一種抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒及制備方法，通過PCR擴(kuò)增得到Egr1和Hsp70啟動(dòng)子及HSVTK基因，經(jīng)酶切、連接等步驟連接至pCDNA3.1質(zhì)粒中，并以磁性納米粒為基因載體將構(gòu)建的基因?qū)際EK293細(xì)胞，定量觀察在輻射、磁熱療或二者共同誘導(dǎo)后HSV-TK基因的表達(dá)。該質(zhì)粒的Egr1啟動(dòng)子在2GyＸ射線誘導(dǎo)后６小時(shí)后，靶基因的表達(dá)量最高。Egr1和Hsp70啟動(dòng)子都具有誘導(dǎo)表達(dá)活性，可在輻射和熱激分別及聯(lián)合作用下誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，且聯(lián)合作用時(shí)對(duì)基因誘導(dǎo)表達(dá)的能力更強(qiáng)，為進(jìn)一步進(jìn)行癌癥的綜合治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利說明】一種抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種作為治療癌癥的輻射、熱激誘導(dǎo)的雙啟動(dòng)子PCDNA3.1-Egr 1-Hsp70-HSVTK基因的構(gòu)建及磁性復(fù)合納米顆粒及其制備。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，許多新的基因治療方法(包括輻射-基因治療、基因-過熱治療)被相繼運(yùn)用于肝癌治療研究中，其中應(yīng)用較多、療效較為肯定的目的基因是HSV-TK/GCV系統(tǒng)。它所采用的目的基因是自殺基因(Suicide gene)或稱藥物敏感基因，其治療原理是可使無毒的藥物前體(如GCV等)轉(zhuǎn)化為有毒性的藥物，通過摻入細(xì)胞DNA，阻斷細(xì)胞DNA的合成，從而選擇性地殺死快速增殖的腫瘤細(xì)胞。然而，在基因傳遞問題沒有很好的解決以前，要實(shí)現(xiàn)全面的腫瘤基因治療并獲得理想的療效是很困難的。病毒載體系統(tǒng)是迄今為止最有效的基因轉(zhuǎn)移方法。但是，由于其局限性(如缺乏高效和定向的載體系統(tǒng)、基因進(jìn)入體內(nèi)的可控性問題等)，尤其是安全問題的存在，使其臨床運(yùn)用受到嚴(yán)格控制；非病毒載體系統(tǒng)盡管避免了重大的安全隱患，但其轉(zhuǎn)染效率一直不如病毒載體系統(tǒng)，難以獲得有意義的基因表達(dá)。因此，如何突破基因轉(zhuǎn)移瓶頸已成為基因治療領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。
[0003]隨著納米技術(shù)的發(fā)展，以納米顆粒為基因轉(zhuǎn)移載體的研究引起了廣泛關(guān)注。納米技術(shù)的出現(xiàn)為解決基因轉(zhuǎn)移載體問題提供了新的思路。以納米顆粒為基因轉(zhuǎn)移載體就是將DNA、RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒中或吸附在其表面，在細(xì)胞攝粒作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)釋放基因治療分子。國(guó)際國(guó)內(nèi)已相繼研制出多種納米基因轉(zhuǎn)移載體，并向著無機(jī)、有機(jī)以及生物材料雜化的趨勢(shì)發(fā)展。本研究組也較早地涉足這一領(lǐng)域，并研制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的磁性錳鋅鐵氧體納米顆粒、納米磁性脂質(zhì)體等多種磁性納米載體。前期研究表明磁性納米載體制備簡(jiǎn)單、無組織細(xì)胞毒性、易于表面修飾使其具有很高的生物相容性。磁性納米載體除了具有一般納米顆粒的特性以外，還具有超順磁性，可在外加磁場(chǎng)的作用下，定向移動(dòng)，從而進(jìn)行靶向基因治療。不僅如此，磁性納米顆粒還可在外加磁場(chǎng)作用下磁感應(yīng)升溫用于腫瘤熱療。
[0004]放療聯(lián)合熱療治療惡性腫瘤在20世紀(jì)80年代已經(jīng)開始用于臨床，隨著研究的深入，對(duì)放療聯(lián)合熱療治療惡性腫瘤的機(jī)制有了更深人的研究。放療和熱療的聯(lián)合應(yīng)用，不僅可發(fā)揮各自的細(xì)胞毒作用，而且熱療有放射增敏作用。惡性腫瘤體積大，瘤體中心處于乏氧狀態(tài)，對(duì)放射線抗拒，對(duì)瘤體周圍的富氧部分敏感，因此在單純放射治療到一定程度后，腫瘤體積退縮程度減慢或不再退縮。而熱療可以抑制腫瘤細(xì)胞的呼吸，在乏氧狀態(tài)下增強(qiáng)無氧糖酵解，使環(huán)境酸度增高，在酸性環(huán)境中，容易激活溶酶體的活性，抑制DNA、RNA和蛋白合成，使細(xì)胞膜破壞，骨架散亂，細(xì)胞功能受損，最后導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。相反，對(duì)腫瘤周圍血液循環(huán)較好的細(xì)胞，由于難于達(dá)到有效熱度，而療效相對(duì)較差，但卻是放療的敏感區(qū)。s期腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療抵抗最強(qiáng)，而對(duì)熱療卻最敏感。因此，放療和熱療聯(lián)合治療有療效互補(bǔ)和相加的作用。熱療在放療后30min進(jìn)行，還可以抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線所致亞致死損傷和潛在致死損傷的修復(fù)，可以明顯提高腫瘤的氧含量，增強(qiáng)腫瘤放射治療的敏感性。[0005]熱激蛋白70 (熱休克蛋白70)啟動(dòng)子(HSp70prOmOter)具有熱激誘導(dǎo)性，其啟動(dòng)子序列經(jīng)熱作用(如42°C_45°C)后可誘導(dǎo)下游基因表達(dá)。Isomoto H等利用熱作用誘導(dǎo)熱激蛋白(heat stress protein)高表達(dá)的特點(diǎn)，將自殺基因與Hsp70啟動(dòng)子結(jié)合，構(gòu)建相應(yīng)腺病毒載體后導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，在熱作用后聞表達(dá)自殺基因，然后予以甘昔洛韋殺傷細(xì)胞，體外研究顯示有顯著殺傷作用。這種新方法被稱為基因-過熱治療。本課題組構(gòu)建了一種新型納米磁性基因載體，將其與P17300R (哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，編碼β-gal，由熱激蛋白70啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))結(jié)合制備成復(fù)合材料，在磁感應(yīng)加熱條件下可有效升溫至43°C，β-gal表達(dá)強(qiáng)度隨著溫度的升高而明顯增加。在此基礎(chǔ)上，本組構(gòu)建了熱激啟動(dòng)子調(diào)控的pHsp-HSV-TK/As2O3復(fù)合磁性納米粒，在磁感應(yīng)加熱條件下誘導(dǎo)自殺基因表達(dá)，并與As2O3 (三氧化二砷)共同作用殺傷肝癌細(xì)胞。由于該載體為無機(jī)非病毒載體，加之本身所特有的磁感應(yīng)升溫控溫特性，可使基因-過熱治療方法更為安全、穩(wěn)定，也更方便實(shí)用。
[0006]福射-基因治療(radio-genetic therapy),又稱放射_基因治療，即將具有福射誘導(dǎo)性的調(diào)控序列與治療基因相偶聯(lián)，在對(duì)腫瘤實(shí)施局部放療/核素內(nèi)照射時(shí)誘導(dǎo)基因表達(dá)，造成射線和基因?qū)δ[瘤的雙重治療。這樣，一方面可相對(duì)降低等效照射劑量，減輕對(duì)正常組織的損傷；另一方面通過射線的局部照射來實(shí)現(xiàn)腫瘤殺傷基因的定位表達(dá)。利用Egr-1基因啟動(dòng)子調(diào)控序列的放射敏感性而進(jìn)行的輻射-基因治療的研究取得了令人鼓舞的成績(jī)，但是該方法仍然面臨著基因治療中存在的特異性、安全性、基因表達(dá)效率低時(shí)間短、細(xì)胞毒作用小、轉(zhuǎn)移后基因表達(dá)缺乏有效的調(diào)控手段等問題。而且，由于實(shí)體瘤普遍存在的缺氧環(huán)境也可使輻射啟動(dòng)子的誘導(dǎo)活性降低，影響了這一療法的療效和應(yīng)用。
[0007]令人感興趣的是，研究發(fā)現(xiàn)通過增加啟動(dòng)子的數(shù)目可提高目的基因的表達(dá)水平，較多采用的方法是將二個(gè)單啟動(dòng)子串聯(lián)形成雙啟動(dòng)子，這為解決基因治療過程中如何提高目的基因的表達(dá)及時(shí)空調(diào)控等關(guān)鍵問題提供了一個(gè)新的策略。J Finn等人的發(fā)現(xiàn)顯不雙啟動(dòng)子可有效提高非病毒載體的基因表達(dá)水平，因此更具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。研究認(rèn)為雙啟動(dòng)子啟動(dòng)功率增強(qiáng)可能是多個(gè)順式作用元件在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平上相互影響、共同作用的結(jié)果。據(jù)此，本研究設(shè)想:將輻射啟動(dòng)子和熱激啟動(dòng)子組合形成雙啟動(dòng)子來加強(qiáng)誘導(dǎo)和調(diào)控基因的表達(dá)，在核素內(nèi)照射和熱療聯(lián)合的基礎(chǔ)上，使輻射-基因療法、基因-過熱療法和納米技術(shù)有機(jī)結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有可能形成一種新的腫瘤綜合基因療法:輻射-過熱-基因治療。而且，熱療能加強(qiáng)腫瘤局部的血供，提高氧供給，從而起到輻射對(duì)乏氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞治療的增敏作用。
[0008]本研究設(shè)目標(biāo):將輻射啟動(dòng)子和熱激啟動(dòng)子組合形成雙敏感啟動(dòng)子來加強(qiáng)誘導(dǎo)和調(diào)控基因的表達(dá)，在輻射和熱療聯(lián)合的基礎(chǔ)上，使輻射-基因療法、基因-過熱療法和納米技術(shù)有機(jī)結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有可能形成一種新的腫瘤綜合基因療法:輻射-過熱-基因治療。而且，熱療能加強(qiáng)腫瘤局部的血供，提高氧供給，從而起到輻射對(duì)乏氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞治療的增敏作用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]技術(shù)問題:本發(fā)明提供一種可用于輻射，熱激雙敏感啟動(dòng)子來加強(qiáng)誘導(dǎo)和調(diào)控抗腫瘤基因表達(dá)的抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒，同時(shí)提供了一種上述抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒的制備方法。[0010]技術(shù)方案:本發(fā)明的制備抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒的方法，包括如下步驟:
[0011]I)以pIRES-CMVE-EgrIp真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到輻射誘導(dǎo)啟動(dòng)子片段，將其亞克隆至P⑶NA3.1-EGFP質(zhì)粒上，得到p⑶NA3.1-Egrl-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒;
[0012]2)以載有熱啟動(dòng)子和自殺基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到熱啟動(dòng)子片段和抗腫瘤基因片段；
[0013]3)將抗腫瘤基因片段亞克隆至步驟I)中得到的P⑶NA3.1-Egrl-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒中，取代EGFP，得到pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒；
[0014]4)將熱啟動(dòng)子片段亞克隆至pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒上，得到pCDNA3.1-Egrl-Hsp70-HSVTK 真核表達(dá)質(zhì)粒；
[0015]5)按多聚乙烯亞胺負(fù)載的 Mntl 5Zntl 5Fe2O4 納米粒與 pCDNA3.1-Egr 1-Hsp70-HSV_TK真核表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)量比為20:1~50:1，將二者分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5分鐘以上，然后將二者的稀釋溶液混和均勻，室溫下孵育30分鐘以上，獲得pEgrl-Hsp70-HSV-TK/PE1-MZF-NPs復(fù)合物，即為抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒。
[0016]本發(fā)明的腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒，是按照上述方法制備得到。
[0017]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有`以下優(yōu)點(diǎn):
[0018]1、酶切、測(cè)序鑒定結(jié)果表明每步均得到了目的質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的目的基因分子量與預(yù)計(jì)的相同，插入載體位置正確，測(cè)序發(fā)現(xiàn)插入片段序列無改變，且開放讀碼框正確，得到雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pEgrl-Hsp70-HSV-TK。測(cè)序結(jié)果具體見附圖(圖1-4)。
[0019]2、改良化學(xué)共沉淀法制備的Mna5Zna5Fe2O4磁性納米粒為棕色粉末狀，高分辨電鏡(High Resolution Electron Microscopy, HREM)顯不納米粒大小較均勻、電子密度高,粒徑在30nm-40nm之間(圖5);能譜分析(EDS)證實(shí)制備的MZF納米粒中含有Mn，Zn, Fe與O四種元素，且Mn, Zn, Fe的摩爾比約為1:1:4(圖6)。傅立葉紅外光譜(fourier transforminfrared spectroscopy,FTIR)表征顯示:修飾后粒子的紅外光譜圖出現(xiàn)了一NH2和一CH2一的特征小峰，證明了 PEI在顆粒表面能夠產(chǎn)生吸附(圖7)。且體外升溫實(shí)驗(yàn)顯示，10mg/mL的MZF磁性納米粒和PE1-MZF復(fù)合納米粒的磁流體在相同強(qiáng)度的AMF作用下，40Min后可上升到43°C且保持穩(wěn)定，可用于熱療(圖8)。
[0020]3、在進(jìn)行輻射敏感啟動(dòng)子效率的研究中，首先將轉(zhuǎn)染了 Egrl-Hsp70-HSV-TK/PE1-MZF復(fù)合物的HEK293細(xì)胞置于粒子加速器下給予2Gy劑量的X線照射，然后觀察TK基因的表達(dá)情況。在處理后lh，6h，12h，24h，48h時(shí)收集細(xì)胞，用QPCR檢測(cè)TK基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)后lh，TK基因的表達(dá)量即開始升高，6h升到最高值(圖9)。各組熒光強(qiáng)度分另 Ij 為 1.86±0.21 (Ih), 4.53±0.29 (6h), 3.72±0.30(12h)，1.31±0.19(24h)和
0.33±0.15(48h)。對(duì)比結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，在6h之前，Egrl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的TK表達(dá)強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，之后逐漸降低。如果取最高表達(dá)水平與最低表達(dá)水平相比較，在6h時(shí)，TK的表達(dá)是48h時(shí)的5.8倍，是Ih時(shí)的2.35倍，是12h時(shí)的1.19倍。隨之48h后其表達(dá)量降到Ih水平時(shí)的2/5。輻射誘導(dǎo)后，TK的表達(dá)量均有提高，與48h組相比其他組P < 0.05 ;6h組TK的表達(dá)量與24h和48h組相比P < 0.05,結(jié)果見圖9。
[0021]4、研究不同輻射劑量誘導(dǎo)后基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，將轉(zhuǎn)染了 Egrl-Hsp70-HSVTK/PE1-MZF復(fù)合物的HEK293細(xì)胞置于粒子加速器下分別給予OGy，lGy，2Gy，4Gy，8Gy，16Gy劑量的X線照射，在處理后6h時(shí)收集細(xì)胞，用QPCR檢測(cè)TK基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn):熒光強(qiáng)度分另Ij 為 0.47±0.04,0.56±0.02,2.78±0.12，1.95±0.05，1.81±0.09 和 1.67±0.18。比較后發(fā)現(xiàn)，2Gy時(shí)的表達(dá)量最高(見附圖)。在IGy時(shí)，Egrl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的TK表達(dá)強(qiáng)度隨著輻射劑量的增加開始增加，之后略有降低。如果取最高表達(dá)水平與最低表達(dá)水平相比較，在2Gy時(shí)，TK的表達(dá)是OGy時(shí)的5.91倍，是IGy時(shí)的4.96倍。隨之2Gy甚至8、16Gy其表達(dá)量降到2Gy水平時(shí)的0.7。各輻射組與未受輻射組相比，TK的表達(dá)量均有提高，且P< 0.05 ；2Gy誘導(dǎo)組TK的表達(dá)量與其他5組相比P < 0.05 (圖10)。
[0022]5、研究單、雙啟動(dòng)子對(duì)基因調(diào)控效率的差別，分別將轉(zhuǎn)染了 Egrl-HSVTK，Hsp70-HSVTK和Egrl-Hsp70-HSVTK的HEK293細(xì)胞置于直線加速器下給予不同的處理?xiàng)l件:2Gy劑量的X線照射，置于交變磁場(chǎng)下進(jìn)行磁熱療和2Gy的輻射加磁熱療雙重作用及不給予任何誘導(dǎo)，然后觀察TK基因的表達(dá)情況。處理后收集細(xì)胞，用QPCR檢測(cè)TK基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在給予熱激、輻射雙重誘導(dǎo)后TK基因的表達(dá)量最高，是不給予任何誘導(dǎo)時(shí)的2.4倍，是單純輻射誘導(dǎo)時(shí)的1.68倍，是單純熱誘導(dǎo)時(shí)的1.4倍(圖14)。單純熱誘導(dǎo)時(shí)TK的表達(dá)量略高于單純輻射時(shí)，約為其1.18倍。誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組相比，TK的表達(dá)量均有提高，且P < 0.05 ;雙重誘導(dǎo)組TK的表達(dá)量與其他三組相比，P < 0.05，結(jié)果見圖11。
[0023]6、RT-PCR檢測(cè)pEgrl-Hsp70-HSVTK轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TK基因的整合表達(dá)
[0024]磁性轉(zhuǎn)染法將雙啟動(dòng)子的pEgrl-Hsp70-HSV-TK質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293，輻射、加熱誘導(dǎo)后，PCR法檢測(cè)TK基因的整合。之后以HSV-TK基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為469bp。提取RNA并反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后，轉(zhuǎn)染的SMMC7721細(xì)胞均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有檢測(cè)到TK基因相應(yīng)條帶僅檢測(cè)到內(nèi)參GAPDH (圖12)。證實(shí)pEgrl-Hsp70-HSVTK能成功轉(zhuǎn)染SMMC-7721 肝癌細(xì)胞并在其內(nèi)表達(dá)。
[0025]本發(fā)明得到一種pEgrl-Hsp70-HSV-TK質(zhì)粒，是將輻射敏感啟動(dòng)子Egrl和熱敏啟動(dòng)子Hsp70相偶聯(lián)，形成輻射、熱激雙啟動(dòng)子，連接于抗腫瘤基因HSV-TK上游。利用熱激和輻射雙重誘導(dǎo)調(diào)控，以期做到將目的基因控制在適當(dāng)?shù)牟课弧⑦m當(dāng)?shù)臅r(shí)間、甚至適當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)。采用本發(fā)明方法制備的抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒，在輻射和熱療聯(lián)合的基礎(chǔ)上，使輻射-基因療法、基因-過熱療法和納米技術(shù)有機(jī)結(jié)合，將基因治療的效果最大程度的發(fā)揮，并盡可能減少毒副作用，有可能形成一種新的腫瘤綜合基因療法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為采用比對(duì)軟件:Dnassit2.0得到的pCDNA3.1-Egrl-EGFP測(cè)序比對(duì)圖。
[0027]圖2為采用比對(duì)軟件:Dnassit2.0得到的pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK測(cè)序比對(duì)-圖的第一部分。
[0028]圖3為采用比對(duì)軟件:Dnassit2.0得到的pCDNA3.1-Egrl-HSVTK測(cè)序比對(duì)圖的第二部分。
[0029]圖4為采用比對(duì)軟件:Dnassit2.0得到的pCDNA3.1-Egr1-HSP7O-EGFP測(cè)序比對(duì)圖。
[0030]圖5 為 10mg/mL 的 PE1-Mn。.5Zn0.5Fe204 與 Mn。.5Zn0.5Fe204 體外磁感應(yīng)升溫曲線圖。[0031 ] 圖6為Mn。.5Zn0.5Fe204磁性納米粒高分辨電鏡圖。
[0032] 圖7為Mn。.5Zn0.5Fe204的能譜分析圖。[0033]圖8為修飾前后Mna5Zna5Fe2O4納米粒的FTIR圖譜。
[0034]圖9為2Gy輻射誘導(dǎo)后不同時(shí)間TK基因的相對(duì)表達(dá)量示意圖圖10為不同輻射劑量誘導(dǎo)后TK基因的相對(duì)表達(dá)量示意圖。
[0035]圖11為不同誘導(dǎo)條件對(duì)TK表達(dá)量的影響示意圖。
[0036]圖12為HSV-TK擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案做進(jìn)一步具體說明。
[0038]實(shí)施例1:
[0039]本發(fā)明的抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒的制備方法:
[0040]I)以帶有福射誘導(dǎo)啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒(即pIRES-CMVE-Egrlp真核表達(dá)質(zhì)粒)為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到輻射誘導(dǎo)啟動(dòng)子片段(即CMVE-Egrl片段)，將其亞克隆至一種商品化的載有熒光蛋白的質(zhì)粒(即PCDNA3.1-EGFP質(zhì)粒)上，得到輻射誘導(dǎo)的載有熒光蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒(即PCDNA3.1-Egrl-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒)。其中，pIRES-CMVE-Egrlp真核表達(dá)質(zhì)粒為載有輻射啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒，PlRES是指代一種可以允許二種基因同時(shí)表達(dá)的真核質(zhì)粒，最早由西方生物公司合成并應(yīng)用，目前沒有對(duì)應(yīng)的中文名稱，CMVE是指代巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，Egrlp是指代輻射誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。pCDNA3.1-EGFP質(zhì)粒是一種載有熒光蛋白的質(zhì)粒，PCDNA3.1是一個(gè)常用的基因克隆質(zhì)粒的名稱，最早由西方生物公司合成并應(yīng)用，目前沒有對(duì)應(yīng)的中文名稱，EGFP是指代綠色熒光蛋白。P⑶NA3.1-Egrl-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒中，Egrl是指代福射誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
[0041]CMVE-Egrl啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增:
[0042]PCR引物以pIRES-CMVE-Egrlp序列中的CMVE-Egrl片段為模板設(shè)計(jì)。
[0043]引物序列如下:
[0044]Egrl-f:
[0045]5’ -CCG CTCGAG CG ACGCGT GATCTTCAATATTGGCCATTAGC-3’
[0046]---MluI:CG ACGCGT
[0047]---XhoI:CCG CTCGAG
[0048]Egrl-r:
[0049]5， -CCG CTCGAG CTA GCTAGC CCAAGTTCTGCGCGCTGGGAT-3，
[0050]---NheI:CTA GCTAGC
[0051]XhoI:CCG CTCGAG
[0052]Product:Length=I117+17+18=1152bp, GC%=52.3，Ta=55.8
[0053]PCR擴(kuò)增得到1152bp大小的CMVE-Egrl片段。
[0054]pCDNA3.1-Egrl-EGFP 質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定:
[0055]用Mlu I和Nhe I雙酶切pCDNA3.1-EGFP質(zhì)粒，將第一步中回收的CMVE-Egrl片段連接于載體，構(gòu)建P⑶NA3.Ι-Egrl-EGFP。選取陽(yáng)性克隆，小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切及測(cè)
序鑒定。
[0056]圖1為pCDNA3.1-Egrl-EGFP的測(cè)序圖譜，將其序列與Egrl模板序列比對(duì)，可知Egrl序列完全正確，表明pCDNA3.1-Egrl-EGFP構(gòu)建成功。(SequenceO:Egrl啟動(dòng)子序列(CMVE 序列未列入)Sequencel:pCDNA3.1-Egr1-EGFP-EGFP-N-3.abl 反向互補(bǔ)序列)
[0057]2)以載有熱啟動(dòng)子和自殺基因的質(zhì)粒(即pD3SX-Hsp70-HSVTK質(zhì)粒)為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到熱啟動(dòng)子片段(即Hsp70片段)和抗腫瘤基因片段(即HSV-TK片段)。pD3SX-Hsp70-HSVTK質(zhì)粒為載有熱啟動(dòng)子和自殺基因的質(zhì)粒，pD3SX是指代一種帶有應(yīng)激啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體，最早由西方生物公司合成并應(yīng)用，目前沒有對(duì)應(yīng)的中文名稱，Hsp70是指代熱啟動(dòng)子，HSVTK是指代自殺基因即本專利中的抗腫瘤基因。
[0058]2.1) HSV-TK 片段的 PCR 擴(kuò)增
[0059]以本室保存的pD3SX-HSP70-HSVTK質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增HSV-TK片段。
[0060]引物對(duì):
[0061]HSV-TK-f:
[0062]5， -G GAATTC GCC ACC ATGGCCTCGTACCCCGGCCAT-3， (EcoRI)
[0063](GCC ACC為Kozak序列，增強(qiáng)基因表達(dá)用)
[0064]HSV-TK-r:
[0065]5， -CCG CTCGAG TCAGTTAGCCTCCCCCATCT-3， (XhoI)
[0066]Product:Length=l131+13+9=1153bp, GC%=65.4, Ta=59.7
[0067]擴(kuò)增得到1153bp的HSV-TK片段。
[0068]2.2) PCR 擴(kuò)增 Hsp70 片段
[0069]以pD3SX-Hsp70-HSV_TK 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增 Hsp70 片段。
[0070]引物對(duì):
[0071]Hsp70-f:
[0072]5， -CCC AAGCTT CTCGAGGCGCGTCCTCAGA-3’ (HindIII)
[0073]Hsp70-r:
[0074]5’ -G GAATTC GGTCGACTAGAGAGCTTCTT-3’ (EcoRI)
[0075]Product:Length=418+9+7=434bp, GC%=70.6, Ta=58
[0076]得到大小為434bp的Hsp70啟動(dòng)子片段。
[0077]3)將抗腫瘤基因片段亞克隆至步驟I)中得到的輻射誘導(dǎo)的P⑶NA3.1-Egrl-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒中，取代熒光蛋白片段(即EGFP)，得到輻射誘導(dǎo)的抗腫瘤基因真核表達(dá)質(zhì)粒(即 pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK 真核表達(dá)質(zhì)粒)；
[0078]3.1)將 HSV-TK 片段亞克隆至 pCDNA3.Ι-Egrl-EGFP 中，構(gòu)建pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK
[0079]按照前述方法回收HSV-TK片段，然后以EcoR1、XhoI為亞克隆位點(diǎn)，將HSV-TK片段構(gòu)建至 PCDNA3.Ι-Egrl-EGFP 中，取代原來的 EGFP，構(gòu)建 pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK0
[0080]轉(zhuǎn)化后，挑取若干個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定。
[0081]引物對(duì):
[0082]HSV-TK-f:
[0083]5， -G GAATTC GCC ACC ATGGCCTCGTACCCCGGCCAT-3，
[0084]HSV-TK-r:
[0085]5，-CCG CTCGAG TCAGTTAGCCTCCCCCATCT-3J·[0086]Product:Length=I153bp, GC%=65.4, Ta=59.7[0087]將pCDNA3.l-Egrl-HSV-TK ①送去測(cè)序，測(cè)序引物為 Egrl-f、BGH_r，由于 HSV-TK基因序列比較長(zhǎng)，所以需要分別從二端進(jìn)行測(cè)序，將二次測(cè)序分別得到的結(jié)果與HSV-TK模板序列比對(duì)，可知序列完全正確，圖2為5’ -3’的測(cè)序結(jié)果比對(duì)圖，圖3為3’ -5’的測(cè)序結(jié)果對(duì)比圖(SequenceO:HSVTK序列，Sequencel:pCDNA3.1-Egr1-HSVTK-Egr1-f.abl 序列，比對(duì)軟件:Dnassit2.0)。表明 pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK 構(gòu)建成功。
[0088]4)將熱啟動(dòng)子片段亞克隆至pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒上，得到輻射、熱激雙啟動(dòng)子誘導(dǎo)的抗腫瘤基因真核表達(dá)質(zhì)粒(即PCDNA3.l-Egrl-Hsp70-HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒)。
[0089]4.1)構(gòu)建 pCDNA3.l-Egrl-Hsp70-HSV-TK
[0090]回收Hsp70片段，以HindiI1、EcoRI為亞克隆位點(diǎn)，將Hsp70片段構(gòu)建至PCDNA3.Ι-Egrl-EGFP (單啟動(dòng)子對(duì)照)中，構(gòu)建 pCDNA3.1-Egrl-Hsp70-EGFP。
[0091 ] 轉(zhuǎn)化后，挑取若干個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定。
[0092]引物對(duì):
[0093]Hsp70-f:
[0094]5， -CCC AAGCTT CTCGAGGCGCGTCCTCAGA-3’ (HindIII)
[0095]Hsp70-r:
[0096]5， -G GAAT TC GGTCGACTAGAGAGCTTCTT-3’ (EcoRI)
[0097]Product:Length=418+9+7=434bp, GC%=70.6, Ta=58
[0098]擴(kuò)增得到434bp的Hsp70片段。
[0099]將pCDNA3.1-Egr l-Hsp70_EGFP①送去測(cè)序，測(cè)序引物為Egr_f，將其序列與HSV-TK模板序列比對(duì)，可知序列完全正確，表明pCDNA3.1-Egrl-HSV-TK構(gòu)建成功圖4(SequenceO:HSP70 序列，Sequencel:pCDNA3.1-Egr1-HSP7O-EGFP 測(cè)序.abl,比對(duì)軟件:Dnassit2.0)。
[0100]4.2)構(gòu)建 PCDNA3.1-Egr 1-Hsp70-HSV_TK 真核表達(dá)質(zhì)粒
[0101]以HindII1、EcoRI 為亞克隆位點(diǎn)，將 Hsp70 片段從 pCDNA3.1-Egrl-Hsp70-EGFP 上亞克隆至P⑶NA3.1-Egrl-HSV-TK上，轉(zhuǎn)化入DH5 α后，挑取若干個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。
[0102]先用Hindlll、EcoRI酶切鑒定，切出一約450bp的小條帶，表明是正確克隆。
[0103]選取可切得450bp條帶的質(zhì)粒,進(jìn)一步用MluI單酶切鑒定,可切出一約1.6K的小條帶。
[0104]5)按多聚乙烯亞胺負(fù)載的Mnci5Zna5Fe2O4納米粒與福射、熱激雙啟動(dòng)子誘導(dǎo)的抗腫瘤基因真核表達(dá)質(zhì)粒(即PCDNA3.1-Egrl-Hsp70-HSV_TK真核表達(dá)質(zhì)粒)質(zhì)量比為20:1，將二者分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5分鐘以上，然后將二者的稀釋溶液混和均勻，室溫下孵育30分鐘以上，獲得輻射熱激誘導(dǎo)的雙啟動(dòng)子質(zhì)粒磁性復(fù)合納米粒(SPpEgr1-Hsp70-HSV-TK/PE1-MZF-NPs復(fù)合物)，即為抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒。其中，pEgrl-Hsp70-HSV-TK指代輻射熱激誘導(dǎo)的雙啟動(dòng)子質(zhì)粒，PEI指代多聚乙烯亞胺，MZF指代Mntl5Zna5Fe2O4, NPs是英文nanoparticles的縮寫,表示納米粒。
[0105]磁性基因載體PE1-Mna5Zna5Fe2O4納米粒的制備和特性檢測(cè):
[0106]采用改良的化學(xué)共沉淀法，其基本步驟如下:按照Mn:Zn:Fe的摩爾比為0.5:0.5:2的化學(xué)配比，稱取原料ZnSO4.7H20, FeSO4.7H20, MnSO4.H2O,混合后倒入高速研磨杯磨成粉狀，按n (M):n (OH - )=1:2.4 (Μ代表所有金屬離子)的比例稱取所需NaOH的量，倒入上述粉末中并混勻，加入適量雙蒸水，不斷攪拌成糊狀至反應(yīng)完全，室溫放置12h后，80°C干燥，研缽內(nèi)研磨成粉末狀前驅(qū)體，放入馬弗爐中400°C焙燒lh，自然冷卻后用熱蒸餾水浸洗，過濾，用BaCl2檢測(cè)直至濾液中無白色沉淀后，用無水乙醇淋洗一遍，60°C烘干備用。稱量Mnci 5Znci 5Fe2OJg放入IOOmL去離子水中配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的磁流體，超聲分散后磁性分離棄上清。沉淀重懸于PBS液中，超聲分散處理后緩慢加入一定量的PEI充分混勻，然后室溫磁力攪拌3h,使反應(yīng)充分,形成穩(wěn)定的PEI修飾的Mna5Zna5Fe204。用磁分離法將復(fù)合磁性粒子從溶液中分離，并用蒸餾水反復(fù)洗滌，最后乙醇洗滌一次，干燥后得到表面修飾過的MZF納米粒，存放于干燥皿內(nèi)待用。制備的磁性納米材料接近圓形，電鏡圖見圖5，能譜分析發(fā)現(xiàn)Mn，Zn, Fe的摩爾比符合I; 1:4 (見圖6)，將修飾前后的磁性材料置于交變磁場(chǎng)中，進(jìn)行升溫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，二者在40min后上升到43°并保持穩(wěn)定(圖7)，多聚乙烯亞胺修飾前后的納米粒紅外圖譜見圖8，修飾后增加了幾個(gè)特征性的小峰.
[0107]抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒的制備方法及其體外生物學(xué)特性檢測(cè):
[0108]按照上述磁性轉(zhuǎn)染法將pEgrl-Hsp70-HSV-TK基因?qū)際EK293細(xì)胞，2GyX線照射lh、6h、12h、24h和48h后，Real-time PCR法檢測(cè)TK基因表達(dá)量的差異。HEK293細(xì)胞經(jīng)IGy, 2Gy，4Gy，8Gy，16Gy不同劑量X射線照射，6h后收集各組細(xì)胞，檢測(cè)TK基因表達(dá)量的差異.。同樣轉(zhuǎn)染方法將雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pEgrl-Hsp70-HSV-TK導(dǎo)入HEK293細(xì)胞，比較經(jīng)2Gy X線照射聯(lián)合磁熱療，單純輻射，單純磁熱療處理6h后，觀察不同誘導(dǎo)條件對(duì)TK表達(dá)量的影響。磁性轉(zhuǎn)染法將雙啟動(dòng)子的pEgrl-Hsp70-HSV-TK質(zhì)粒導(dǎo)入SMMC7721肝癌細(xì)胞，輻射、加熱誘導(dǎo)后，PCR法檢測(cè)到TK基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0109]實(shí)施例2:基本流程和步驟同實(shí)施例1，不同之處在于，步驟5)中按多聚乙烯亞胺負(fù)載的Mna5Zna5Fe2O4磁性納米顆粒與輻射、熱激雙啟動(dòng)子誘導(dǎo)的抗腫瘤基因真核表達(dá)質(zhì)粒(即pEgrl-Hsp70-HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒)質(zhì)量比為35:1進(jìn)行操作。最終產(chǎn)物的檢驗(yàn)結(jié)果同上。
[0110]實(shí)施例3:基本流程和步驟同實(shí)施例1，不同之處在于，步驟5)中按多聚乙烯亞胺負(fù)載的Mna5Zna5Fe2O4磁性納米顆粒與輻射、熱激雙啟動(dòng)子誘導(dǎo)的抗腫瘤基因真核表達(dá)質(zhì)粒(即pEgrl-Hsp70-HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒)質(zhì)量比為50:1進(jìn)行操作。最終產(chǎn)物的檢驗(yàn)結(jié)果同上。
【權(quán)利要求】
1.一種抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，該方法包括下述步驟: 1)以PlRES-CMVE-EgrlP真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到輻射誘導(dǎo)啟動(dòng)子片段，將其亞克隆至P⑶NA3.1-EGFP質(zhì)粒上，得到p⑶NA3.1-Egrl-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒; 2)以載有熱啟動(dòng)子和自殺基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到熱啟動(dòng)子片段和抗腫瘤基因片段； 3)將抗腫瘤基因片段亞克隆至所述步驟I)中得到的P⑶NA3.1-Egrl-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒中，取代EGFP，得到pCDNA3.1-Egrl- HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒； 4)將熱啟動(dòng)子片段亞克隆至所述P⑶NA3.1-Egrl-HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒上，得到pCDNA3.1-Egrl- Hsp70- HSV-TK 真核表達(dá)質(zhì)粒； 5)按多聚乙烯亞胺負(fù)載的Mna5Zna5Fe2O4納米粒與pCDNA3.1-Egr 1-Hsp70- HSV-TK真核表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)量比為20:1-50:1，將二者分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5分鐘以上，然后將二者的稀釋溶液混和均勻，室溫下孵育30分鐘以上，獲得pEgrl-Hsp70-HSV-TK/PE1-MZF-NPs復(fù)合物，即為抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒。
2.一種抗腫瘤基因磁性復(fù)合納米顆粒，其特征在于，該復(fù)合納米顆粒按照權(quán)利要求1所述方法制備得到。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103667345SQ201310634210
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】張東生, 張佳, 林梅 申請(qǐng)人:東南大學(xué)