一種新型鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種新型鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)及其應(yīng)用，本發(fā)明涉及一種可通過玻璃體腔注射給藥治療眼病的含鼠神經(jīng)生長因子的藥物領(lǐng)域。針對現(xiàn)有鼠神經(jīng)生長因子治療眼病的給藥方式存在的治療效果不理想、副作用大的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)，其特征在于：包含鼠神經(jīng)生長因子和超聲造影劑。本發(fā)明還提供了鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)在制備治療青光眼性視神經(jīng)損害的藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于在超聲輻照下經(jīng)玻璃體腔注射給藥。本發(fā)明提供的這種新的給藥方式具有治療效果好、安全可靠的優(yōu)點，可用于延緩或阻止青光眼性視神經(jīng)損害的發(fā)生發(fā)展。
【專利說明】一種新型鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可通過玻璃體腔注射給藥治療眼病的含鼠神經(jīng)生長因子的藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調(diào)控作用。臨床上可用來治療視神經(jīng)損傷類眼疾。
[0003]鼠神經(jīng)生長因子(mNGF)是從小鼠頜下腺提取的肌肉注射劑型NGF，是國家的I類新藥，純度可達98%以上，與人體NGF的結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，生物學(xué)效應(yīng)無明顯的種間(人與鼠)特異性。臨床上已將其廣泛應(yīng)用于包括視神經(jīng)損傷在內(nèi)的神經(jīng)損傷恢復(fù)的治療。我們希望能夠?qū)⑦@類藥物用于眼底疾病，特別是青光眼的治療研究。對應(yīng)視網(wǎng)膜疾病，只有將鼠神經(jīng)生長因子應(yīng)用于眼局部才會取得理想的治療效果。
[0004]對于眼疾的治療，目前臨床上鼠神經(jīng)生長因子的給藥方式為肌肉注射，需通過全身循環(huán)后才能到達眼部組織，這就導(dǎo)致在眼部的治療效果不理想，同時經(jīng)全身代謝后還會對其他組織器官產(chǎn)生副作用。究其原因可能是由于血眼屏障和眼部解剖的特殊性使藥物在視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的局部有效濃度較低，導(dǎo)致療效不佳，使得其在臨床上的應(yīng)用受到了很大的限制，因此尋求一種讓鼠神經(jīng)生長因子更為有效、更安全地局部應(yīng)用于視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的新型給藥方式，成為了眼疾臨床治療的迫切需求。
[0005]由于血-眼屏 障的存在使得眼球處于一個相對免疫赦免的狀態(tài)，眼內(nèi)注射外源抗體能最小程度引發(fā)潛在的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，因此眼球是局部治療的一個理想器官。而玻璃體腔注射技術(shù)具有眼內(nèi)直接給藥的優(yōu)勢，可避免經(jīng)全身代謝后對其它器官產(chǎn)生的副作用。但是，目前國內(nèi)外尚未見到有關(guān)玻璃體腔注射鼠神經(jīng)生長因子治療眼疾的任何報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對【背景技術(shù)】中提到的現(xiàn)有鼠神經(jīng)生長因子治療眼病的給藥方式存在的治療效果不理想、副作用大的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)，以打破現(xiàn)有的給藥方式，而采用玻璃體腔注射鼠神經(jīng)生長因子的方式治療眼病，這種新的給藥方式具有治療效果好、安全可靠的優(yōu)點。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了這樣一種鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)，其特征在于:包含鼠神經(jīng)生長因子和超聲造影劑。
[0008]進一步地，所述超聲造影劑為六氟化硫微泡。
[0009]本發(fā)明還提供了鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)在制備治療青光眼性視神經(jīng)損害的藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于在超聲輻照下經(jīng)玻璃體腔注射給藥。
[0010]進一步地，所述藥物用于在超聲聲強為0.5W/cm2，輻照時間為30S-60S下經(jīng)玻璃體腔注射給藥。
[0011]進一步地，所述藥物的注射劑量為12ug/kg的鼠神經(jīng)生長因子。
[0012]進一步地，所述藥物為鼠神經(jīng)生長因子與超聲造影劑的穩(wěn)定混懸劑。
[0013]更進一步地，所述混懸劑中鼠神經(jīng)生長因子與超聲造影劑1:1混合。
[0014]有益效果:
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種新型超聲微泡介導(dǎo)的鼠神經(jīng)生長因子眼科局部給藥系統(tǒng)，通過玻璃體腔注射給藥，讓藥物到達眼部的途徑變得更單純，不用經(jīng)過全身代謝，避免藥物經(jīng)血液循環(huán)時所面臨的分解及機體內(nèi)環(huán)境對藥物的干擾和破壞過程，從而最大限度地保證到達靶器官的藥物濃度，發(fā)揮最大的治療作用，提高視網(wǎng)膜局部的藥物濃度的同時，也減少了全身毒副作用，減少了給藥次數(shù)，延緩或阻止青光眼視性神經(jīng)損害的發(fā)生發(fā)展，給青光眼患者帶來更有效的治療，減少其致盲率，為患者復(fù)明帶來新的希望，大大拓寬了青光眼視神經(jīng)保護治療的視野，提供了一種新思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是不同造模周期眼壓變化曲線圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋，本發(fā)明并不局限于以下實施例。
[0018]鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射用藥物:
[0019]六氟化硫微泡與鼠神經(jīng)生長因子1:1溶于生理鹽水中得到的穩(wěn)定混懸液
[0020]上述藥物經(jīng)玻璃體腔注射給藥的方法:
[0021]愛爾卡因滴眼液表面麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼散瞳，在手術(shù)顯微鏡下，于上方角鞏膜緣處透明角膜區(qū)隧道穿刺抽出適量房水，于上方角鞏膜緣3_垂直鞏膜進針，刺入玻璃體腔，經(jīng)散大的瞳孔明確針尖在玻璃體腔后，緩慢注入上述藥物，注射劑量為12ug/kg的鼠神經(jīng)生長因子，棉簽按壓進針處，抽出針頭，給予泰利必妥滴眼液點眼預(yù)防感染。閉合眼瞼后涂耦合劑，置超聲探頭于眼瞼表面進行超聲輻照，超聲聲強為0.5W/cm2，輻照時間為 30s_60s。
[0022]本發(fā)明提供的鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)治療青光眼性視神經(jīng)損害的藥效學(xué)實驗:
[0023]本研究首先構(gòu)建了兔眼高眼壓視神經(jīng)損害模型，然后將超聲爆破微泡與鼠神經(jīng)生長因子聯(lián)合，觀察超聲爆破微泡介導(dǎo)鼠神經(jīng)生長因子對高眼壓兔視神經(jīng)損害的治療作用，并分析該給藥系統(tǒng)的安全性、可行性和有效性，為臨床治療青光眼提供了一種新思路。
[0024]實驗材料
[0025]一、主要試劑
[0026]注射用鼠神經(jīng)生長因子(18ug)廈門北大之路生物工程有限公司
六氟化疏微:泡意大利Braceo公司
卡波姆-940北京國人逸康科技有限公司
10%甲醛組織固定液深圳市眼科醫(yī)院病理科
2.5%戌二醛組織固定液中山大學(xué)電鏡室
曱苯胺藍(lán)上?？笊锛夹g(shù)有限公司
山羊抗鼠IgG抗體-HRP多聚體北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司
Bax鼠單抗廣州深達生物制品技術(shù)有限公司
Bcl-2鼠單抗廣州深達生物制品技術(shù)有限公司
Abeam TUNEL試劑盒廣東新晉生物科技公司
免疫組化試劑盒廣東新晉生物科技公司
[0027]
RNAiso? Pl^is提取試劑盒美國TaKara公司
ReverTra Ace-(x-反轉(zhuǎn)錄試劑盒TOYOBO公司
SYBR Premix Ex TaqTM GC (2x)美國 Takara 公司
NO試劑盒北京北瑞達醫(yī)藥科技有限公司
SOD試劑盒南京建成生物工程研究所
MDA試劑盒上海瑞齊生物科技有限公司
二氯曱烷濟南欣雨化工有限公司
甲醇北京威特化工有限公司
乙腈北京威特化工有限公司
無水乙醇深圳市歐泰華化工有限公司
三氟乙酸深圳市歐泰華化工有限公司
[0028] 二、主要設(shè)備和儀器
[0029]Cirrus頻域OCT卡爾蔡司公司
ROLAND視覺電生理儀德國羅蘭
裂隙燈彩色前節(jié)照相系統(tǒng)高視遠(yuǎn)望科技有限公司
手持式直接眼底鏡蘇州醫(yī)療器械設(shè)備廠
免散瞳眼底彩色照相系統(tǒng)日本TOPCON公司
Tono-pen筆試眼壓計美國Reichert公司
40C電冰箱青島海爾股份有限公司
電子分析天平德國Sartorius公司
-80 °C超低溫冰箱:三洋低溫冰箱
超聲粉碎儀美國Sonics & Materials公司
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超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像研究所
工作超凈臺蘇州凈化設(shè)備有限公司
分光光度計深圳鼎鑫宜實驗設(shè)備有限公司
微量移液器深圳泰賽克生物科技有限公司
全自動熒光PCR儀美國ABI公司
數(shù)顯恒溫水浴鍋北京醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司
[0030]
無菌針灸針蘇州醫(yī)療用品有限公司
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Hypersil ODS柱廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司
Diamonsil ClB北京迪馬科技有限公司
石蠟組織切片機德國LEICA公司
冰凍組織切片機德國LEICA公司
焚光顯微鏡OLYMPUS公司
電熱恒溫千燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司
[0031]三、實驗動物
[0032]健康新西蘭白兔體重1.5kg，雌雄不限，由廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供，用裂隙
燈、直接眼底鏡檢查眼前節(jié)及眼底無明顯異常Jono-pen筆試眼壓計測量眼壓< 21mmHg的
動物方可采用?！0033]實驗方法與步驟
[0034]一、實驗動物分組
[0035]健康新西蘭大白兔25只，隨機分為5組，每組5只(10眼)。分組如下:
[0036]1、空白對照組
[0037]2、高眼壓模型組
[0038]3、高眼壓模型+玻璃體腔注射mNGF組
[0039]4、高眼壓模型+玻璃體腔注射mNGF+超聲組
[0040]5、高眼壓模型+玻璃體腔注射mNGF+超聲+微泡組
[0041]二、兔慢性高眼壓模型的制備
[0042]耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(lml/kg)麻醉動物，愛爾卡因滴眼液眼部表面麻醉后，開瞼器開瞼，用Iml注射器在9點位沿角鞏膜緣內(nèi)Imm抽出前房房水0.2ml后，然后在對側(cè)的角鞏膜緣內(nèi)Imm前房注入0.3%復(fù)方卡波姆溶液0.2ml。術(shù)畢泰利必妥眼水滴眼。如在實驗周期中發(fā)現(xiàn)眼壓< 22mmHg，7天后按上述方法重復(fù)注藥I次。高眼壓兔視神經(jīng)損害模型以眼壓> 22mmHg，并能維持4周為標(biāo)準(zhǔn)。采用Tono-pen筆式眼壓計測量每日相同時間點眼壓并記錄。
[0043]三、溶液的配制
[0044]( I)復(fù)方卡波姆溶液的配制
[0045]稱取3.0g卡波姆-940和0.25g地塞米松，溶于1000ml的生理鹽水中，PH為4。
[0046](2)注射用鼠神經(jīng)生長因子溶液的配制
[0047]用滅菌注射用水溶解注射用鼠神經(jīng)生長因子，給予兔玻璃體腔內(nèi)注射18ug/0.1ml的注射用鼠神經(jīng)生長因子溶液。
[0048]( 3)微泡混懸液的制備
[0049]用0.9%生理鹽水5ml緩慢注入六氟化硫微泡凍干粉瓶內(nèi)靜置備用，使用前用力振搖以產(chǎn)生微泡，微泡濃度為2 X 108/ml，微泡平均直徑2.5 ii m，90%的微泡直徑< 8 y m，滲透壓為2900sm/kg，與人體血漿等滲，配制的微泡溶液在6h內(nèi)用完。
[0050]四、各組的處理
[0051](1)空白對照組
[0052]玻璃體腔內(nèi)注射PBS液0.1ml:愛爾卡因滴眼液表面麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼充分散瞳，開瞼器開瞼，3%碘伏沖洗結(jié)膜囊，無菌條件下用Iml注射器于上方角鞏膜緣處透明角膜區(qū)隧道穿刺抽出適量房水，然后于上方角鞏膜緣后3_垂直鞏膜進針，刺入玻璃體腔，經(jīng)散大的瞳孔明確針尖在玻璃體腔后，緩慢注入0.1ml PBS液，棉簽按壓進針處，抽出針頭，觀察眼壓及眼部血管充盈情況，給予氧氟沙星滴眼液點眼，迪可羅眼膏涂眼預(yù)防感染。上述操作每周I次，持續(xù)3周。
[0053](2)高眼壓模型組
[0054]不做處理。
[0055](3 )高眼壓模型+玻璃體腔注射mNGF組
[0056]愛爾卡因滴眼液表面麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼充分散瞳，開瞼器開瞼，3%碘伏沖洗結(jié)膜囊，無菌條件下用Iml注射器于上方角鞏膜緣處透明角膜區(qū)隧道穿刺抽出適量房水，然后于上方角鞏膜緣后3_垂直鞏膜進針，刺入玻璃體腔，經(jīng)散大的瞳孔明確針尖在玻璃體腔后，緩慢注入0.1ml mNGF溶液，棉簽按壓進針處，抽出針頭，觀察眼壓及眼部血管充盈情況，給予氧氟沙星滴眼液點眼，迪可羅眼膏涂眼預(yù)防感染。上述操作每周I次，持續(xù)3周。
[0057](4)高眼壓模型+玻璃體腔注射mNGF+超聲組
[0058]玻璃體腔注射mNGF方法同上，注射完畢后閉合兔眼后涂耦合劑，置超聲探頭于眼球上方立即用頻率1MHZ，聲強為0.5ff/cm2照射眼球60s，上述操作每周I次，持續(xù)3周。
[0059](5 )高眼壓模型+玻璃體腔注射mNGF+超聲+微泡組
[0060]兔散瞳、麻醉方式同前，用Iml注射器距角鞏膜緣3mm處刺入玻璃體腔吸出相應(yīng)量的玻璃體液后，注入0.1ml mNGF溶液，具體操作方法同上；再從相同部位注入0.1ml微泡混懸液，閉合兔眼后涂耦合劑，給予上述參數(shù)的超聲輻照，每周I次，持續(xù)3周。
[0061]實驗結(jié)果
[0062]一、眼壓測量
[0063]如表1所示，造模前模型組眼壓為15.0±2.0mmHg，對照組眼壓為13.6±1.5mmHg,兩者相比眼壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.137);經(jīng)獨立樣本t檢驗，模型組眼壓在造模后I周、
2周、4 周的眼壓值(33.4±2.8,34.1±2.5 和 34.8±2.2mmHg)，與對照組眼壓(13.6±1.8、13.4± 1.7、13.3± 1.4mmHg)相比差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。從圖1可見，該模型所致眼壓升高可維持在30mmHg以上達4周。
[0064]表1對照眼與模型眼不同造模時間眼壓比較(i±s,mmHg)
【權(quán)利要求】
1.一種新型鼠神經(jīng)生長因子玻璃體腔注射給藥系統(tǒng)，其特征在于:包含鼠神經(jīng)生長因子和超聲造影劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于:所述超聲造影劑為六氟化硫微泡。
3.權(quán)利要求1或2所述的給藥系統(tǒng)在制備治療青光眼性視神經(jīng)損害的藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于在超聲輻照下經(jīng)玻璃體腔注射給藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述藥物用于在超聲聲強為0.5W/cm2，輻照時間為30s-60s下經(jīng)玻璃體腔注射給藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述藥物的注射劑量為12ug/kg的鼠神經(jīng)生長因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述藥物為鼠神經(jīng)生長因子與超聲造影劑的穩(wěn)定混懸劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述混懸劑中鼠神經(jīng)生長因子與超聲造影劑1:1混合。`
【文檔編號】A61P9/10GK103656621SQ201310637672
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】黃麗娜, 申曉麗, 馬大卉, 趙軍, 賴銘瑩 申請人:黃麗娜