA-RNA和RNA-RNA雜合子，以及將堿基與氨基酸主鏈相連形成的“蛋白質(zhì)核酸”(PM)。這也包括含有修飾的堿基的核酸。
[0077]“載體”是任何用于將核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞的工具。載體可為可連接另外的DNA片段的復(fù)制子，從而使得連接的片段得以復(fù)制?！皬?fù)制子”是任何遺傳元件(例如質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，染色體，病毒)其作為DNA體內(nèi)復(fù)制的自主復(fù)制單元，即能在其自身的控制之下進(jìn)行復(fù)制。術(shù)語“載體”包括病毒和非病毒工具，用于將核酸在體外、離體或體內(nèi)條件下引入細(xì)胞。病毒載體包括甲病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺伴隨病毒，痘病毒(pox)，桿狀病毒，痘苗病毒，單純皰疫病毒，Epstein-Barr和腺病毒載體。非病毒載體包括但不限于質(zhì)粒，脂質(zhì)體，細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑(cytofectins), DNA-蛋白復(fù)合體，以及生物聚合物。除了核酸,載體也可含有一或多個調(diào)節(jié)區(qū)，和/或可選擇標(biāo)記用于選擇、測定和監(jiān)測核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移到哪個組織，表達(dá)持續(xù)時間等)。
[0078]“盒”指DNA片段，其可插入載體的特定限制位點(diǎn)。該DNA片段編碼目的多肽，并且盒以及限制位點(diǎn)用于保證將盒插入適當(dāng)?shù)淖x框中用于轉(zhuǎn)錄和翻譯。[0079]當(dāng)所述DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時，細(xì)胞被外源或異源DNA “轉(zhuǎn)染”。
[0080]當(dāng)轉(zhuǎn)染的DNA改變表型時，細(xì)胞被外源或異源DNA “轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化的DNA可整合入(共價連接)染色體DNA，構(gòu)成細(xì)胞的基因組。 [0081]“核酸分子”指核糖核苷酸的磷酸酯聚合形式(腺苷，鳥苷，尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷酸(脫氧腺苷，脫氧鳥苷，脫氧尿苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯和硫酯，可為單鏈形式或雙鏈螺旋。雙鏈DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋都是可能的。術(shù)語核酸分子，具體是DNA或RNA分子，僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，并且不限于任何具體的三級形式。因此，該術(shù)語包括見于線性或環(huán)狀DNA分子(例如限制片段)、質(zhì)粒和染色體等中的雙鏈DNA。在對具體的雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)的討論中，序列可根據(jù)常規(guī)表示成沿DNA未轉(zhuǎn)錄鏈(即具有與mRNA類似的序列的鏈)的5’到3’方向。“重組DNA分子”是經(jīng)過分子生物學(xué)操作的DNA分子。
[0082]本文中“多肽”通常指具有超過8個氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。
[0083]“保守修飾的變體”用于氨基酸以及核酸序列。對于具體的核酸序列，保守修飾的變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或核酸不編碼氨基酸序列的情況下，指基本相同的序列。由于遺傳密碼簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定多肽。例如，密碼子CGU，CGC, CGA, CGG, AGA和AGG都編碼精氨酸。因此，在精氨酸通過密碼子描述的每個位置，密碼子可改變成任何對應(yīng)密碼子，其不改變編碼的多肽。所述核酸變體是“沉默取代”或“沉默改變”，這是“保守修飾的改變“的一種。本文中每個編碼多肽的多核苷酸序列也描述任何可能的沉默改變，除非另有說明。因此，沉默改變是每個編碼氨基酸的核酸序列的內(nèi)在特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到核酸中的每個密碼子(除了 AUG，其通常是蛋氨酸的唯一密碼子)可經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)修飾產(chǎn)生功能相同的分子。一些實(shí)施方案中，編碼PAD的核酸序列優(yōu)選經(jīng)優(yōu)化在用于產(chǎn)生酶的具體的宿主細(xì)胞(例如酵母，哺乳動物，植物，真菌等)中表達(dá)。
[0084]對于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到對核酸、肽、多肽或蛋白序列的單個取代、缺失或添加改變、添加或缺失所編碼序列中單個氨基酸或小部分氨基酸，其未“保守修飾的變體”，在本文稱為“變體”，其中改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)類似的氨基酸取代。已知保守取代列表提供了功能相似的氨基酸。見例如Davis et al.,“Basic Methods in MolecularBiology”Appleton&Lange, Norwalk, Connecticut (1994)。所述保守修飾的變體補(bǔ)充并不排除本發(fā)明所述多態(tài)性變體，種間類似物，以及等位基因。
[0085]以下8組每個都包含互為保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ;2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ;3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ;4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ; 5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V) ;6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y),色氨酸(W) ;7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(見例如，Creighton, 1984, Proteins)。
[0086]術(shù)語“相同”或百分比“相同性”在兩或多個核酸或多肽序列的情況下，指相同或具有規(guī)定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸的序列或亞序列(即在比較窗或規(guī)定區(qū)域中比較和排列最大相應(yīng)性時，在規(guī)定的區(qū)域中(例如PRRSV的GP5蛋白的中和表位序列)具有大約70% 相同性，優(yōu)選 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或更高相同性)，如利用BLAST或BLAST2.0序列比較算法以及下列默認(rèn)參數(shù)，或通過人工比對和目測評估所測定的那樣。所述序列稱為“基本相同”。該定義也用于受試序列的互補(bǔ)序列。所述定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，優(yōu)選算法可用于計算缺口等。優(yōu)選，長度至少約25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域或50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域中存在相同性。
[0087]為了序列比較，通常一個序列作為參照序列，與受試序列比較。利用序列比較算法，將受試和參照序列輸入計算機(jī)，說明亞序列坐標(biāo)，如果必要，說明序列算法程序參數(shù)。可使用默認(rèn)程序參數(shù)或可使用其他參數(shù)。序列比較算法隨后基于程序參數(shù)計算受試序列與參照序列的百分比序列相同性。
[0088]“比較窗”包括參照長度為20-600個中任何數(shù)目的連續(xù)位置的片段，更常見所述片段長度為大約100-大約150，其中當(dāng)兩條序列最佳排列時所述序列可與相同個連續(xù)位置的參照序列比較。排列序列用于比較的方法是本領(lǐng)域已知的。排列序列用于比較可通過例如局部同源性排列進(jìn)行，例如見Smith&Waterman, 1991, Adv.App1.Math.2:482,通過同源性排列進(jìn)行，見 Needleman&ffunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443,通過搜索類似性方法進(jìn)行，見Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA85:2444,通過計算機(jī)執(zhí)行這些算法進(jìn)行(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison, ffis.),或通過人工排列和目測進(jìn)行(見例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel etal.,eds.1995supplement)。
[0089]另一適合確定百分比序列相同性和序列相似性的排列實(shí)例是BLAST和BLAST2.0算法，分別描述于 Altschul et al., 1977, Nuc.Acids Res.25:3389-3402 和 Altschul etal., 1990，J.Mol.Biol.215:403-410。進(jìn)行 BLAST 分析的軟件可通過 National Center forBiotechnology Information (http: //world wide web at ncb1.nlm.nih.gov/)獲得。該算法涉及通過鑒定查詢 序列中長度W的短詞來來首先鑒定高評分序列對(HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞比較時，其或匹配或滿足一些正值閾值分?jǐn)?shù)T。T指相鄰詞評分閾值(Altschul et al.，supra)。這些初始相鄰詞擊中作為啟動搜索發(fā)現(xiàn)較長的包含它們的HSP的種子，詞擊中可沿每個序列的兩個方向隨累計排列分?jǐn)?shù)增加而延伸。累計分?jǐn)?shù)對于核苷酸序列利用參數(shù)M(匹配殘基對的獎勵分；總>0)和N(不匹配殘基罰分；總〈O)。對于氨基酸序列，得分矩陣用于計算累積得分。每個方向詞擊中的延伸在以下情況下停止:累計排列分比最大獲得值降低數(shù)量X ;累計評分為零或更低；或到達(dá)每個序列末端。BLAST算法參數(shù)W，T和X決定排列敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)，默認(rèn)詞長(W)為11，預(yù)期(E)為10，M=5，N=-4并且對兩條鏈都進(jìn)行比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序利用默認(rèn)詞長 3，預(yù)期(E) 10,以及 BL0SUM62 評分矩陣(見 Henikoff&Henikoff, 1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915)排列(B) 50，預(yù)期(E) 10, M=5, N=-4,并比較兩條鏈。
[0090]BLAST算法也進(jìn)行兩序列相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(見例如，Karlin&Altschul, 1993，Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA90:5873-5787)。一種 BLAST 算法提供的相似性測定法是最小和概率(smallest sum probability) (P (N)),其表明兩個核苷酸或氨基酸序列之間匹配的概率。例如，如果受試核酸與參照核酸相比的最小和概率小于大約0.2，更優(yōu)選小于大約0.01，最優(yōu)選小于大約0.001，則核酸被認(rèn)為與參照序列相似。
[0091]兩個核酸序列或多肽基本相似的指示是第一核酸編碼的多肽與抗第二核酸編碼的多肽的抗體免疫學(xué)交叉反應(yīng)，如下所示。因此，肽通常與第二多肽基本相同，例如，兩個肽僅僅在保守取代上不同。另一表明兩個核酸序列基本相同的指示是兩個分子或其互補(bǔ)物在嚴(yán)格條件下互相雜交，如下所述。兩個核酸序列基本相同的另一指示是可使用相同的引物擴(kuò)增核酸序列。
[0092]本文中蛋白或肽基本不含細(xì)胞物質(zhì)或不含化學(xué)前提或其他化學(xué)物質(zhì)，則為“分離的”或“純化的”。本發(fā)明的變體肽可純化到均質(zhì)或其他純度。純化水平有賴于使用目的。重要特征在于所述制備允許變體肽的所需功能，即使存在大量其他成分時也如此。
[0093]一些用途中，“基本不含細(xì)胞物質(zhì)”包括制備這樣的變體肽，其具有低于大約30%(干重)其他蛋白質(zhì)(即污染性蛋白質(zhì))，低于大約20%其他蛋白質(zhì)，低于大約10%其他蛋白質(zhì)，或低于大約5%其他蛋白質(zhì)。如果變體多肽是重組制備的，其也可基本不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基代表低于蛋白質(zhì)制備物的大約20%。
[0094]術(shù)語“基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”包括從參與變體肽合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)分離的變體肽制備物。一個實(shí)施方案中，“基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”包括這樣的變體蛋白制備物，其含有低于大約30% (干重)化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，低于大約20%化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，低于大約10%化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，或低于大約5%化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。
[0095]分離的變體蛋白可從天然表達(dá)它的細(xì)胞純化，從經(jīng)改變表達(dá)它的細(xì)胞純化(重組)，或利用已知的蛋白合成方法來合成。例如，將編碼變體PAD蛋白的核酸分子克隆入表達(dá)載體，并將所述表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)變體蛋白。變體蛋白可隨后通過適當(dāng)純化方案利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)從細(xì)胞分離。許多這些技術(shù)在下文詳述。
[0096]在氨基酸至少是蛋白質(zhì)的最終氨基酸序列的一部分時蛋白由氨基酸序列組成。由此，蛋白可為PAD多肽，變體PAD多肽和/或具有其他氨基酸分子，諸如氨基酸殘基(連續(xù)編碼的序列)，天然相關(guān)或異源氨基酸殘基/肽序列。所述蛋白具有一些其他氨基酸殘基或可包含數(shù)百個或更多其他氨基酸。關(guān)于這些蛋白的各種變體如何制備/分離的描述見下文。
[0097]本發(fā)明的變體蛋白可與異源序列連接形成嵌合或融合蛋白。所述嵌合和融合蛋白包含可操作連接于具有并非基本與變體蛋白同源的氨基酸序列的異源蛋白的變體蛋白?！翱刹僮鬟B接”表明變體蛋白和異源蛋白框內(nèi)融合。異源蛋白可融合于變體蛋白的N或C末端。
[0098]嵌合或融合蛋白可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備。例如，編碼不同蛋白序列的DNA片段根據(jù)常規(guī)技術(shù)框內(nèi)連接。另一實(shí)施方案中，融合基因通過常規(guī)技術(shù)包括自動DNA合成儀來合成?？蛇x，可利用錨定引物對基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物導(dǎo)致兩連續(xù)基因片段之間重疊，隨后退火并再擴(kuò)增產(chǎn)生嵌合基因序列(見Ausubel et al., Current Protocolsin Molecular Biology, 1992)。此外,許多表達(dá)載體可商購,其編碼融合部分(例如GST蛋白)。變體蛋白的編碼核酸可克隆入所述載體使得融合部分與變體蛋白框內(nèi)連接。
[0099]多肽有時含有除外常規(guī)的20種天然存在氨基酸以外的氨基酸。許多氨基酸，包括末端氨基酸可經(jīng)天然過程修飾，例如加工和其他翻譯后修飾，或通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾。天然存在多肽內(nèi)的常見修飾見教科書，圖示，以及研究報告等，均為本領(lǐng)域已知的。因此，本發(fā)明的變體肽包括衍生物或類似物，其中取代的氨基酸殘基不是遺傳密碼編碼的，并且包括取代組，其中成熟多肽與另外的化合物融合，諸如增加多肽半壽期的化合物(例如，聚乙二醇)，或者其中另外的氨基酸與成熟多肽融合，諸如前導(dǎo)或分泌序列或用于純化多肽或原肽序列的序列。
[0100]已知修飾包括但不限于乙?；；珹DP-核糖基化，酰胺化，與黃素共價結(jié)合，與血紅素部分共價結(jié)合，與核苷酸或核苷酸衍生物共價結(jié)合，與脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物共價結(jié)合，與磷脂酰肌醇共價連接，交聯(lián)，環(huán)化，二硫鍵形成，去甲基化，形成共價交聯(lián)，形成半胱氨酸，形成焦谷氨酰胺，甲?；?，gamma羧化，糖基化，GPI錨定物形成，羥化，碘化，甲基化，肉豆蘧酰化，氧化，蛋白水解，磷酸化，異戊烯化，外消旋化，硒基化，硫酸鹽化，轉(zhuǎn)運(yùn)-RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白的添加諸如精氨酸化，以及泛化。 [0101]本發(fā)明還提供變體蛋白和肽，其包含或由以下片段組成，所述片段作為抗原決定子和/或可治療PRRSV感染和/或提供抗PRRSV感染的保護(hù)作用。
[0102]本發(fā)明的片段包括來自PAD多肽或變體蛋白的至少8個或更多連續(xù)氨基酸殘基。
[0103]術(shù)語“片段”，“衍生物”和“類似物”用于本發(fā)明的多肽時，意指基本保持與所述多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽，即作為抗原決定子和/或提供抗PRRSV感染的治療和/或保護(hù)作用。所述片段，衍生物和類似物可基于保持一或多種PAD多肽生物活性的能力來選擇，即作為抗原決定子和/或提供抗PRRSV感染的治療和/或保護(hù)作用的能力。因此，類似物包括來自不同毒株或種并保持與PAD多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽疫苗可為重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
[0104]“抗原決定子”在沒有另外說明下，是能激發(fā)特定動物或物種內(nèi)的免疫反應(yīng)的分子?？乖瓫Q定子包括蛋白質(zhì)分子，例如聚氨基酸序列，多肽，片段，衍生物或變體，其中可包括其他部分，例如碳水化合物部分，諸如聚糖和/或脂質(zhì)部分。
[0105]本發(fā)明的抗原決定子也可為異源的，包括來自其他病毒、PRRSV毒株或科的中和表位的抗原決定子，其與應(yīng)答于本發(fā)明的PAD產(chǎn)生的抗體或抗血清交叉反應(yīng)，例如GP5-M異源二聚體，并能在具體動物例如豬中激發(fā)免疫反應(yīng)。
[0106]〃M〃在本文指PRRSV的基質(zhì)蛋白或PRRSV多肽。術(shù)語“M”包括這樣的片段，衍生物或類似物，其可與GP5蛋白形成異源二聚體，并提供與PRRSV毒株的交叉反應(yīng)。
[0107]〃GP5〃在本文指PRRSV的糖蛋白5。術(shù)語“GP5”也包括這樣的片段，衍生物或類似物，其可與GP5蛋白形成異源二聚體，并提供與PRRSV毒株的交叉反應(yīng)。因此，GP5類似物，例如來自另外的動脈炎病毒的GP5也包含在本發(fā)明內(nèi)。GP5類似物中對應(yīng)NA PRRSV毒株中GP5的位置44或EU PRRSV毒株中GP5的位置46的位置可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，并包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0108]術(shù)語"GP5-M異源二聚體〃包括與PRRSV的M蛋白結(jié)合的GP5或任何改變GP5構(gòu)象的其他蛋白或肽，從而在給予豬時提供抗PRRSV的保護(hù)作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員能利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和方法檢測GP5的構(gòu)象改變，例如利用僅僅識別非異源二聚體形式的GP5蛋白的單克隆抗體。因此，本發(fā)明一方面包括來自相同或不同毒株或病毒的GP5蛋白或M蛋白，所述毒株或病毒包括但不限于馬動脈炎病毒(EAV)，乳酸脫氫酶升高型病毒(lactatedehydrogenase-elevating virus) (LDV),和猿出血熱病毒(SHFV)家族成員。因此，除了本發(fā)明，嵌合GP5-M異源二聚體也可用作PAD，例如用于免疫方案中。
[0109]本發(fā)明中，GP5蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域長度大約60-65個氨基酸，包括信號肽和加工后的短N(yùn)末端區(qū)，長度大約30個氨基酸，包括N糖基化位點(diǎn)。見圖1。本發(fā)明術(shù)語“高變”區(qū)指GP5蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，例如PRRSV(NA)北美毒株中GP5的氨基酸1_35以及(EU)樣PRRSV毒株中GP5的氨基酸1-37或GP5類似物或等價物。GP5的其他片段、類似物或衍生物中細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的對應(yīng)區(qū)域和位置可通過例如本發(fā)明所述的比對方法確定。此外，本發(fā)明還涉及GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中一或多個氨基酸的突變，其導(dǎo)致所述氨基酸的糖基化。因此，可在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生在NA PRRSV毒株中位置44或EU PRRSV毒株中的位置46以外的位置具有糖基化的GP5，其具有相同效果(對抗PRRSV感染的保護(hù)作用)。這些變體也可用于本發(fā)明中。
[0110]本文中M蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域指M蛋白N末端的前30個氨基酸或其類似物或等價物。M蛋白的其他片段，類似物或衍生物中的對應(yīng)區(qū)域和位置可通過本發(fā)明所用比對方法
確定。 [0111]術(shù)語“生物學(xué)樣品”指通常含有抗體或病毒顆粒的哺乳動物(例如豬，兔，馬)的體液或組織。所述物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的，并不限于血液，血漿，血清，脊髓液，淋巴液，呼吸道、腸道或泌尿生殖道分泌物，眼淚，唾液，乳液，白細(xì)胞和骨髓瘤。
[0112]本發(fā)明中，抗體的定義與本領(lǐng)域常用的一致:它們是哺乳動物應(yīng)答抗原攻擊產(chǎn)生的多亞基蛋白。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，以及所述抗體的片段，包括但不限于Fab或F(ab’)hd2,和Fv片段。
[0113]本發(fā)明中，術(shù)語“亞基”指本身具有抗原性的PRRSV部分，即能在動物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的部分。該術(shù)語應(yīng)理解為包括可通過重組和生物化學(xué)方法獲得的亞基。
[0114]本發(fā)明術(shù)語“多價”意指含有一個以上來自PRRSV的分離株的疫苗，所述分離株可來自相同種(即PRRSV的不同分離株)或來自不同PRRSV。對于給定PRRSV的屬和種，每種分離株可與其他分離株共有一些抗原(即“共同”抗原)，而其他抗原對于該分離株而言為獨(dú)特的。因?yàn)槎鄡r疫苗為宿主免疫系統(tǒng)提供多種抗原，宿主中刺激的免疫反應(yīng)比僅僅單個分離株刺激的更廣。
[0115]本發(fā)明術(shù)語“分離株”指獲自特定來源的病毒。分離株可與術(shù)語“毒株”互換使用。
[0116]術(shù)語“毒性”指保持感染動物宿主的能力的分離株。
[0117]術(shù)語“滅活的”指含有不能繼續(xù)復(fù)制和/或生長的感染生物體的疫苗。
[0118]術(shù)語〃PRRSV〃指所有屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬的PRRSV。
[0119]術(shù)語“疫苗”指藥物組合物，其包含至少一種免疫學(xué)PAD，可誘導(dǎo)動物中的免疫反應(yīng)，并可能但不必包含一或多種其他可促進(jìn)所述活性組分的免疫學(xué)活性的成分。疫苗還可包括其他藥物組合物中常用的組分。疫苗的免疫活性組分包括原始形式的完全活病毒，或者在所謂的修飾的活疫苗中的減毒病毒，或所謂的殺死的疫苗中通過適當(dāng)方法滅活的病毒。另一形式中，疫苗的免疫活性組分可包含所述病毒的適當(dāng)元件(亞單位疫苗)，由此，這些元件可通過以下方法產(chǎn)生:破壞整個活生物體或所述病毒的生長培養(yǎng)物，隨后進(jìn)行純化步驟產(chǎn)生所需的結(jié)構(gòu)，或適當(dāng)操作適宜系統(tǒng)誘導(dǎo)合成過程并隨后進(jìn)行分離和純化步驟，所述系統(tǒng)諸如但不限于細(xì)菌、昆蟲、哺乳動物或其他物種，或通過利用適宜藥物組合物直接摻入遺傳物質(zhì)而在需要疫苗的動物中誘導(dǎo)所述合成過程(多核苷酸接種)。疫苗可包括一種或同時包括一種以上的上述元件。
[0120]術(shù)語“保護(hù)”，“保護(hù)作用”，“保護(hù)性免疫力〃或〃保護(hù)性免疫反應(yīng)，〃在本發(fā)明中
意指宿主豬對本發(fā)明的疫苗或多肽產(chǎn)生主動免疫反應(yīng)，諸如暴露于病毒或毒性病毒攻擊之后，豬能對抗感染。因此，保護(hù)性免疫反應(yīng)將在暴露于病毒后使得豬的病死率和死亡率降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解在商業(yè)背景中，保護(hù)性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生可通過評估接種對整個豬群的影響來估計，例如接種后的豬中仍然有少量出現(xiàn)死亡和病死。此外，保護(hù)作用還包括減輕任何宏觀或組織病理學(xué)改變的嚴(yán)重性(例如肺中的病變)和/或PRRS的癥狀，所述減輕作用是與沒有受到保護(hù)的相似的豬中的分離株導(dǎo)致的改變和癥狀相比的(即與適宜對照相比)。因此，保護(hù)性免疫反應(yīng)將減輕PRRSV的癥狀，包括但不限于與對照豬相比PRRS的臨床表現(xiàn)或癥狀減輕，所述臨床表現(xiàn)或癥狀包括:體重下降，體重增加減少，嗜眠癥，呼吸窘迫，“喘粗氣”(呼氣費(fèi)力)，發(fā)熱，皮毛粗糙，打噴嚏，咳嗽，眼睛水腫以及結(jié)膜炎，宏觀病變，微觀肺損傷，心肌炎，淋巴腺炎，腦炎和鼻炎。
[0121]術(shù)語“活病毒”指保持感染適當(dāng)對象的能力的病毒(與滅活(殺死的)或亞單位疫苗相比)。
[0122]術(shù)語“免疫有效量”指有效減輕、消除、治療、預(yù)防或控制PRRSB感染癥狀、疾病、病癥或病情的量。
[0123]一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含PRRSB的PAD，在本文中稱為PAD多肽。本發(fā)明涉及的多肽可為PAD的類似物，衍生物或變體，以及其免疫活性或功能片段。所述多肽可為分離的、合成的、或利用編碼PAD的核酸重組表達(dá)的形式。
[0124]本發(fā)明PAD的實(shí)例包括但不限于圖1，20，21和22所示的氨基酸序列(SEQ IDN0S:—)。這些PAD可作為片段、多肽、蛋白或者作為具有所需的在GP5-M異源二聚體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的糖基化的PRRSV根據(jù)本文所述的免疫學(xué)方案給藥。本發(fā)明核酸分子的其他實(shí)例包括但不限于編碼以下肽的核苷酸序列:(HLV013)MLGRCLTAGC CSQLPFLffCI VPFCLVALVNANSNSGSHLQ LIYNLTLC EL NGTDffLKDKF(SEQ ID NO:—)或 HLV093MLGRCLTACY CLRLLSLffCIVPFffFAVLVS ANSNSSSHLQ SIYKLTLCEL NGTEffLNERF(SEQ ID NO:—)。
[0125]本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明PAD的分離的和/或重組核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，PAD的核苷酸序列編碼PRRS的中和表位。此外，應(yīng)理解基于本領(lǐng)域總體狀態(tài)，其他與PAD的核苷酸或氨基酸序列等價的序列包含在本發(fā)明中。例如，GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的一些缺失、插入和取代包含在本發(fā)明中，除非所述突變消除PAD誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的能力。
[0126]本發(fā)明編碼PAD的核酸可用于多種用途，包括相應(yīng)PAD多肽的重組表達(dá)。
[0127]本發(fā)明的核酸包括編碼整個PAD的核酸以及編碼PAD多肽的亞序列的核酸。例如，本發(fā)明包括編碼并非全長PAD的多肽但具有抗PRRSB感染的保護(hù)性抗原活性的核酸。本發(fā)明不僅包括含有前述核苷酸序列的核酸，也包括與所示實(shí)施方案基本相同或基本互補(bǔ)的核酸。例如，本發(fā)明包括包含這樣的核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列與前述序列至少約70%相同，更優(yōu)選與所示核苷酸序列至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%相同。核苷酸序列可如上所示修飾，只要編碼的多肽能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生即可。
[0128]編碼本發(fā)明PAD的核酸可利用本領(lǐng)域已知方法獲得。適宜核酸(例如，cDNA,基因組或亞序列)可被克隆，或體外擴(kuò)增，諸如利用適宜引物在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，自我維持性序列復(fù)制系統(tǒng)(SSR)進(jìn)行。多種克隆和體外擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域已知的。足以指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行克隆的這些技術(shù)的實(shí)例和說明見于Berger and Kimmel, Guide to Molecular CloningTechniques,Methods in Enzymology152Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger);Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.)Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook etal.);Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., eds., CurrentProtocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.and Johnffiley&Sons, Inc., (1994Supplement) (Ausubel) ; Cashion et al.,美國專利 5，017，478;和Carr，歐洲專利0，246，864。足以指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)的實(shí)例見于 Berger, Sambrook, and Ausubel,以及 Mullis et al., (1987)美國專利 4，683，202;PCRProtocols A Guide to Methods and Applications(Innis et al., eds)Academic PressInc.San Diego,Calif.(1990)(Innis);Amheim&Levinson(Oct.1.1990)C&EN36-47;TheJournal Of NIH Research(1991)3:81-94; (Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173;Guatelli et al.(1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87, 1874;LomelI etal.(1989)J.Clin.Chem., 35:1826;Landegren et al., (1988)Science241:1077-1080;VanBrunt (1990)Biotechnology8:291-294;Wu and Wallace(1989)Gene4:560;和 Barringeret al.(1990)Gene89:117。編碼本發(fā)明PAD多肽的核酸或這些核酸的亞序列可通過任何上述適宜方法制備，包括例如克隆和限制適宜序列。
[0129]編碼PAD多肽的核酸可隨后通過利用載體、質(zhì)?；驑?gòu)建體等引入原核或真核宿主細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明的PAD多肽。常見的表達(dá)盒含有可操作連接于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或其他目的酶的核酸的啟動子。表達(dá)盒通常包括可引入適宜宿主細(xì)胞的表達(dá)載體，包括例如細(xì)菌、昆蟲、真菌、植物或動物細(xì)胞。構(gòu)成型或受調(diào)節(jié)的啟動子均可用于本發(fā)明。本發(fā)明的表達(dá)載體可通過已知技術(shù)轉(zhuǎn)入所選細(xì)胞，包括例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，縮并(transvection),顯微注射，陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔,轉(zhuǎn)導(dǎo),劃痕(scrapeloading),基因槍注射(ballistic introduction),感染或其他方法。(見 MoleculeCloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol.1-3, ed.Sambrook et al., Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989))。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可通過例如質(zhì)粒中所含基因顯示的抗生素抗性來選擇，所述基因諸如amp, gpt, neo和hyg基因。
[0130]PAD多肽類似物，片段或其他衍生物或其變體或表達(dá)它的細(xì)胞可用作抗原制備抗體。本發(fā)明包括例如單克隆和多克隆抗體，嵌合、單鏈以及Fab片段。因此，本發(fā)明也包括產(chǎn)生針對一或多個上述的PAD多肽的方法，包括提供PAD多肽或其生物學(xué)功能類似物或衍生物或變體，將多肽以有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的量給予動物對象產(chǎn)生抗PAD多肽的抗體。因此，本發(fā)明包括產(chǎn)生PRRSV的保護(hù)性抗原決定子(PAD)的抗體的方法，包括給予豬第一 GP5-M異源二聚體，其中所述第一 GP5-M異源二聚體的GP5具有在北美(NA)PRSSV毒株的位置44的糖基化或歐洲(EU) PRRSV毒株的位置46的糖基化。所述方法還包括給予豬第二 GP5-M異源二聚體，其中所述第二 GP5-M異源二聚體的GP5不具有在北美(NA)PRSSV毒株的位置44或歐洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化。本發(fā)明人還認(rèn)為NA和EUPRRSV中的氨基酸51和53對于用作PAD是重要的，并相信它們參與病毒粘附以及VN抗體可與其反應(yīng)。本發(fā)明的PAD可根據(jù)本文所述的免疫方案給予。本發(fā)明另一方面中，動物可為非人動物，例如，大鼠，馬，牛，小鼠，豬， 羊，兔或雞。
[0131]因此，本發(fā)明提供選擇性結(jié)合PAD多肽，其衍生物、類似物或變體以及片段的抗體。所述抗體可用于定量或定性檢測上文所述的PAD多肽或變體。
[0132]已知許多方法可產(chǎn)生和/或鑒定針對給定肽的抗體，諸如PAD多肽。數(shù)種所述方法描述于 Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, (1989)?？墒褂萌L PAD 多妝，衍生物，類似物或抗體或片段或融合蛋白。
[0133]為了制備單克隆抗體，可使用任何已知通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)提供抗體的技術(shù)。實(shí)例包括各種技術(shù)，見諸如 Kohler, G.and Milstein, C., Nature256:495-497 (1975) ; Kozboret al., Immunology Today4:72(1983);(Cole et al., pg.77-96, Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc.(1985)。單克隆抗體可通過雜交瘤制備,其為能分泌特定單克隆抗體的不朽細(xì)胞系。所述不朽細(xì)胞系通過融合兩個不同的細(xì)胞類型，通常是淋巴細(xì)胞，其中一種是腫瘤細(xì)胞來在體外產(chǎn)生。[0134]抗PAD抗體包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。多克隆抗體可在哺乳動物中激發(fā)，例如通過免疫劑以及如果需要還可加上佐劑的一或多次注射來進(jìn)行。通常，免疫劑和/或佐劑將通過多次皮下或腹腔內(nèi)注射而注射入哺乳動物中。所述免疫劑可包括PAD多肽，衍生物，類似物或變體以及片段或其融合蛋白?？蓪⒚庖邉┖鸵阎诒幻庖叩牟溉閯游镏芯哂兄旅庖咝缘牡鞍走B接。所述致免疫性蛋白包括但不限于匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin),血清白蛋白，牛胸腺球蛋白，以及大豆胰蛋白酶抑制物。可用佐劑的實(shí)例包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酸脂質(zhì)A，合成海藻糖(trehalose) dicorynomycolate)。免疫方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇而無需過多試驗(yàn)。
[0135]另一個實(shí)施方案中，提供制備抗PRRSV疫苗的方法。一方面，所述方法包括提供PAD多肽，其衍生物，類似物，變體或片段?？蛇x，制備抗PRRSV疫苗的方法包括將PAD多肽與生理可接受載體或稀釋劑混合。通常，疫苗作為可注射水溶液或混懸液來制備。油性基質(zhì)中的疫苗也可用于諸如吸入。也可配制可在使用前溶解或懸浮的固體形式。通?？杉尤肱c活性成分相容并可藥用的藥學(xué)或生理學(xué)載體。所述載體的實(shí)例包括但不限于，水，鹽水，葡萄糖或甘油。也可使用載體的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載體或稀釋劑。
[0136]本發(fā)明還提供疫苗。另一個實(shí)施方案中，提供了這樣的疫苗，其包含至少一種PAD多肽，其衍生物，類似物，變體或片段。另一方面，所述疫苗包括編碼PAD多肽的核酸，其衍生物，類似物，變體或片段.[0137]本發(fā)明提供了這樣的疫苗，其為殺死的疫苗(滅活的疫苗)，減毒疫苗(經(jīng)修飾的活疫苗)，亞單位疫苗，DNA疫苗或基于重組病毒的疫苗。本發(fā)明另一方面提供了疫苗用于保護(hù)豬對抗PRRSV感染導(dǎo)致的疾病。本發(fā)明的疫苗通常用于預(yù)防性治療，其免疫豬對抗PRRSV毒性毒株引起的疾病。但是，所述疫苗也用于治病性治療已經(jīng)感染了 PRRSV毒性毒株的豬。
[0138]本發(fā)明人認(rèn)為PRRSV治療和預(yù)防基于與目前的疫苗策略完全不同的理論，例如涉及與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力(CMI)和/或病毒中和(VN)抗體。本發(fā)明人相信PRRSV具有“聚糖屏蔽”，其阻斷或屏蔽中和表位(NE)。該屏蔽避免了識別有天冬酰胺天冬酰胺連接的聚糖或其他聚糖部分的關(guān)鍵中和表位造成的體液免疫反應(yīng)，使得中和表位不能產(chǎn)生中和抗體。本發(fā)明人還相信PRRSV在一些情況中具有NE阻斷聚糖(圖17)。宿主“種跳躍(speciesjump)”見于RNA病毒的情況下，抗NE中和抗體(Nab)可容易的誘導(dǎo)(圖16)。這些第一“種跳躍”系列(train)在阻斷或屏蔽位置不具有聚糖，可通過抗NE Nab輕易消除。[0139]由于新宿主種類受到感染或出現(xiàn)類似的種(quasispecies)，Ne被與NE直接相鄰的聚糖(保守區(qū)域)阻斷(BNE)(圖17)，例如圖10中HLV013的序列。因此，Nab是針對BNE產(chǎn)生的。聚糖屏蔽(SNE)在出現(xiàn)的準(zhǔn)種中在臨近Ne的高變區(qū)出現(xiàn)。因此，Nab的出現(xiàn)可較慢和/或針對含有BNE和SNE逃跑突變體無效(圖19)。[0140]只有聚糖屏蔽存在例如罕見野生型突變體時，則誘導(dǎo)抗NE的Nab (圖19)，例如HLV093。見圖11。該Nab僅僅提供對抗具有聚糖屏蔽的毒株的保護(hù)作用。因此，僅僅具有聚糖屏蔽的毒株不能在易感宿主群體中保持。這些不具有聚糖屏蔽(BNE[圖17]，然后是NE[圖18])野生型突變體的連續(xù)免疫導(dǎo)致多克隆Nab，其保護(hù)對抗出現(xiàn)的優(yōu)勢型異源病毒毒株并提供交叉反應(yīng)性(圖19)。
[0141]因此，病毒首先形成聚糖阻斷，然后形成聚糖屏蔽(圖19)。異源Nab可通過第一次接種不具有聚糖屏蔽的聚糖封閉的表位(BNE)然后接種不具有聚糖封閉的NE來制備，該方法稱為反向表位發(fā)展免疫法(reversed epitope evolution immunization) ?
[0142]因此,本發(fā)明人相信豬第一次暴露于PRRSV毒株并隨后暴露于不同的在GP5的高變細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中糖基化程度更高的PRRSV毒株的情況下，豬的免疫系統(tǒng)僅僅識別中和表位中GP5和M上的非糖基化區(qū)域以及血清型之間的共同表位。結(jié)果，免疫系統(tǒng)不能識別PRRSV上的新的糖基化表位，導(dǎo)致無效免疫。
[0143]本發(fā)明人首先認(rèn)識到這一理論可被開發(fā)用于開發(fā)和給予單個或多價PRRSV疫苗以及利用PRRSV同種型的聚糖分型的PRRSV免疫方案。因此，PRRSV的糖基化模式(聚糖類型)可用于PRRSV毒株的初始分組。
[0144]根據(jù)本發(fā)明，北美和歐洲基因型的PRRSV毒株根據(jù)其糖基化模式分組。本發(fā)明被發(fā)明人稱作聚糖分型方案。與0RF5的序列同源性相比，聚糖分型是分辨異源PRRSV毒株作為出現(xiàn)在群體中的新的毒株的更為精確的方法。本發(fā)明人認(rèn)為糖基化模式的區(qū)分可用于單個或多價疫苗中或免疫接種方案和方法的開發(fā)中。一方面，毒株可根據(jù)它們是否是歐洲或北美毒株來分型。PRRSV毒株分型的一方面，第一個字母是EU (歐洲樣)或NA(北美樣)來命名基因型簇。EU指PRRSV同種型，特征是在GP5中46和/或53位具有保守聚糖。NA指這樣的PRRSV同種型，特征是在GPOTI44和/或51位具有保守聚糖。每個毒株的編號對應(yīng)表7所示GP5氨基酸序列細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中糖基化位點(diǎn)的數(shù)目，但除外了位于NA毒株的aa44和51以及EU毒株的aa46和53的高度保守的聚糖。因此，NA-O指不具有聚糖的NA毒株GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，EU-O指不具有聚糖的EU毒株GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。例如，NA-1指除NA毒株aa44和51的高度保守聚糖之外，具有位于GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的I個聚糖的NA毒株GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
[0145]本發(fā)明還涉及新鑒定的PRRSV毒株，可利用上述方法根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行聚糖分型。發(fā)明人認(rèn)為本文的聚糖分型方案可用于治療或預(yù)防其他利用“聚糖屏蔽”逃避免疫系統(tǒng)的病毒，例如用于設(shè)計免疫策略。新的或已知的PRRSV毒株也可利用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和已知方法從野外分離。
[0146]根據(jù)本發(fā)明，毒性或非毒性PRRSV可用于疫苗中或免疫方案中。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)給藥具有位于GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的N糖基化具體是位置44 (或46)(所述位置根據(jù)GP5類似GP5-M異源二聚體中的北美或歐洲PRRSV而不同)的聚糖的PRRS病毒毒株來免疫豬能激發(fā)豬的免疫系統(tǒng)，并且當(dāng)隨后給予不具有GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的糖基化氨基酸的PRRSV毒株并隨后用具有位于GP5多肽細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的糖基化的PRRSV攻擊時可激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。見表6。這是由于GP5高變區(qū)中的聚糖可抑制/延遲保護(hù)性抗PAD抗體反應(yīng)的事實(shí)。此外，缺乏位置44的聚糖導(dǎo)致抗病毒異源毒株的保護(hù)作用。例如，在GP5的中和表位中缺乏聚糖的毒株諸如HLV093可用于在遭遇PRRSV的其他聚糖類型之前激發(fā)免疫反應(yīng)。例如，GP5中高變區(qū)(1-37)缺乏聚糖的毒株諸如HLV013可用于在遭遇PRRSV的其他聚糖類型之前激發(fā)免疫系統(tǒng)。
[0147]抗PRRSV感染的免疫方案的一個方面，給藥具有本發(fā)明PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD的病毒，所述PAD具有位于歐洲毒株GP5位置46的糖基化，然后給藥具有本發(fā)明PRRSV GP5-M異源二聚體的PAD，所述PAD不具有位于北美毒株GP5位置44的糖基化，然后用在GP5的中和表位中糖基化的PRRSV攻擊。
[0148]另一方面，給藥具有本發(fā)明PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD的病毒，所述PAD具有位于歐洲毒株GP5位置46的糖基化，然后給藥具有本發(fā)明PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD的病毒，所述PAD不具有位于歐洲GP5位置46的糖基化，然后用在GP5中和表位中糖基化的PRRSV毒株攻擊。
[0149]抗PRRSV感染的免疫方案的一個方面，給予包含本發(fā)明PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD，所述PAD具有位于北美毒株位置44的糖基化，然后給予包含本發(fā)明PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD，所述PAD不具有位于北美毒株位置44的糖基化，然后用在GP5中和表位中糖基化的PRRSV毒株攻擊。另一方面，給予包含本發(fā)明PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD，所述PAD具有位于歐洲毒株GP5的位置46的糖基化，然后給予包含本發(fā)明PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD，所述PAD不具有位于歐洲毒株GP5的位置46的糖基化，然后用在GP5中和表位中糖基化的PRRSV毒株攻擊。.[0150]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5的PAD不具有來自NA PRRSV GP5蛋白的氨基酸1_35中的聚糖。另一方面，GP5的PAD具有在NA PRRSV GP5蛋白位置44的聚糖。另一方面，GP5的PAD具有在NA PRRSV GP5蛋白位置44的聚糖，并在NA PRRSV GP5蛋白的氨基酸1_35中具有或不具有聚糖，例如，在一些NA PRRSV毒株中所見。
[0151]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5-M異源二聚體的PAD不具有在NA PRRSV GP5蛋白的氨基酸1-35中的聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有在NA PRRSV GP5蛋白位置44的聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有在NA PRRSV GP5蛋白位置44的聚糖，并在NA PRRSV GP5蛋白的氨基酸1-35中具有或不具有聚糖，例如，在一些NA PRRSV毒株中所見。
[0152]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5的PAD不具有在EU PRRSV GP5蛋白的氨基酸1_37中的聚糖，例如在Lelystad中所見。另一方面，GP5的PAD具有在EU PRRSV GP5蛋白位置46的聚糖。另一方面，GP5的PAD具有在EU PRRSV GP5蛋白位置46的聚糖，并在EU PRRSVGP5蛋白的氨基酸1-37中具有或不具有聚糖，例如，一些EU PRRSV毒株中所見。
[0153]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5-M異源二聚體的PAD不具有在EUPRRSV GP5蛋白的氨基酸1-37中的聚糖，例如在Lelystad中所見。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有在EU PRRSV GP5蛋白位置46的聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有在EU PRRSVGP5蛋白位置46的聚糖，并在EU PRRSV GP5蛋白的氨基酸1_37中具有或不具有聚糖，例如，一些EU PRRSV毒株中所見。[0154]本發(fā)明的抗PRRSV免疫方法的優(yōu)勢在于其導(dǎo)致在用提供異源反應(yīng)性的PRRSV各種毒株攻擊時，高水平中和抗體在早期抗體反應(yīng)中出現(xiàn)。本發(fā)明的免疫策略可用于治療和預(yù)防其他病毒感染，包括但不限于HIV和流感病毒。
[0155]因此，包含并類似HLV013的毒株可提供抗所有其他聚糖類型的直接保護(hù)或不提供抗所有其他聚糖類型的直接保護(hù)而是提供使得免疫系統(tǒng)準(zhǔn)備好從而持續(xù)對抗具有不同程度聚糖屏蔽的PRRSV PAD的間接保護(hù)。反之，隨后接種不同毒株的PAD，所述PAD與HLV093的PAD在GP5高變區(qū)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的糖基化相似，從而可獲得所有PRRSV毒株中的重要中和表位，諸如在GP5高變區(qū)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中糖基化程度更高的那些。由此，PRRSV的聚糖分型導(dǎo)致PRRSV給藥的分級或次序或組合，其可有效產(chǎn)生對多種PRRSV的免疫應(yīng)答。本發(fā)明一方面，需要多種GP5-M異源二聚體(聚糖類型)是以誘導(dǎo)抗多種PRRSV毒株的廣泛保護(hù)作用。
[0156]不希望受任何理論束縛，本發(fā)明人相信所有顯示GP5不同聚糖類型的免疫原可一同給予，這是由于“原始抗原罪孽(original antigenic sin) ”(OAS)的概念導(dǎo)致的,其中針對第二病毒感染激發(fā)的抗體反應(yīng)與原始變體感染相比其反應(yīng)更強(qiáng)。因此，發(fā)明人認(rèn)為豬的免疫系統(tǒng)可利用單個PAD激發(fā)或利用多個PAD免疫獲得與前者相比更廣的并且反應(yīng)性更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。多價疫苗策略的應(yīng)用避免了原始抗原罪孽。因此，本發(fā)明中，可同時或連續(xù)給予多個PRRSV毒株或PAD。為治療PRRSV或誘導(dǎo)抗PAD所有表位的保護(hù)性抗體，豬需要暴露于多個GP5，M，或GP5-M異源二聚體聚糖類型。
[0157]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，提供了鑒定激發(fā)抗PRRSV保護(hù)作用的GP5-M異源二聚體的方法。該方法也包括GP5和M蛋白或GP5-M異源二聚體的片段、衍生物或類似物。一方面，本發(fā)明包括給予受試豬第一 GP5-M異源二聚體，其中GP5具有在北美(NA) PRSSV毒株的位置44的糖基化或歐洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化。給予受試豬第一 GP5-M異源二聚體之后給予第二 GP5-M異源二聚體，其中所述第二 GP5-M異源二聚體的GP5不具有在北美(NA)PRSSV毒株的位置44或歐洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化。受試豬和對照豬隨后用感染量的致PRRS病毒例如Lelystad攻擊。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉致PRRS毒株以及實(shí)現(xiàn)感染的途徑和所需劑量。該方法包括測定第一和第二給藥的GP5-M異源二聚體是否有效保護(hù)豬對抗攻擊PRRSV。
[0158]確定GP5-M異源二聚體是否提供抗PRRSV保護(hù)的各種方法和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于觀察受試豬和對照豬PRRS癥狀的差異，例如PRRS臨床表征或癥狀，包括體重下降，體重增加減少，嗜眠癥，呼吸窘迫，“喘粗氣”(呼氣費(fèi)力)，發(fā)熱，皮毛粗糙，打噴嚏，咳嗽，眼睛水腫結(jié)膜炎，宏觀病變微觀肺病變，心肌炎，淋巴腺炎，腦炎和鼻炎。受試豬中觀察到與對照豬相比PRRS癥狀的任何降低表明第一和第二給藥的GP5-M異源二聚體提供一定程度的抗PRRS保護(hù)。與對照豬中的情況相比，受試豬中觀察到的類似癥狀或任何PRRS癥狀的增加表明第一和第二給藥的GP5-M異源二聚體沒有提供一定程度的抗PRRS保護(hù)。 [0159]另一方面，確定GP5-M異源二聚體是否提供抗PRRSV感染的保護(hù)作用包括確定攻擊PRRSV在受試豬中的存在或缺失，這可通過電子顯微鏡或抗體或測定法諸如熒光聚焦中和(FFN)檢測或Western印跡測定法進(jìn)行，因?yàn)楫愒炊垠w可用于表明異源抗體產(chǎn)生和保護(hù)。攻擊PRRSV的存在表明第一和第二給藥的GP5-M異源二聚體不能提供有效抗PRRS保護(hù)，攻擊PRRSV的缺失表明第一和第二給藥的GP5-M異源二聚體提供有效抗PRRS保護(hù)。[0160]本發(fā)明的GP5-M異源二聚體可利用各種載體和病毒遞送，例如，PRRSV。因此，本發(fā)明另一方面包括鑒定激發(fā)抗PRRSV保護(hù)的病毒。這些鑒定的GP5-M異源二聚體或病毒可用于PRRSV免疫方案或疫苗中。例如，可給予豬包含在GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中糖基化的GP5-M異源二聚體的PRRSV，所述糖基化具體是NA PRRSV位置44的糖基化或EU PRRSV位置46的糖基化。該方法也包括給予在GP5位置44或46不具有糖基化的氨基酸的NA或EU PRRSV毒株。為確定這些病毒是否提供保護(hù)，給予這些“受試”病毒的豬可用PRRSV或任何致PRRS的病毒攻擊，并且觀察任何PRRS癥狀并與接受攻擊病毒的對照豬比較以確定“受試”病毒是否提供PRRSV保護(hù)作用。[0161]另一方面，本發(fā)明的方法包括鑒定激發(fā)抗PRRSV的保護(hù)作用的病毒或PAD的方法，所述病毒或PAD用于下述免疫方案或疫苗中:給予GP5片段，衍生物或類似物，所述GP5具有北美(NA)PRSSV毒株的位置44的糖基化或具有歐洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化，并作為異源二聚體例如與PRRSV M蛋白的異源二聚體，隨后給予不具有北美(NA)PRSSV毒株的位置44或歐洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化的GP5異源二聚體。為確定這些PAD是否提供保護(hù)，給予這些“受試” PAD的豬可用PRRSV或任何致PRRS的病毒攻擊，并且觀察到任何PRRS癥狀并與接受攻擊病毒的對照豬比較以確定“受試”PAD是否提供PRRSV保護(hù)作用。保護(hù)作用可利用死亡率和病死率確定。
[0162]發(fā)明人認(rèn)為任何殺死的(滅活的)PRRSV,減毒的(修飾的活)PRRSV,亞基，DNA或基于重組載體的、具有GP5，M,或GP5-M異源二聚體的任何組合可被聚糖分型并用于漸進(jìn)性、連續(xù)或組合免疫方案或策略。一方面，所述免疫方案或策略誘導(dǎo)PAD抗體。
[0163]本發(fā)明人認(rèn)為歐洲樣PRRSV毒株可類似進(jìn)行聚糖分型(表7)并用于針對美國樣PRRSV的對豬的免疫方案中。
[0164]本發(fā)明一個PRRS疫苗的實(shí)施方案包括減毒的PRRS疫苗，其具有GP5，M,或GP5-M異源二聚體。減毒的毒株誘導(dǎo)PRRS相關(guān)疾病的性質(zhì)在病毒是活減毒的病毒時明顯降低或完全喪失。因此，需要具體的活PRRSV疫苗，其包含這樣的減毒PRRSV毒株，產(chǎn)生抗減毒PRRSV毒株的GP5-M的GP5，M,或異源二聚體的免疫反應(yīng)而不導(dǎo)致疾病。
[0165]制備減毒病毒的方法是本領(lǐng)域已知的，包括連續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)物上在適合細(xì)胞系上連續(xù)傳代或化學(xué)誘變。例如，減毒PRRSV變體可在細(xì)胞系上通過病毒連續(xù)例如Marc 145, CL2621, MA-104細(xì)胞或豬肺泡巨噬細(xì)胞傳代制備大約10-100代，使得突變累積從而使得病毒減毒。連續(xù)傳代指用病毒分離株感染細(xì)胞系，從宿主細(xì)胞回收病毒子代，隨后用病毒子代感染宿主細(xì)胞產(chǎn)生下一代。在細(xì)胞系上傳代的過程中，病毒喪失在豬中導(dǎo)致疾病的能力，例如變成無致病性或非致病性病毒，但保持在豬中復(fù)制并產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的能力。
[0166]因此，為了制備疫苗，減毒PRRSV分離株在適宜細(xì)胞系即Marcl45，CL2621或MA-104細(xì)胞上在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長到足以產(chǎn)生疫苗的效價。PRRSV根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，病毒可從細(xì)胞培養(yǎng)物取出，并從細(xì)胞成分分離，通常通過常見澄清化步驟，例如離心，并隨后根據(jù)需要利用本領(lǐng)域常用方法純化。PRRSV隨后可被濃縮，冷凍并保存在_70°C或在4°C凍干并保存。
[0167]減毒病毒的分離后可分析其基因組序列確定減毒表型的基礎(chǔ)。這可通過測序病毒DNA并鑒定減毒分離株相對于對照病毒基因組序列的核苷酸改變來進(jìn)行。因此，使得毒性PRRSV毒株減毒的分子改變得以表征。
[0168]本發(fā)明的一個實(shí)施方案包括將任何位置的序列改變單獨(dú)或組合引入以在已知PRRSV毒株中或其他待鑒定和分離的毒株中產(chǎn)生減毒病毒子代。具有所述改變的病毒基因組可通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于將核苷酸改變引入克隆的DNA的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA 技術(shù)來制備(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Associates&ffiley Interscience, New York, 1989) ? 隨后可將基因組連接入適宜載體，所述載體被轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生病毒子代。
[0169]疫苗前的PRRSV可混合成包含適當(dāng)劑量并包括可藥用的載體，諸如鹽水和/或佐劑，諸如氫氧化鋁。因此，本發(fā)明的PRRSV可包括免疫原有效量的一或多種本發(fā)明所述的PRRSV。 [0170]減毒病毒組合物可利用生理可接受的載體和/或佐劑引入豬中。有用的載體是本領(lǐng)域已知的，包括例如水，緩沖水，鹽水，甘氨酸，透明質(zhì)酸等。產(chǎn)生的水溶液可包裝后使用或凍干后使用，凍干制備物在給藥之前可重新水化，如上所述。所述組合物可包含實(shí)現(xiàn)適當(dāng)生理?xiàng)l件所需的可藥用輔助物質(zhì)，諸如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑，張力調(diào)節(jié)劑，濕潤劑等，例如乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，山梨聚糖單月桂酸酯，三乙酰胺油酸酯等。
[0171]本文公開的活減毒病毒的給藥可通過任何適宜方法進(jìn)行，包括胃腸外注射(諸如腹腔內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射)，或?qū)⒉《揪植繎?yīng)用(通常在藥物配制劑中)到氣道表面。將病毒局部給藥氣道表面可通過鼻內(nèi)給藥(例如利用滴管，藥簽，或吸入器，其將藥物配制劑沉淀在鼻內(nèi))。將病毒給藥氣道的局部應(yīng)用可通過吸入給藥進(jìn)行，諸如產(chǎn)生藥物配制劑的可吸入顆粒(包括固體顆粒和液體顆粒)，所述顆粒含有病毒，作為氣溶膠懸液，并使得對象吸入可吸入顆粒。給藥藥物配制劑的可吸入顆粒的方法和工具是本領(lǐng)域已知的，可采用常規(guī)技術(shù)。接種之后，宿主至少部分或完全對所給予血清型的PRRSV感染具有免疫力，或?qū)φ诔霈F(xiàn)的輕度或中度PRRSV感染具有抗性。
[0172]另一個實(shí)施方案中，一種具體的具有上文所述的所需PAD的毒株的減毒PRRSV可與具有上文所述所需PAD的PRRSV其他毒株的減毒病毒組合，獲得抗多PRRSV的保護(hù)作用。根據(jù)本發(fā)明，不同PRRSV可連續(xù)給藥或漸進(jìn)性給藥或可選在混合物中同時給藥。本發(fā)明疫苗組合物的連續(xù)或漸進(jìn)性給藥是激發(fā)足夠水平的抗多種PRRSV毒株免疫力所需的?？蓡未位蚨啻谓o藥本發(fā)明的疫苗組合物。多次給藥是激發(fā)足夠免疫水平所需的。誘導(dǎo)的免疫力的水平可通過測定中和型分泌和血清抗體的量來監(jiān)測，調(diào)節(jié)的劑量或重復(fù)接種是保持所需保護(hù)水平所需的。減毒毒株誘導(dǎo)PRRS相關(guān)疾病的性質(zhì)如上所述在毒株是滅活形式時明顯降低或完全喪失。
[0173]根據(jù)本發(fā)明，PRRSV疫苗的一個實(shí)施方案包括滅活的(殺死的)、具有GP5，M，或GP5-M蛋白異源二聚體的PRRSV。上文所述滅活毒株誘導(dǎo)PRRS相關(guān)疾病的性質(zhì)在毒株是滅活(殺死)的情況下明顯降低或完全缺失。PRRSV毒株的滅活可通過多種方法實(shí)現(xiàn)，包括冷凍-干燥，化學(xué)處理(例如利用噻汞撒或福爾馬林)，超聲處理，輻照，加熱或其他足以防止病毒復(fù)制或生長同時保持PRRSV的毒株的免疫原性的方法。
[0174]滅活的疫苗通過本領(lǐng)域已知方法制備。例如，一旦毒株擴(kuò)增到高效價，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見病毒抗原物質(zhì)可通過本領(lǐng)域已知方法獲得。例如，PRRSV抗原物質(zhì)可通過稀釋、濃縮或提取獲得。PRRSV可通過利用福爾馬林或利用二乙烯亞胺(BEI)處理來滅活，兩種方法都是本領(lǐng)域已知的。例如，利用福爾馬林滅活PRRSV毒株可通過將PRRSV懸液與37%甲醛混合到甲醛的最終濃度為0.05%來進(jìn)行。PRRSV-甲醛混合物可通過恒速在室溫攪拌大約24小時來混合。隨后通過檢測適宜細(xì)胞系例如，Marc 145, CL2621或MA-104細(xì)胞上的生長來檢測滅活的PRRSV混合物中殘余的活病毒。
[0175]通過BEI滅活PRRSV可通過例如將本發(fā)明的PRRSV懸液與0.1M BEI (2-溴代-乙胺，在0.175N NaOH中)混合到BEI的最終濃度為ImM來進(jìn)行。PRRSV_bei混合物可通過恒速在室溫攪拌大約48小時來混合，然后加入1.0M硫代硫酸鈉到終濃度0.1mM。再混合2小時。隨后通過檢測適宜細(xì)胞系例如，Marc 145細(xì)胞上的生長來檢測滅活的PRRSV混合物中殘余的活病毒。本發(fā)明前述的滅活的PRRSV可與任何用于配置滅活病毒疫苗到適宜劑量水平的可藥用佐劑或生理載體混合。殺死的PRRSV疫苗的適宜配制劑和給藥模式的描述如下。
[0176]—個實(shí)施方案中，本發(fā)明的PRRSV疫苗可為亞單位疫苗。一方面，所述亞基可為PRRSV的GP5，M，或GP5-M異源二聚體。病毒亞基可利用生化方法得自PRRSV，或其可通過適宜細(xì)胞中的重組手段來表達(dá)。例如，表達(dá)病毒亞基的方法描述在以下參考文獻(xiàn)中:Possee,1986，Virus research5:43;Kuroda et al.,.1986, EMBOJ.5:1359;Doerfler, 1986, Curr.Topics Microbiol.Tmmunol.131:51;Rigby, 1983, J.Gen.Virol.64:255;Mackett et al., 1985, In:DNA Cloning, A Practical Approach, VolII, Ed.D.M.Glover, IRL Press, Washington, D.C.;Rothestein, 1985, In:DNA Cloning, APractical Approach, Supra;Kinney et al., 1988, J.Gen.Virol.69:3005;Panical etal.,1983, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:5364;Small et al.，1985，In:Vaccinia Virusesas Vectors for Vaccine Antigens, pp.175-178，Ed.J.Quinnan, Elsevier, N.Y0
[0177]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5, Μ,或GP5-M異源二聚體亞基可通過重組技術(shù)以足以用于亞單位疫苗的水平大量在體外制備。
[0178]另一方面，GP5，M,或GP5-M異源二聚體亞基可通過重組載體、病毒載體或病毒表達(dá)。另一方面，表達(dá)所述亞基的重組載體、病毒載體或病毒本身可作為疫苗組分來作為抗原或佐劑并激發(fā)或增強(qiáng)豬對GP5，M,或單獨(dú)的GP5-M蛋白異源二聚體的免疫反應(yīng)。
[0179]本發(fā)明另一個實(shí)施方案中，所述疫苗包括含有編碼來自PRRSV毒株的抗原GP5，M，或GP5-M異源二聚體或其免疫原性片段的核酸的重組病毒載體。適宜重組病毒載體包括但不限于:活腺病毒、痘病毒，桿狀病毒，偽狂犬病病毒(PRV)，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)載體諸如毒株V3526或TC-83，以及來自VEE的病毒復(fù)制子顆粒(VRP)，馬動脈炎病毒(EAV)，或傳染性胃腸炎病毒(TGE)。
[0180]本發(fā)明的重組病毒還可包含GP5，M，或GP5-M異源二聚體亞基中一種聚糖類型的多個拷貝。可選，重組病毒可包含一個以上GP5，M，或GP5-M異源二聚體亞基聚糖類型，從而該病毒可表達(dá)兩或多種不同GP5，M，或GP5-M異源二聚體亞基。一方面，GP5，M，或GP5-M異源二聚體亞基在GP5蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的糖基化方面不同。
[0181]為構(gòu)建本發(fā)明的病毒載體，優(yōu)選將GP5，M，或GP5-M蛋白異源二聚體亞基序列插入病毒毒株中并處于病毒自身的表達(dá)控制序列控制下。將GP5，M，或GP5-M異源二聚體亞基序列插入病毒載體并在病毒DNA中進(jìn)行改變例如以的插入連接序列等技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見例如 T.Maniatis et al, "Molecular Cloning.A Laboratory Manual", ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982)。因此，根據(jù)本發(fā)明，用于表達(dá)GP5，M，或GP5-M異源二聚體亞基蛋白的適宜病毒表達(dá)載體的構(gòu)建是本領(lǐng)域已知的。上文所述的重組病毒本身可直接用作疫苗組分。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，包含GP5，M，或GP5-M異源二聚體亞基的重組病毒直接通過接種引入受體豬。重組病毒在直接引入受體豬時，感染豬的細(xì)胞并在豬的細(xì)胞中產(chǎn)生GP5，M,或GP5-M異源二聚體亞基。[0182]為了制備表達(dá)GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的重組病毒載體，編碼GP5，M,或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的cDNA被插入病毒基因組，例如活腺病毒、痘病毒，桿狀病毒，偽狂犬病病毒(PRV)，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)載體諸如毒株V3526或TC-83，以及來自VEE的病毒復(fù)制子顆粒(VRP)，馬動脈炎病毒(EAV)，或傳染性胃腸炎病毒(TGE)。重組病毒載體可通過任何已知標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備(Ausubel etal., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates&ffileyInterscience, New York, 1989),用于將核苷酸改變引入克隆的DNA。病毒基因組可與適宜載體連接用于轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中產(chǎn)生病毒子代。
[0183]對于任何前述重組病毒載體，編碼GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的cDNA與真核啟動子可操作連接，在編碼抗原和真核細(xì)胞終止信號以及poly (A)信號的cDNA的5’末端、在編碼抗原的cDNA的3’末端。本發(fā)明中，“可操作連接”指本發(fā)明的多核苷酸(如cDNA分子)和含有表達(dá)控制序列(DNA)例如轉(zhuǎn)錄啟動子和終止序列的多核苷酸，其位于載體或細(xì)胞中從而cDNA編碼的抗原通過表達(dá)控制序列調(diào)節(jié)。克隆DNA諸如編碼GP5, M,或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的cDNA并將包含表達(dá)控制序列的DNA與其可操作連接的方法是已知的。適合表達(dá)編碼GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的啟動子的實(shí)例在重組病毒載體中是巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動子，Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)(RSV-LTR)啟動子，猿病毒40(SV40)立即早期啟動子，以及可誘導(dǎo)啟動子諸如金屬硫蛋白啟動子。具有終止信號和poly (A)信號的DNA的實(shí)例是SV40晚期poly (A)區(qū)。適合制備抗原的病毒表達(dá)系統(tǒng)的另一實(shí)例是Sindbis表達(dá)系統(tǒng),其可得自Invitrogen。這些商業(yè)可得的表達(dá)載體和系統(tǒng)的使用是本領(lǐng)域已知的。
[0184]本發(fā)明另一實(shí)施方案中，將疫苗提供作為核酸或DNA分子疫苗，其激發(fā)豬中的活性免疫反應(yīng)。DNA分子疫苗由具有編碼GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的核酸分子的DNA組成。編碼GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的核酸在GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子的起始密碼子或其附近與啟動子可操作連接，使得當(dāng)核酸接種到豬的細(xì)胞中能從核酸轉(zhuǎn)錄GP5，M,或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段。優(yōu)選，DNA分子是質(zhì)粒。可用于DNA疫苗的啟動子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于RSVLTR啟動子，CMV立即早期啟動子，以及SV40T抗原啟動子。一方面，核酸在編碼GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的序列的終止密碼子或其附近可操作連接于包含轉(zhuǎn)錄終止序列和poly (A)識別信號的核酸片段?？稍诳山邮艿乃幬镙d體或脂質(zhì)或脂質(zhì)體載體中提供所述DNA疫苗，類似Feigner的美國專利5，589，466和5，580, 859所述那樣。最后，制備藥物級質(zhì)粒DNA的方法在Marquet et al.的美國專利5，561，064中教導(dǎo)。
[0185]因此，利用包含上文所述的任何適宜方法，表達(dá)GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的DNA疫苗可用于免疫豬對抗PRRSV。DNA疫苗的一個優(yōu)勢是DNA分子通常作為質(zhì)粒擴(kuò)增，這是制備疫苗的簡單且不昂貴的方法，由于疫苗并非活疫苗，與活重組病毒載體疫苗縣官許多調(diào)節(jié)問題與DNA疫苗無關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的DNA疫苗可包括合成制備的核酸，其通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成方法制備。
[0186]本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所述疫苗由分離的或純化的GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段組成。優(yōu)選，GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段在重組細(xì)菌或真核細(xì)胞表達(dá)載體中制備，產(chǎn)生被分離并純化用于制備疫苗的抗原。例如，GP5, M,或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段可在以下細(xì)胞中制備:微生物諸如細(xì)菌、酵母或真菌；真核細(xì)胞諸如哺乳動物或昆蟲細(xì)胞；或在重組病毒載體諸如腺病毒，痘病毒，皰疹病毒,Simliki森林病毒，桿狀病毒，細(xì)菌曬菌體，sindbis病毒，仙臺病毒，或委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)載體諸如毒株V3526或TC-83，以及來自以下病毒的病毒復(fù)制子顆粒(VRPs):VEE,馬動脈炎病毒(EAV)，或傳染性胃腸炎病毒(TGE)。適合制備GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的適宜細(xì)菌包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，以及任何其他能表達(dá)異源多肽的酵母菌。利用上述細(xì)菌、重組病毒載體、真核細(xì)胞產(chǎn)生用于疫苗中的抗原的方法是本領(lǐng)域已知的。 [0187]為制備由GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段組成的疫苗，編碼GP5, M,或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段的核酸在質(zhì)粒中，并且所述核酸可操作連接于影響GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段在微生物中表達(dá)的啟動子。適宜啟動子包括但不限于T7噬菌體啟動子，T3噬菌體啟動子，beta-半乳糖苷酶啟動子，以及Sp6噬菌體啟動子。GP5, M,或GP5-M異源二聚體抗原或其免疫原片段在微生物中的表達(dá)使得GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子可利用發(fā)酵技術(shù)制備，其在商業(yè)上用于制備大量重組抗原多肽。分離和純化抗原的方法是本領(lǐng)域已知的并包括諸如凝膠過濾，親和層析，離子交換層析或離心等方法。
[0188]為了有利于GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其免疫原片段的分離，制備融合多肽，其中GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其免疫原片段與另一多肽相連，所述多肽使得可通過親和層析分離。優(yōu)選，融合多肽可利用前述一種表達(dá)系統(tǒng)制備。例如，編碼GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其免疫原片段的cDNA核酸序列在5’或3’末端與編碼多肽的核酸相連。所述核酸可在適當(dāng)密碼子讀框中連接，從而產(chǎn)生融合蛋白，其中GP5，M,或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其一部分的氨基和/或羧基末端與允許作為融合多肽簡單回收抗原的多肽融合。
[0189]用于制備用于疫苗中的GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其免疫原片段的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合系統(tǒng)，其可得自AmershamPharmacia Biotech, Piscataway, N.J.,該系統(tǒng)利用 pGEX_4T_l 表達(dá)載體質(zhì)粒。編碼 GP5, M,或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其免疫原片段的cDNA在適當(dāng)密碼子讀框中與編碼GST的DNA融合。融合多肽的GST部分允許利用谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析快速純化融合多肽。純化之后，融合多肽的GST部分可通過利用位點(diǎn)特異性蛋白酶諸如凝血酶或因子Xa來切割來去除，產(chǎn)生不含GST多肽的抗原決定子。不含GST多肽的GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其免疫原片段可通過第二輪谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析產(chǎn)生。
[0190]制備包含GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其免疫原片段的疫苗的另一方法是將編碼抗原決定子的cDNA與編碼聚組氨酸的DNA密碼子框內(nèi)連接的方法。聚組氨酸優(yōu)選包含6個組氨酸殘基，其允許通過金屬親和層析優(yōu)選鎳親和層析來純化融合多肽。為制備不含聚組氨酸的GP5，M，或GP5-M異源二聚體抗原決定子或其免疫原片段，裂將解位點(diǎn)諸如腸激酶裂解位點(diǎn)融合在適當(dāng)讀框中在編碼聚組氨酸的密碼子和編碼抗體的密碼子之間。不含聚組氨酸的抗原通過利用腸激酶裂解來去除聚組氨酸而制備。不含組氨酸的抗原通過第二輪金屬親和層析結(jié)合游離聚組氨酸來制備。見Motin et al.1nfect.1mmun.64:4313-4318 (1996) ο 得自 Invitrogen, Carlsbad, California 的 Xpress System,是可商購的試劑盒，用于隨后分離聚組氨酸-多肽融合蛋白。
[0191]免疫原性組合物包括疫苗可通過在多種配制劑中制備，例如注射劑，溶液或乳化劑。免疫原例如GP5，M，或GP5-M異源二聚體可與與免疫原相容的可藥用賦形劑混合。所述賦形劑可包括水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇及其組合。免疫原性組合物以及疫苗還可包括輔助物質(zhì)，諸如濕潤劑戶哦乳化劑，PH緩沖劑，或提高效力的輔助劑。
[0192]免疫組合物和疫苗可經(jīng)胃腸外給藥，通過皮下注射或肌內(nèi)注射或任何其他適合方式。免疫原制備物和疫苗可以與制劑匹配的方式給藥，量可為治療有效性，免疫原性并且為保護(hù)性的量。給藥的量有賴于待治療的對象，包括例如該個體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，如果需要產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力。需要給予的活性藥劑的精確量有賴于醫(yī)師的判斷。但是，適宜劑量范圍可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易確定并有賴于免疫原生物體來確定(beof the order of micrograms of the immunogens)。首次給藥和加強(qiáng)劑量的適宜方案也不同，但包括首次給藥以及隨后的給藥。所述劑量有賴于給藥途徑并根據(jù)宿主的大小而不同。 [0193]免疫原作為免疫原組合物的濃度根據(jù)本發(fā)明通常為大約1-大約95%。如果抗原與佐劑一同給藥免疫原性可明顯提高，通常以磷酸鹽緩沖鹽水中的0.005-0.5百分比溶液使用。佐劑促進(jìn)抗原的免疫原性但其自身不必是免疫原性的。佐劑可通過保持抗原在接近給藥位點(diǎn)的局部以產(chǎn)生有利于將抗原緩慢持續(xù)釋放到免疫系統(tǒng)細(xì)胞的儲庫來起作用。佐劑還吸引免疫系統(tǒng)的細(xì)胞到抗原儲庫并刺激所述細(xì)胞激發(fā)免疫反應(yīng)。
[0194]免疫刺激劑或佐劑用于改善宿主對例如疫苗的免疫反應(yīng)已經(jīng)有很多年。本發(fā)明的疫苗可與佐劑聯(lián)用，例如脂聚糖，氫氧化鋁，和磷酸鋁(alum)，與膜蛋白抗原復(fù)合的皂角苷(免疫刺激復(fù)合體)，具有礦物油的聚醚聚合物(pluronic polymers with mineral oil),礦物油中的殺死的分枝桿菌，弗氏完全佐劑，細(xì)菌產(chǎn)物，諸如胞壁酰二肽(MDP)和脂聚糖(LPS),以及脂質(zhì)A，和脂質(zhì)體。理想佐劑的所需性質(zhì)包括:(I)缺乏毒性；(2)刺激長期持續(xù)的免疫反應(yīng)的能力；(3)制備簡單，可穩(wěn)定的長期保存；(4)激發(fā)針對不同途徑給予的抗原的CMI和HIR的能力；(5)與其他佐劑協(xié)同；(6)可與抗原呈遞細(xì)胞(APC)群體選擇性反應(yīng)；(7)特異性激發(fā)適當(dāng)T-輔助細(xì)胞I (THl)或TH2稀細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)的能力；和(8)選擇性增加針對抗原的適當(dāng)抗體(例如，IgA)的水平的能力。本發(fā)明所用佐劑無需具有所有上述性質(zhì)。
[0195]給藥本發(fā)明疫苗組合物的任何實(shí)施方案的途徑包括但不限于，經(jīng)口鼻，肌肉內(nèi)，腹腔內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，眼內(nèi)，口服以及透皮或通過吸入或栓劑。疫苗可通過任何途徑給藥包括但不限于，注射器，霧化器，混合器(misters)，無針注射裝置，或微粒攻擊基因槍(Biolistic bombardment)。
[0196]本發(fā)明一方面，如果疫苗是亞單位疫苗、DNA疫苗或基于重組的疫苗，本發(fā)明人認(rèn)為可利用單個M蛋白而僅僅變化GP5蛋白，例如其聚糖類型,而仍保持抗PRRSV保護(hù)作用。[0197]可選，PRRSV的GP5，M，或GP5-M異源二聚體的超過一種聚糖類型可用于本發(fā)明所述的疫苗。其中包括來自不同PRRSV的GP5，M，或GP5-M異源二聚體以及根據(jù)聚糖分型相同或相似GP5，M，或GP5-M異源二聚體的多個拷貝。本發(fā)明人認(rèn)為任何用于治療本發(fā)明的PRRS的疫苗可進(jìn)一步包括至少一種其他抗豬病原體的疫苗，所述病原體例如豬流感病毒(SIV)，豬圓環(huán)病毒(PCV)，豬肺炎支原體或豬副嗜血桿菌。
[0198]作為疫苗效力的一個指標(biāo)，可對從接種后個體收集的樣品進(jìn)行ELISA確定是否針對包含PAD多肽、其衍生物、類似物或變體或片段的疫苗的抗PAD抗體。比照參比抗PAD抗體測定個體樣品。
[0199]本發(fā)明疫苗的效力可通過測定疫苗是否對豬提供抗PRRSV感染保護(hù)作用來測定。在下述情況中，疫苗保護(hù)豬對抗PRRSV感染:在將該疫苗給予一或多個未受感染的豬之后隨后用生物學(xué)純病毒分離株(例如，VR2385，VR2386，或下文所述其他分離株)攻擊導(dǎo)致任何宏觀或病理學(xué)嚴(yán)重度降低(例如肺損傷)和/或疾病癥狀與未受保護(hù)的相似豬中該分離株引起的常見改變或癥狀相比(即相對于適當(dāng)?shù)膶φ?嚴(yán)重度降低。更具體的，本發(fā)明的疫苗顯示通過如下方式顯示為有效的:將疫苗給予一或多個需要所述疫苗的適宜豬，然后在一段適宜時間(例如1-4周)之后用大量生物學(xué)純PRRSV分離株的樣品(103_7TCID5(i)攻擊。大約I周之后從攻擊的豬獲取血樣，并嘗試從血樣中分離病毒。病毒的分離表示疫苗不是有效的，并且不能分離所述病毒表明疫苗是有效的。
[0200]因此，本發(fā)明疫苗的有效性可定量(即與適當(dāng)對照組相比固化(consolidated)肺組織百分比降低)或定性(例如從血液分離PRRSV，在肺、扁桃體或淋巴結(jié)組織樣品中通過免疫過氧化物酶測定法檢出PRRSV抗原等)。豬繁殖與呼吸疾病的癥狀可定量(即溫度/發(fā)熱)，半定量(例如呼吸窘迫嚴(yán)重度)或定性(例如一或多種癥狀的存在或缺失或一或多種癥狀嚴(yán)重度的降低，諸如紫紺，肺炎，心和/或腦損傷等)評估。
[0201]因此，本發(fā)明也提供對易感宿主例如豬進(jìn)行免疫接種以對抗PRRSV的方法，包括給予該宿主有效保護(hù)對抗PRRSV感染的量的PAD多肽、其衍生物、類似物或變體或片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解表達(dá)PAD多肽、其衍生物、類似物或變體或片段的核酸也可用于免疫接種中。另一個實(shí)施方案中，提供了預(yù)防或治療動物中的PRRSV的方法，其中給予所述動物治療有效量的PAD或編碼PAD的核酸。一方面，所述動物是豬。
[0202]本發(fā)明還涉及新的PAD多肽，其衍生物、類似物或變體或片段或編碼本發(fā)明PAD多肽的核酸，其可為單獨(dú)的或與其他免疫原性多肽組合，給予動物例如豬，所述給藥可利用多種遞送系統(tǒng)或方法進(jìn)行。所述遞送方法或系統(tǒng)包括但不限于脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，裸露的遞送系統(tǒng)，電穿孔，病毒，載體，病毒載體或可攝入的遞送系統(tǒng)，其中PAD多肽或編碼PAD的核酸被攝取，例如其可在飼料或水中。此外，PAD多肽，其衍生物、類似物或變體或片段或編碼本發(fā)明PAD多肽的核酸可經(jīng)腹腔，口服，鼻內(nèi)，皮下，皮內(nèi)，肌肉內(nèi)，局部或靜脈內(nèi)給藥(或經(jīng)配制用于給藥)，或可通過任何藥物學(xué)有效途徑(即有效產(chǎn)生免疫力)給藥或經(jīng)配制用于給藥。另一方面，所述方法還包括PAD多肽，其衍生物、類似物或變體或片段或編碼本發(fā)明PAD多肽的核酸以有效保護(hù)對抗PRRSV感染的量存在于生理可接受的載體。
[0203]除了用作疫苗以外，PAD多肽和編碼PAD多肽的核酸可用作抗原產(chǎn)生用于被動免疫治療中的抗體，用作診斷劑，用作其他方法諸如親和層析中的試劑。
[0204]一個相關(guān)方面，本發(fā)明包括所謂的“被動”免疫方法用于預(yù)防或治療PRRSV。例如，抗血清包含利用PRRSV或其突變體或其免疫原性片段免疫異源宿主產(chǎn)生的抗體，用于治病性治療PRRSV感染的豬。但即使提供主動免疫的疫苗，即包含PRRSV或其突變體或其免疫原性片段的疫苗已經(jīng)在具體情況中也顯示在作為抗各種疾病的治病性治療中給藥時有效。因此，本發(fā)明提供的免疫力可為主動免疫或被動免疫，并且疫苗和抗血清的使用目的是預(yù)防性或治病性應(yīng)用。[0205]根據(jù)本發(fā)明的該方面，給予動物對象例如豬有效量的抗體，所述抗體特異性結(jié)合本發(fā)明的PAD多肽，其衍生物，類似物，變體或片段。根據(jù)相關(guān)實(shí)施方案，所述方法和組合物還可包含結(jié)合至少一或多種PAD多肽的抗體的組合。所述抗體也可與載體一同給藥，如本文所述。通常，根據(jù)本發(fā)明的這方面，所述抗體將可經(jīng)腹腔，口服，鼻內(nèi)，皮下，皮內(nèi)，肌肉內(nèi)，局部或靜脈內(nèi)給藥(或經(jīng)配制用于給藥)，也可通過任何藥物學(xué)有效途徑(即有效產(chǎn)生免疫力)給藥或配制用于給藥。因此，PRRSV抗體可用于抑制和/或治療PRRSV感染。
[0206]本發(fā)明還涉及診斷和藥物試劑盒，其包含一或多個充滿了一或多種本發(fā)明前述組合物的容器，本發(fā)明前述組合物例如編碼PAD多肽，其衍生物，類似物，變體或片段的核酸，或針對PAD多肽，其衍生物、類似物或變體或片段或編碼本發(fā)明PAD多肽的核酸的抗體。因此，本發(fā)明的多核苷酸，多肽和抗體以及疫苗可作為研究藥劑以及治療和診斷PRRSV的物質(zhì)使用。具體的，認(rèn)為試劑盒可用于確定豬是否被成功接種從而使得抗PAD抗體存在收集的樣品中。例如，收集來自用上述PAD多肽免疫的動物例如豬的生物學(xué)樣品，并與PAD多肽或其他抗PAD抗體制備物保溫足夠抗體結(jié)合發(fā)生的一段時間。與PAD多肽結(jié)合的抗體或其他抗PAD抗體制備物利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法檢測，例如Western印跡分析和/或ELISA測定法。
[0207]本發(fā)明的抗PAD抗體具有多種用途，例如，抗-PAD抗體可用于PRRSV的診斷試驗(yàn)中，例如檢測其在特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的各種檢測試驗(yàn)，在均質(zhì)或異質(zhì)階段中進(jìn)行的諸如競爭結(jié)合試驗(yàn)，直接或間接夾心測定法以及免疫沉淀測定法(Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.(1987)pp.147-158)。用于診斷試驗(yàn)中的抗體可用可檢測部分標(biāo)記。本發(fā)明抗體的檢測可通過將抗體與可檢測部分偶聯(lián)(例如物理連接)來進(jìn)行。可檢測部分的實(shí)例包括各種酶，修復(fù)基團(tuán)，熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，生物發(fā)光物質(zhì)和放射活性物質(zhì)。適宜酶的實(shí)例包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，beta-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶。適宜修復(fù)基團(tuán)復(fù)合體的實(shí)例包括鏈霉抗生物素/生物素和親和素/生物素；適宜熒光物質(zhì)的實(shí)例包括傘形酮，熒光素，異硫氰酸熒光素，羅丹明，二氯三卩丫嗪基胺突光素(dichlorotriazinylamine fluorescein),丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括螢光素酶，螢光素，和螢光素，適宜放射活性物質(zhì)的實(shí)例包括I125，I131，S35或H3?？蓹z測部分應(yīng)能直接或間接產(chǎn)生可檢測信號。本領(lǐng)域已知任何將抗體與可檢測部分偶聯(lián)的方法可使用，包括以下參考文獻(xiàn)中描述的那些:Hunter et al., Nature, 144:945 (1962) ;David et al., Biochemistry,13:1014 (1974);Pain et al.,J.Tmmunol.Meth., 40:219(1981);和Nygren,J.Histochem.and Cytochem.，30:407(1982)。本發(fā)明人認(rèn)為所述診斷試劑盒對于去除各種水平的PRRSV的過程有價值，包括但不限于個體(農(nóng)場)，區(qū)域性和/或全國水平。
[0208]抗PAD抗體也可用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來源中親和純化PAD。在該過程中，抗PAD抗體利用常用方法固定在適宜支持物上，諸如Sephadex樹脂或?yàn)V紙。固定的抗體隨后可與包含待純化的PAD的樣品接觸，然后用適宜溶劑洗滌支持物，基本去除樣品中除了與固定的抗體結(jié)合的PAD之外的所有物質(zhì)。最后，支持物利用另一種適宜溶劑洗滌，將PAD從抗體釋放出來。
[0209]雖然本發(fā)明已經(jīng)參考PAD多肽描述，應(yīng)理解其包括其衍生物，類似物，變體或片段以及類似的蛋白可具有添加、缺失或取代但基本上不影響重組多肽的保護(hù)性抗原的性質(zhì)。
[0210]本發(fā)明的疫苗組合物包含將減毒PRRSV給予易感豬或有感染PRRSV風(fēng)險的豬以提高豬自身的免疫反應(yīng)能力。所述量定義為“免疫有效劑量”。在該用途中，精確量有賴于豬的健康狀態(tài)和重量，給藥方式，配制性質(zhì)等。疫苗組合物還摻入其他物質(zhì)以穩(wěn)定PH，或作為佐劑，濕潤劑或乳化劑，可改善疫苗有效性。疫苗通常配制成胃腸外給藥的形式，并經(jīng)皮下或肌內(nèi)注射。所述疫苗還可利用本領(lǐng)域已知的方法配制成栓劑或可口服給藥的形式。
[0211]足以產(chǎn)生抗PRRSV免疫力的疫苗的量通過本領(lǐng)域已知方法確定。所述量可基于疫苗接受者的特征和所需免疫力水平確定。通常，疫苗的量或給藥劑量通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員確定或可通過常規(guī)試驗(yàn)輕易確定。每種毒株的病毒疫苗的量可調(diào)節(jié)，例如增加或減少，產(chǎn)生這樣的配制劑，其提供足夠的抗所需PRRSV感染的保護(hù)作用。本發(fā)明人認(rèn)為不同毒株可以任何認(rèn)為可有效預(yù)防或治療PRRSV感染的量組合在疫苗組合物中，并且如果出現(xiàn)交叉保護(hù)可包含其他毒株。對其他PRRSB毒株的感染的交叉保護(hù)有賴于中PRRSV毒株的給藥次序(order)或豬以前是否感染過PRRSV,如上所述。
[0212]根據(jù)本發(fā)明，GP5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中具有相同或不同糖基化模式的不同的PRRSV或PRRSV的PAD，例如，GP5, M,和/或GP5-M異源二聚體的PAD可依次或漸進(jìn)性給藥或在混合物中交替給藥。依次或漸進(jìn)性給藥本發(fā)明的疫苗組合物是激發(fā)足夠水平的免疫力以擴(kuò)增PRRSV毒株所需的。可單次或多次給藥本發(fā)明的疫苗組合物。多次給藥是激發(fā)足夠免疫力水平所需的。誘導(dǎo)的免疫力水平可通過測定中和型分泌抗體和血清抗體的量來檢測，可調(diào)節(jié)劑量或重復(fù)接種以維持所需保護(hù)水平。
[0213]在抗PRRSV感染的免疫方案的一個方面，給藥本發(fā)明具有PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD的病毒，其中具有北美毒株的GP5的位置44的糖基化，然后給藥本發(fā)明具有PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD的病毒，其中不具有北美毒株的GP5的位置44的糖基化，隨后用在GP5中和表位糖基化的PRRSV攻擊。
[0214]另一方面，給藥本發(fā)明具有PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD的病毒，其中具有在歐洲毒株的GP5的位置46的糖基化，然后給藥本發(fā)明具有PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD的病毒，其中不具有歐洲毒株的GP5的位置46的糖基化，隨后用在GP5中和表位具有糖基化的PRRSV攻擊。
[0215]在抗PRRSV感染的免疫方案的另一個方面，給藥本發(fā)明包含PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD，其具有北美毒株的GP5的位置44的糖基化，然后給藥本發(fā)明包含PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD，其不具有北美毒株的GP5的位置44的糖基化，隨后用在GP5中和表位中具有糖基化的PRRSV攻擊。另一方面，給藥本發(fā)明具有PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD，其在歐洲毒株的GP5的位置46的糖基化，然后給藥本發(fā)明具有PRRSV的GP5-M異源二聚體的PAD，其不在歐洲毒株的GP5的位置46的糖基化，隨后用在GP5中和表位中糖基化的PRRSV攻擊。
[0216]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5的PAD可不具有來自NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的任何聚糖。另一方面，GP5的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖。另一方面，GP5的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖并且具有或不具有位于NA PRRSV GP5蛋白氨基酸1_35的聚糖，例如在一些NA PRRSV毒株中所見。
[0217]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5-M異源二聚體的PAD可不具有來自NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的任何聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖并且具有或不具有NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1_35的聚糖，例如在一些NA PRRSV毒株中所見。 [0218]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5的PAD可不具有來自EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的任何聚糖，如在Lelystad中所見。另一方面，GP5的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖。另一方面，GP5的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖并且具有或不具有位于EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的聚糖，例如在一些EU PRRSV毒株中所見。
[0219]本發(fā)明一個實(shí)施方案中，GP5-M異源二聚體的PAD可不具有來自EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的任何聚糖，如在Lelystad中所見。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖。另一方面，GP5-M異源二聚體的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖并且具有或不具有位于EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的聚糖，例如在一些EU PRRSV毒株中所見。
實(shí)施例:
[0220]實(shí)施例1:
[0221]鑒定PRRSV的PAD的溶液不顯而易見，因?yàn)槠渌瞬]有將關(guān)于北美和歐洲PRRSV毒株以及馬動脈炎病毒(EAV)的信息總結(jié)成知識。例如，EAV的修飾活疫苗(MLV)非常有效而PRRSV的MLV并非如此。許多科學(xué)家的顯而易見的結(jié)論是兩種病毒的相似性和差異的比較對于開發(fā)PRRSV的疫苗而言沒有價值。從2005年2月份開始，發(fā)明人研究了多篇公開物，總結(jié)了許多重要信息，并通過推理鑒定PRRSV的保護(hù)性抗原決定子是基質(zhì)-糖蛋白5 (M-GP5)異源二聚體。
[0222]PRRS流行病令人最感興趣且最困擾的一個方面是北美和歐洲分離株之間的差異，以及至少在將PRRSV活疫苗從美國引入歐洲之前，在西歐PRRS相對較輕的事實(shí)。此外，一些小的傳統(tǒng)美國農(nóng)場，PRRSV自發(fā)消失而沒有明顯的原因。但在美國，PRRS總對經(jīng)濟(jì)造成更具有破壞性的損失(尤其對于大的豬群而言)。因此，本發(fā)明人比較了 VR2332 (常見的北美毒株)上的N糖基化位點(diǎn)和Lelystad病毒(常見的歐洲毒株)上的N糖基化位點(diǎn)。見表1。注意HLV013和Lelystad病毒之間的相似性；但是這兩種病毒并非相同，因?yàn)镚P5信號序列和GP5高變區(qū)非常不同。根據(jù)公開文獻(xiàn)，有證據(jù)表明活Lelystad病毒保護(hù)豬對抗PRRS的程度比VR2332高。在AA1-43缺乏糖基化是PRRS在歐洲部分地區(qū)和美國一些農(nóng)場中嚴(yán)重性降低的原因。即，Lelystad病毒在歐洲已經(jīng)天然免疫豬，并且與HLV013類似的毒株對于美國有限數(shù)目的農(nóng)場的影響也如此。北美毒株VR2332和Mnl84在糖基化方面非常不同的事實(shí)使得我們比較VR2332與Lylstad毒株的抗體反應(yīng)性(表2)。由于Lelystad病毒的抗體與Lelystad的GP5-M異源二聚體反應(yīng)，我們認(rèn)為GP5-M異源二聚體含有PRRSV的保護(hù)性抗原決定子并可作為PRRS抗性的基礎(chǔ)。
[0223]表1.比較不同PRRSV毒株的AA序列和N-糖基化
[0224]
【權(quán)利要求】
1.用于產(chǎn)生針對PRRS保護(hù)性效應(yīng)的分離的多肽，包括: 包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基質(zhì)蛋白(M蛋白)與PRRSV糖蛋白5 (GP5)的異源二聚體的序列，其中所述GP5蛋白通過二硫鍵與所述M蛋白相連，其中所述二硫鍵由北美PRRSV毒株中位置9或EU PRRSV毒株中位置8的M蛋白中的半胱氨酸與北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置48或歐洲PRRSV毒株位置50的半胱氨酸之間形成的鍵所產(chǎn)生，其中所述位置9是從與SEQ ID NO: 28的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置8是從與SEQ ID NO:41的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置48是從與SEQID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置50是從與SEQ ID NO:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，由此產(chǎn)生GP5-M異源二聚體。
2.制備用于產(chǎn)生針對PRRSV暴露的保護(hù)性反應(yīng)的疫苗的方法，所述方法包括確定PRRSV毒株糖蛋白5(GP5)的聚糖的數(shù)目，并制備包含與所述PRRSV毒株相比具有較少聚糖的GP5的疫苗。
3.制備針對PRRSV的疫苗的方法，所述方法包括制備包含PRRSV糖蛋白5(GP5)的疫苗，其中所述GP5糖基化選自:無聚糖；存在于北美PRRSV毒株中位置44的聚糖，其中所述位置44是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于北美PRRSV毒株中位置51的聚糖，其中所述位置51是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于北美PRRSV毒株的位置44和51的聚糖；存在于歐洲PRRSV毒株中位置46的聚糖，其中所述位置46是從與SEQ ID NO:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于歐洲PRRSV毒株中位置53的聚糖，其中所述位置53是從與SEQ ID NO:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；和存在于歐洲PRRSV毒株中所述GP5蛋白的位置46和53的聚糖。
4.對PRRSV毒株進(jìn)行分組的方法，所述方法包括確定PRRSV糖蛋白5(GP5)中聚糖的數(shù)目以及所述聚糖的位置，并將在相同位置具有相同數(shù)目聚糖的毒株分為一組。
5.產(chǎn)生針對PRRSV的抗體的方法，包括給予對象這樣的序列，所述序列包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基質(zhì)蛋白(M蛋白)與PRRSV糖蛋白5(GP5)的異源二聚體，其中GP5蛋白通過二硫鍵與M蛋白相連，其中二硫鍵由北美PRRSV毒株中位置9或EU PRRSV毒株中位置8的M蛋白中的半胱氨酸與北美PRRSV毒株中位置48或歐洲PRRSV毒株中位置50的GP5蛋白中的半胱氨酸之間形成的鍵產(chǎn)生，其中所述位置9是從與SEQ ID NO:28的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置8是從與SEQ ID NO: 41的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置48是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置50是從與SEQ ID NO:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，由此產(chǎn)生針對PRRSV的抗體。
6.產(chǎn)生針對PRRSV的抗體的方法，所述方法包括確定PRRSV毒株糖蛋白5(GP5)的聚糖的數(shù)目，給予對象包含具有的聚糖少于所述PRRSV毒株的GP5的PRRSV，由此產(chǎn)生針對PRRSV的抗體。
7.產(chǎn)生針對PRRSV的抗體的方法，所述方法包括: 制備包含PRRSV糖蛋白5 (GP5)的疫苗，其中所述GP5糖基化選自:無聚糖；存在于北美PRRSV毒株中位置44的聚糖，其中所述位置44是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于北美PRRSV毒株中位置51的聚糖，其中所述位置51是從與SEQID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于北美PRRSV毒株的位置44和51的聚糖；存在于歐洲PRRSV毒株中位置46的聚糖，其中所述位置46是從與SEQ ID NO:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于歐洲PRRSV毒株中位置53的聚糖，其中所述位置53是從與SEQ ID NO: 4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；和存在于歐洲PRRSV毒株中所述GP5蛋白的位置46和53的聚糖， 給予對象制備的疫苗， 由此產(chǎn)生針對PRRSV的抗體。
8.如下序列在制備用于針對PRRSV進(jìn)行接種的試劑盒中的用途，所述序列包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基質(zhì)蛋白(M蛋白)與PRRSV糖蛋白5(GP5)的異源二聚體，其中GP5蛋白通過二硫鍵與M蛋白相連，其中二硫鍵由北美PRRSV毒株中位置9或EU PRRSV毒株中位置8的M蛋白中的半胱氨酸與北美PRRSV毒株中位置48或歐洲PRRSV毒株中位置50的GP5蛋白中的半胱氨酸之間形成的鍵產(chǎn)生，其中所述位置9是從與SEQ ID NO:28的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置8是從與SEQ ID N0:41的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置48是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置50是從與SEQ ID NO:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，將所述序列給予對象而由此針對PRRSV進(jìn)行接種。
9.通過如下方法制備的疫苗在制備用于給對象進(jìn)行針對PRRSV的接種的試劑盒中的用途，所述方法包括:確定PRRSV毒株糖蛋白5 (GP5)的聚糖的數(shù)目，制備包含具有的聚糖少于所述PRRSV毒株的GP5的疫苗。
10.通過如下方法制備的疫苗在制備用于給對象進(jìn)行針對PRRSV的接種的試劑盒中的用途，所述方法包括:制備包含PRRSV糖蛋白5 (GP5)的疫苗，其中所述GP5糖基化選自:無聚糖；存在于北美PRRSV毒株中位置44的聚糖，其中所述位置44是從與SEQ ID NO:l的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于北美PRRSV毒株中位置51的聚糖，其中所述位置51是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于北美PRRSV毒株的位置44和51的聚糖；存在于歐洲PRRSV毒株中位置46的聚糖，其中所述位置46是從與SEQ ID NO: 4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于歐洲PRRSV毒株中位置53的聚糖，其中所述位置53是從與SEQ ID NO:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；和存在于歐洲PRRSV毒株中所述GP5蛋白的位置46和53的聚糖。
11.疫苗，其包含這樣的序列，所述序列包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基質(zhì)蛋白(M蛋白)與PRRSV糖蛋白5 (GP5)的異源二聚體，其中GP5蛋白通過二硫鍵與M蛋白相連，其中二硫鍵由北美PRRSV毒株中位置9或EU PRRSV毒株中位置8的M蛋白中的半胱氨酸與北美PRRSV毒株中位置48或歐洲PRRSV毒株中位置50的GP5蛋白中的半胱氨酸之間形成的鍵產(chǎn)生，其中所述位置9是從與SEQ ID NO: 28的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置8是從與SEQ ID N0:41的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置48是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的，其中所述位置50是從與SEQ ID N0:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的。
12.通過以下方法制備的PRRSV疫苗，所述方法包括確定PRRSV毒株糖蛋白5(GP5)的聚糖的數(shù)目，制備包含具有的聚糖少于所述PRRSV毒株的GP5的疫苗。
13.PRRSV疫苗，包含PRRSV糖蛋白5(GP5)，其中所述GP5糖基化選自:無聚糖；存在于北美PRRSV毒株中位置44的聚糖，其中所述位置44是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于北美PRRSV毒株中位置51的聚糖，其中所述位置51是從與SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于北美PRRSV毒株的位置44和51的聚糖；存在于歐洲PRRSV毒株中位置46的聚糖，其中所述位置46是從與SEQ ID NO: 4的氨基酸序 列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于歐洲PRRSV毒株中位置53的聚糖，其中所述位置53是從與SEQ ID NO:4的氨基酸序列進(jìn)行的序列比對所確定的；存在于歐洲PRRSV毒株中所述GP5蛋白的位置46和53的聚糖。
【文檔編號】A61K39/12GK103641920SQ201310611878
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2006年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2005年11月29日
【發(fā)明者】D·L·哈里斯, M·M·厄爾德曼 申請人:衣阿華州立大學(xué)研究基金公司