ADM-bFGF復(fù)合體及運(yùn)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程中動(dòng)物皮膚組織脫細(xì)胞【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說是一種ADM-bFGF復(fù)合體及運(yùn)用；將動(dòng)物皮膚組織在含有SDS和NaOH溶液中處理以后得到ADM；將bFGFDNA置于脂質(zhì)體包裹后，再和ADM放一起，通過靜電吸附，使bFGFDNA附著在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上，形成ADM-bFGF復(fù)合體；本發(fā)明經(jīng)過大量的驗(yàn)證，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)適用于創(chuàng)面、肉芽創(chuàng)面和慢性潰瘍及褥瘡的覆蓋，起到防止水分蒸發(fā)、蛋白質(zhì)和熱量流失，預(yù)防微生物感染，促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用；該脫細(xì)胞真皮基質(zhì)生物兼容性好，無免疫原性或低免疫原性、無毒、無過敏，使用安全、方便。
【專利說明】ADM-bFGF復(fù)合體及運(yùn)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程中動(dòng)物皮膚組織脫細(xì)胞【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說是一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)-堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子復(fù)合體(ADM-bFGF復(fù)合體)及運(yùn)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著世界各國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，居民生活水平的提高，由飲食結(jié)構(gòu)的改變、日趨緊張的生活節(jié)奏以及少動(dòng)多坐的生活式等諸多因素，全球糖尿病發(fā)病率及患病率增長(zhǎng)迅速，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康慢性疾病。糖尿病患者皮膚易受損傷，損傷后往往反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，形成頑固難愈性潰瘍。但是由于對(duì)于糖尿病所致創(chuàng)面難愈的機(jī)制尚不清楚，因此常規(guī)治療往往不能達(dá)到預(yù)期效果。近年來，隨著對(duì)創(chuàng)面愈合過程中生長(zhǎng)因子變化的深入研究，有作者認(rèn)為糖尿病創(chuàng)面生長(zhǎng)因子及其受體絕對(duì)或相對(duì)減少是糖尿病并發(fā)創(chuàng)面難愈的重要原因。因此，如何促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合成為臨床急需解決的重要課題之一。
[0003]皮膚創(chuàng)口愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，通常是由成纖維細(xì)胞增殖分化、新生血管的形成、細(xì)胞外基質(zhì)纖維化和表皮細(xì)胞增生覆蓋創(chuàng)面等綜合作用的結(jié)果。生長(zhǎng)因子是一系列具有多種功能的活性肽類物質(zhì)，它們促進(jìn)或抑制著細(xì)胞的增殖與分化，同時(shí)也是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用的重要物質(zhì)。在整個(gè)創(chuàng)面愈合過程中，它們影響細(xì)胞的遷移、增殖和分化，調(diào)控著細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，引導(dǎo)和調(diào)整創(chuàng)傷愈合的反應(yīng)。
[0004]研究認(rèn)為纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF, fibroblast growth factor)調(diào)控著創(chuàng)面愈合的各個(gè)階段，對(duì)應(yīng)用于治療慢性難愈性創(chuàng)面和大面積燒傷創(chuàng)面有著廣闊的前景。在皮膚創(chuàng)傷早期，F(xiàn)GF家族的酸性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acid fibroblast growth factor ,aFGF)、喊性纖維母細(xì) 胞生長(zhǎng)因子(base fibroblast growth factor bFGF)、FGF7 和 FGF10等表達(dá)均明顯上調(diào)，提示它們可能參與了皮膚創(chuàng)傷愈合過程。FGF與FGF結(jié)合蛋白(FGFbinding protein,FGF-BP)結(jié)合在皮膚修復(fù)過程中起重要作用，皮膚損傷后FGF-BP表達(dá)增加，尤其是傷口部位的角質(zhì)化細(xì)胞，F(xiàn)GF-BP能夠與FGF7、FGF10和FGF22相互作用，增強(qiáng)低濃度FGF7、FGF10和FGF22的活性。
[0005]bFGF屬于FGF家族，是由154個(gè)氨基酸組成的陰離子多肽類生長(zhǎng)因子，包括9個(gè)FGF配基，具有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其定位于第四號(hào)染色體。bFGF由于翻譯位點(diǎn)的不同(分別為AUG和CUG)，使不同來源的bFGF結(jié)構(gòu)上存在一定差異，形成了 18000、22000、24000、26000四種同工異構(gòu)體，18000的bFGF是主要的活性形式，位于胞漿，24000、26000的bFGF位于細(xì)胞核。bFGF廣泛地分布于中胚層和神經(jīng)外胚層的多種組織和器官，包括血管基底膜和細(xì)胞間基質(zhì)。林紹華等通過研究20例正常成人皮膚組織，結(jié)果表明正常成人皮膚組織均表達(dá)bFGF，并且發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞主要分布于基底層及其上方少量棘細(xì)胞，呈中陽性強(qiáng)度表達(dá)。此外，真皮少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞、部分成纖維細(xì)胞和胞外基質(zhì)也有陽性表達(dá)。微循環(huán)障礙是糖尿病微血管病變的典型改變之一，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整是穩(wěn)定微循環(huán)的關(guān)鍵。在機(jī)體發(fā)生創(chuàng)傷后，創(chuàng)傷部位的新生血管給創(chuàng)傷部位提供氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性蛋白，局部組織的缺血可直接影響創(chuàng)傷愈合的程度及其預(yù)后。它與血管內(nèi)皮細(xì)胞因子(VEGF)、bFGF、血管形成因子-1 (Ang-1)等細(xì)胞因子密切相關(guān)。bFGF作為重要的促有絲分裂原，能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，加速細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)新毛細(xì)血管形成。另外，bFGF還能通過促進(jìn)VEGF基因表達(dá)，誘導(dǎo)新生血管形成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)-堿性母細(xì)胞生長(zhǎng)因子復(fù)合體(ADM-bFGF復(fù)合體)，該ADM-bFGF復(fù)合體在糖尿病創(chuàng)面早期愈合時(shí)，具有加快創(chuàng)面愈合的作用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種ADM-bFGF復(fù)合體，該ADM-bFGF復(fù)合體經(jīng)過以下步驟獲得:
(1)將動(dòng)物皮膚組織在SDS濃度為0.0087M/L~1.0000M/L、NaOH濃度0.01M/L~
1.00M/L的溶液在25°C~42°C溫度條件下處理12~72小時(shí)得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)；
(2)將bFGFDNA置于脂質(zhì)體包裹后，再和步驟(1)中脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)放一起，通過靜電吸附，使bFGF DNA附著在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)上，形成ADM-bFGF復(fù)合體。
[0008]進(jìn)一步的，所述步驟(1)中SDS濃度為0.0087M/L，NaOH濃度0.01M/L，溫度為37°C，處理時(shí)間24小時(shí)。
[0009]本發(fā)明的另一目的 是提供一種ADM-bFGF復(fù)合體在創(chuàng)面愈合治療中的運(yùn)用。
[0010]進(jìn)一步的，所述ADM-bFGF復(fù)合體在糖尿病創(chuàng)面早期愈合治療中的運(yùn)用。
[0011]本發(fā)明運(yùn)用于糖尿病創(chuàng)面早期愈合治療中作用機(jī)理:研究證明bFGF對(duì)創(chuàng)面愈合有明顯的促修復(fù)作用，其機(jī)制為:①促進(jìn)了創(chuàng)面表皮細(xì)胞的分裂、增殖，加速了創(chuàng)面上皮化過程，使再生表皮增厚，促進(jìn)細(xì)胞分化，創(chuàng)面封閉時(shí)間提前；②促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速組織血管化進(jìn)程；③促進(jìn)成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面的趨化、增殖和分化，促進(jìn)其合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，使膠原合成時(shí)間提前，組織排列有序；④真皮形成加速也有利于表皮的及早修復(fù)。
[0012]脫細(xì)胞真皮基質(zhì)形成了基底膜與真皮兩個(gè)面，真皮面有利于ADM的快速血管化，基底膜面可為上皮細(xì)胞的移行和定植提供一個(gè)天然平面，有利于ADM的上皮化，作為一個(gè)模板使病人自身的成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等宿主細(xì)胞重新長(zhǎng)入，形成新生血管。
[0013]十二烷基硫酸鈉(SDS),又名月桂醇硫酸鈉(sodium laurylsulfate, SLS),屬硫酸酯鹽，分子量為288.38，本品為白色或淡黃色結(jié)晶，極易溶于水。SDS最常見的用途是作為蛋白質(zhì)的變性劑和助溶性試劑(如SDS-PAGE)，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而幾乎所有的蛋白質(zhì)均可以溶解在SDS中，甚至包括疏水和變性的蛋白質(zhì)。因此，SDS可用作生物膜的有效溶解劑，脫去真皮中的細(xì)胞成分。
[0014]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明經(jīng)過大量的驗(yàn)證，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)適用于創(chuàng)面、肉芽創(chuàng)面和慢性潰瘍及褥瘡的覆蓋，起到防止水分蒸發(fā)、蛋白質(zhì)和熱量流失，預(yù)防微生物感染，促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。該脫細(xì)胞真皮基質(zhì)生物兼容性好，無免疫原性或低免疫原性、無毒、無過敏，使用安全、方便。
【具體實(shí)施方式】[0015]下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明；
實(shí)施實(shí)例I
(1)將動(dòng)物皮膚組織在SDS濃度為0.0087M/L、NaOH濃度0.01M/L的溶液在37°C溫度條件下浸泡24小時(shí)得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)；
(2)將bFGFDNA置于脂質(zhì)體包裹后，再和步驟(1)中脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)放一起，通過靜電吸附，使bFGF DNA附著在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)上，形成ADM-bFGF復(fù)合體。
[0016]實(shí)施實(shí)例2
(1)將動(dòng)物皮膚組織在SDS濃度為0.0087M/L、NaOH濃度0.01M/L的溶液在25°C溫度條件下浸泡12小時(shí)得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)；
(2)將bFGFDNA置于脂質(zhì)體包裹后，再和步驟(1)中脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)放一起，通過靜電吸附，使bFGF DNA附著在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)上，形成ADM-bFGF復(fù)合體。
[0017]實(shí)施實(shí)例3
(1)將動(dòng)物皮膚組織在SDS濃度為1M/L、NaOH濃度1M/L的溶液在37°C溫度條件下浸泡24小時(shí)得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)；
(2)將bFGFDNA置于脂質(zhì)體包裹后，再和步驟(1)中脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)放一起，通過靜電吸附，使bFGF DNA附著在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)上，形成ADM-bFGF復(fù)合體。
[0018]實(shí)施實(shí)例4·
(1)將動(dòng)物皮膚組織在SDS濃度為0.0087M/L、NaOH濃度0.01M/L的溶液在42°C溫度條件下浸泡72小時(shí)得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)；
(2)將bFGFDNA置于脂質(zhì)體包裹后，再和步驟(1)中脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)放一起，通過靜電吸附，使bFGF DNA附著在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)上，形成ADM-bFGF復(fù)合體。
【權(quán)利要求】
1.ADM-bFGF復(fù)合體，其特征在于，該ADM-bFGF復(fù)合體經(jīng)過以下步驟獲得: (I)將動(dòng)物皮膚組織在SDS濃度為0.0087M/L~1.0000M/L, NaOH濃度0.01M/L~1.00M/L的溶液在25°C~42°C溫度條件下處理12~72小時(shí)得到ADM ； (2MfbFGF DNA置于脂質(zhì)體包裹后，再和步驟(1)中ADM放一起，通 過靜電吸附，使bFGFDNA附著在ADM上，形成ADM-bFGF復(fù)合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述ADM-bFGF復(fù)合體，其特征在于，所述步驟(1)中SDS濃度為0.0087M/L, NaOH濃度0.01M/L，溫度為37°C，處理時(shí)間24小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ADM-bFGF復(fù)合體在創(chuàng)面愈合治療中的運(yùn)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ADM-bFGF復(fù)合體在創(chuàng)面愈合治療中的運(yùn)用，其特征在于，所述ADM-bFGF復(fù)合體在糖尿病創(chuàng)面早期愈合治療中的運(yùn)用。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK103656751SQ201310647133
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】段升華 申請(qǐng)人:中山奈德生物科技有限公司