一種竹節(jié)參皂苷及其制備方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用作疫苗佐劑的竹節(jié)參皂苷及其制備方法與它的用途，該方法包括竹節(jié)參提取、萃取分離與樹脂吸附等步驟。本發(fā)明把竹節(jié)參總皂苷進(jìn)一步分離純化，改進(jìn)以往只用總皂苷成分并未對(duì)其主要成分進(jìn)行研究的缺點(diǎn)，本發(fā)明正是以此為出發(fā)點(diǎn)，解決了經(jīng)常困擾人們不清楚用藥成分的問題；本發(fā)明中竹節(jié)參皂苷活性部位具有非常明顯的免疫佐劑作用，為開發(fā)新型疫苗佐劑指明了方向。
【專利說明】一種竹節(jié)參皂苷及其制備方法與用途
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗佐劑【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，本發(fā)明涉及一種用作疫苗佐劑的竹節(jié)參皂苷，還涉及所述竹節(jié)參皂苷的制備方法，還涉及所述竹節(jié)參皂苷的用途。
【【背景技術(shù)】】
[0002]竹節(jié)參系五加科人參屬植物竹節(jié)參的干燥呈竹鞭狀根莖，為我國(guó)的名貴特產(chǎn)少常用的中藥材之一。竹節(jié)參多生長(zhǎng)在海拔1000m以上的闊葉疏林陰濕地或巖石、溝澗旁邊，對(duì)土壤條件要求較高，適宜在中性或微酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，喜腐殖質(zhì)層厚、疏松肥沃、排水良好的沙壤土。在云南、貴州、四川、湖北、陜西、甘肅、河南、浙江、安徽、江西等省民間有較長(zhǎng)的應(yīng)用歷史，還有少量出口香港。有滋補(bǔ)強(qiáng)壯，散瘀止痛，止血祛痰的功效，也是土家族著名民族藥，一直被湖北恩施土家族先民奉為“草藥之王”。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)研究深入，竹節(jié)參的主要功效已經(jīng)逐步地體現(xiàn)在某一類成分，甚至到某種成分上。竹節(jié)參的主要有效成分為竹節(jié)參皂苷和皂苷類。在現(xiàn)有技術(shù)中也記載了竹節(jié)參皂苷的制備方法，例如CN101732379A公開了 DlOl大孔吸附樹脂富集純化竹節(jié)參總皂苷工藝，它只是介紹了提取工藝；CN102247416A公開了竹節(jié)參總皂苷的降血脂作用。未見報(bào)道竹節(jié)參皂苷用于疫苗佐劑。
[0003]目前，用于人用疫苗的佐劑為鋁鹽佐劑(主要是氫氧化鋁及其磷酸鹽，Alum)。鋁鹽佐劑作為人類疫苗佐劑已使用了幾十年，成為人用疫苗中常用的佐劑，具有良好的佐劑效果。隨著新型疫苗的不斷出現(xiàn)，鋁鹽佐劑顯現(xiàn)出一些問題，其中包括:(I)因其理化性質(zhì)特點(diǎn)，鋁鹽疫苗冷凍后膠體狀態(tài)被破壞，因此不能冷凍干燥和在低溫狀態(tài)下運(yùn)輸，但現(xiàn)在的很多多肽疫苗必須要低溫保存。(2)因含鹽量高，貯存日久有結(jié)晶沉淀，使制備的疫苗穩(wěn)定性得不到保障。(3)鋁鹽對(duì)人、畜的神經(jīng)系統(tǒng)可能有影響。(4)在注射部位有時(shí)會(huì)發(fā)生局部無菌性膿腫，甚至可以形成 肉芽腫，輕度局部反應(yīng)較為常見。(5)對(duì)腫瘤疫苗不適合，以鋁鹽佐劑作疫苗主要適用于以抗體為保護(hù)性免疫的疫苗。(6)鋁鹽佐劑釋放抗原物質(zhì)的速度緩慢，效應(yīng)也比較弱，對(duì)許多可溶性抗原都不夠有效，對(duì)抗原的要求比較高。因此研究新型疫苗佐劑是制備新型疫苗的重要環(huán)節(jié)。
[0004]從植物中提取皂苷可以激活哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，其免疫佐劑活性受到廣泛關(guān)注。皂苷QS-21是最具代表性的物質(zhì)，其研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。皂苷QS-21是南美的植物中提取物皂樹皮皂苷(Quil A)的主要成分，研究表明其產(chǎn)生抗體應(yīng)答持續(xù)保護(hù)時(shí)間要比鋁鹽佐劑長(zhǎng)，因此可以作為鋁鹽佐劑替代物。但是，Quil A存在嚴(yán)重的毒性，對(duì)小鼠的致死量在100-125 μ g，除此還有嚴(yán)重的溶血性，在注射部位可引起肉芽腫和注射部位癥狀，所以限制了在人用疫苗中的使用。至今，從Quil A中分離得到23種單體化合物。皂昔QS-21對(duì)小鼠的致死劑量是500yg，毒性雖小于Quil A，但是它還是僅用于腫瘤疫苗中。而且，皂苷QS-21等分子結(jié)構(gòu)中存在酷鍵結(jié)構(gòu)影響了其穩(wěn)定性。因而，人們?cè)絹碓疥P(guān)注從其它植物中尋找具免疫佐劑活性且毒性相對(duì)較低的皂苷。
[0005]本發(fā)明竹節(jié)參皂苷制備方法對(duì)竹節(jié)參總皂苷進(jìn)一步分離純化，改進(jìn)以往只用總皂苷成分并未對(duì)其主要成分進(jìn)行研究的缺點(diǎn)，本發(fā)明正是以此為出發(fā)點(diǎn)，解決了經(jīng)常困擾人們不清楚用藥成分的問題；本發(fā)明方法制備得到的竹節(jié)參皂苷活性部位具有非常明顯的免疫佐劑作用，為開發(fā)新型疫苗佐劑指明了方向。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006][要解決的技術(shù)問題]
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種竹節(jié)參皂苷。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述竹節(jié)參皂苷的制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述竹節(jié)參皂苷的用途。
[0010][技術(shù)方案]
[0011]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0012]本發(fā)明涉及一種用作疫苗佐劑的竹節(jié)參皂苷的制備方法。
[0013]該制備方法包括如下步驟:
[0014]A、竹節(jié)參提取
[0015]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:5~15，將粉碎竹節(jié)參浸泡在體積分?jǐn)?shù)為55~85%乙醇水溶液中，浸泡2~5h，再加熱回流提取2~5次，每次I~5h，合并提取液，再減壓濃縮至提取液無醇味，得到一種濃縮液；
[0016]B、萃取分離
[0017]步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1:1~4用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著減壓濃縮，真空干燥，于是得到正丁醇萃取物；
[0018]C、樹脂吸附
[0019]在樹脂柱中，將大孔吸附樹脂浸泡在乙醇中20~24h，然后用乙醇水溶液洗脫至流出液不渾濁，再用水洗至無乙醇味，接著將大孔吸附樹脂浸泡在以重量計(jì)4~6%HCL水溶液中2~4h，用水洗至中性，然后將大孔吸附樹脂浸泡在以重量計(jì)I~3%Na0H水溶液中2~4h，用水洗至中性備用；
[0020]步驟B得到的正丁醇萃取物吸附條件如下:樹脂柱的徑高比為1:8~12，上樣量為0.05~0.15g生藥/毫升柱體積，上樣后靜置過夜，在DlOl大孔吸附樹脂吸附飽和后，使用乙醇水溶液進(jìn)行洗脫；
[0021]洗脫條件如下:先用水沖洗至流出液無色,再用體積分?jǐn)?shù)為80~95%的乙醇水溶液洗脫，洗脫體積為2~4倍柱體積，洗脫流量0.8~1.2mL/min ;得到的洗脫物進(jìn)行減壓濃縮，然后真空干燥，其產(chǎn)物是所述的竹節(jié)參皂苷。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟A中，所述竹節(jié)參粉碎粒度是20-40目。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟A中，竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比是1:8~12。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟A中，所述乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為62 ~75%。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟B中，所述的減壓濃縮是在壓力
0.001~0.01MPa下進(jìn)行的，所述的干燥是在壓力0.01~0.1MPa與溫度30~50°C的條件下進(jìn)行。[0026]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟B中，所述濃縮液與正丁醇的體積比是 1:1.8 ~3.2。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟C中，所述的大孔吸附樹脂是DlOl大孔吸附樹脂。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟C中，所述的減壓濃縮是在壓力
0.001~0.01MPa下進(jìn)行的，所述的干燥是在壓力0.01~0.1MPa與溫度30~50°C的條件下進(jìn)行干燥。
[0029]本發(fā)明還涉及采用所述制備方法得到的竹節(jié)參皂苷。
[0030]本發(fā)明還涉及所述的竹節(jié)參皂苷在制備疫苗佐劑中的用途。
[0031 ] 下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0032]本發(fā)明涉及一種用作疫苗佐劑的竹節(jié)參皂苷的制備方法。
[0033]該制備方法包括如下步驟:
[0034]A、竹節(jié)參提取
[0035]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:5~15，將粉碎竹節(jié)參浸泡在體積分?jǐn)?shù)為55~85%乙醇水溶液中，浸泡2~5h，再加熱回流提取2~5次，每次I~5h，合并提取液，再減壓濃縮至提取液無醇味，得到一種濃縮液；
[0036]所述的竹節(jié)參原料是目前我國(guó)市場(chǎng)上銷售的竹節(jié)參中藥材，例如湖北省恩施州宣恩椿木營(yíng)竹節(jié)參種植基地種植的竹節(jié)參。通常，竹節(jié)參中藥材需要進(jìn)行常規(guī)挑選、清洗、干燥等預(yù)處理后，再使用在中藥材加工【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的粉碎機(jī)對(duì)干燥竹節(jié)參的進(jìn)行粉碎，粉碎的竹節(jié)參再用標(biāo)準(zhǔn)篩進(jìn)行篩分，收集20-40目竹節(jié)參粉作為本發(fā)明方法的處理原料。
[0037]根據(jù)本發(fā)明，用乙醇處理竹節(jié)參的作用在于將竹節(jié)參的有效成分皂苷提取出來。
[0038]在本發(fā)明中，使用體積分?jǐn)?shù)為55~85%乙醇水溶液浸泡竹節(jié)參粉，如果乙醇水溶液的濃度超過85%，則會(huì)使皂苷含量降低，且脂溶性色素等雜質(zhì)含量升高；如果乙醇水溶液的濃度低于55%，則會(huì)使皂苷雜質(zhì)增加；因此，乙醇水溶液的濃度為55~85%是合適的，乙醇水溶液的濃度優(yōu)選地是60~80%，更優(yōu)選地是62~75%。
[0039]在用乙醇處理竹節(jié)參時(shí)，竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比優(yōu)選地是1:6~14，浸泡
2.6~4.5h,更優(yōu)選地是1:8~12，浸泡3.2~3.8h。
[0040]在這個(gè)步驟中，每次加熱回流提取時(shí)間優(yōu)選地是1.8~4.2h，更優(yōu)選地是2.5~
3.6h0
[0041 ] 用乙醇處理竹節(jié)參所使用的設(shè)備是目前市場(chǎng)上普遍銷售的圓底燒瓶(或常規(guī)化學(xué)處理化工設(shè)備)，例如由蜀牛玻璃儀器公司以商品名圓底燒瓶銷售的產(chǎn)品。
[0042]用乙醇處理竹節(jié)參所使用的加熱回流提取設(shè)備是目前市場(chǎng)上銷售的加熱套(或常規(guī)加熱回流提取化工設(shè)備)，例如由鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司以商品名銷售的電熱套
女口
廣叩ο
[0043]根據(jù)本發(fā)明，在壓力0.001~0.01MPa與室溫的條件下進(jìn)行減壓濃縮。在減壓濃縮時(shí)所使用的設(shè)備是目前市場(chǎng)上銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，例如由上海亞榮生化儀器廠公司以商品名RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀銷售的產(chǎn)品。
[0044]B、萃取分離[0045]步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1:1~4用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著減壓濃縮，真空干燥，于是得到正丁醇萃取物；
[0046]根據(jù)本發(fā)明，使用正丁醇萃取的目的在于使溶于有機(jī)溶劑正丁醇的皂苷萃取出來。
[0047]在本發(fā)明中，所述濃縮液與正丁醇的體積比優(yōu)選地是1:1.8~3.2，更優(yōu)選地是1:2.2 ~2.8。
[0048]在本發(fā)明中，在用正丁醇萃取時(shí)，讓在萃取設(shè)備中的正丁醇與所述濃縮液充分混合，在這種混合過程中，所述濃縮液的有效成分在兩相之間進(jìn)行分配，即從所述濃縮液轉(zhuǎn)移到正丁醇中，從而實(shí)現(xiàn)有效成分的分離。
[0049]在本發(fā)明中用正丁醇萃取時(shí)所使用的設(shè)備是目前市場(chǎng)上銷售的分液漏斗(或常規(guī)萃取化工設(shè)備)，例如由四川蜀牛玻璃儀器公司以商品名分液漏斗銷售的產(chǎn)品。
[0050]所述正丁醇相無色應(yīng)該理解是在用正丁醇萃取所述濃縮液后，萃取后的正丁醇用眼觀察是沒有顏色的，或者是幾乎沒有顏色的。
[0051 ] 在這個(gè)步驟中，所述的減壓濃縮如前面所述，在此不再贅述。
[0052]所述的干燥是在壓力0.01~0.1MPa與溫度30~50°C的條件下進(jìn)行。本發(fā)明使用的干燥設(shè)備是目前市場(chǎng)上銷售的，例如由上海一恒科學(xué)儀器有限公司以商品名真空干燥箱銷售的產(chǎn)品。
[0053]C、樹脂吸附
[0054]大孔吸附樹脂預(yù)處理:在樹脂柱中，將大孔吸附樹脂浸泡在乙醇中20~24h，然后用乙醇水溶液洗脫至流出液不渾濁，`再用水洗至無乙醇味，接著將大孔吸附樹脂浸泡在以重量計(jì)4~6%HCL水溶液中2~4h，用水洗至中性，然后將大孔吸附樹脂浸泡在以重量計(jì)I~3%Na0H水溶液中2~4h，用水洗至中性備用；
[0055]步驟B得到的正丁醇萃取物吸附條件如下:樹脂柱的徑高比為1:8~12，上樣量為0.05~0.15g生藥/毫升柱體積，上樣后靜置過夜，在DlOl大孔吸附樹脂吸附飽和后，使用乙醇水溶液進(jìn)行洗脫；
[0056]洗脫條件如下:先用水沖洗至流出液無色,再用體積分?jǐn)?shù)為80~95%的乙醇水溶液洗脫，洗脫體積為2~4倍柱體積，洗脫流量0.8~1.2mL/min ；
[0057]得到的洗脫物進(jìn)行減壓濃縮，然后真空干燥，其產(chǎn)物是所述的竹節(jié)參皂苷。
[0058]大孔樹脂是由聚合單體和交聯(lián)劑、致孔劑、分散劑等添加劑經(jīng)聚合反應(yīng)制備而成。在聚合物形成后，致孔劑被除去，在樹脂中留下了大量孔穴。因此，大孔樹脂在干燥狀態(tài)下其內(nèi)部具有較高的孔隙率，且孔徑較大(100~lOOOnm)。大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，以吸附為特點(diǎn)。它是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物。
[0059]本發(fā)明使用的大孔吸附樹脂是DlOl大孔吸附樹脂，例如是由上海紫一試劑公司以商品名DlOl大孔吸附樹脂銷售的產(chǎn)品。
[0060]由于DlOl大孔吸附樹脂含有一些雜質(zhì)，因此需要進(jìn)行如下預(yù)處理:
[0061]DlOl大孔吸附樹脂預(yù)處理:將DlOl大孔吸附樹脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脫至流出液不渾濁，再用水洗至無醇味，然后用以重量計(jì)5%HCL浸泡樹脂柱2-4h，用水洗至中性，然后用以重量計(jì)2%NaOH浸泡樹脂柱2-4h，水洗至中性備用。
[0062]在本發(fā)明中，使用乙醇浸泡DlOl大孔吸附樹脂目的是除去樹脂上吸附的醇溶性雜質(zhì)；使用5%HCL浸泡樹脂的目的是為了讓樹脂上吸附的堿性成分變成鹽而沖洗出去；使用2%Na0H浸泡樹脂的目的是為了讓樹脂上吸附的酸性成分變成鹽而沖洗出去；水洗至中性的目的是除去沖洗是殘留的酸、堿及生成的鹽類成分。
[0063]DlOl大孔吸附樹脂吸附條件如下: [0064]柱徑高比為1:10，上樣量為0.1g生藥/毫升柱體積，上樣后靜置過夜。在本發(fā)明中，填充大孔吸附樹脂的徑高比為1:10，是為了保持合適的流速。上樣量選擇為0.1g生藥/毫升柱體積，如果過低，死吸附嚴(yán)重，影響皂苷得率；如果上樣量過大，會(huì)造成過載，影響分離質(zhì)量。上樣后靜置過夜，是為了讓皂苷與大孔吸附樹脂充分吸附。
[0065]DlOl大孔吸附樹脂洗脫條件如下:
[0066]洗脫條件為:先用水沖洗至流出液無色,再用體積分?jǐn)?shù)為80-95%的乙醇水溶液，洗脫體積為3倍柱體積，洗脫流量均為lmL/min。
[0067]本發(fā)明中，首先使用水沖洗至流出液無色，目的是洗去與大孔吸附樹脂吸附能力較弱的皂苷類雜質(zhì)。再用體積分?jǐn)?shù)為80-95%的乙醇水溶液洗脫較適宜，因?yàn)槿绻褂靡掖妓芤盒∮?0%，則極性較小，洗脫能力較弱，對(duì)于皂苷的洗脫不完全；如果選擇乙醇的濃度大于95%，則效果與95%乙醇沒有明顯差異，且配制較困難。更優(yōu)選地為乙醇體積分?jǐn)?shù)為88-92%。
[0068]在這個(gè)步驟中，所述的減壓濃縮與真空干燥與步驟B相同，不再贅述。
[0069]采用本發(fā)明方法制備得到的竹節(jié)參皂苷進(jìn)行了 HPLC分析，其HPLC分析條件如下:
[0070]色譜柱:YMC-packODS-AQ 柱(250 X 4.6mm，粒徑 5 μ m);
[0071]流動(dòng)相:乙腈(A) -0.4%磷酸水溶液(B)；
[0072]柱溫:30°C；
[0073]洗脫方式:梯度洗脫(O~5min，5~5%A ；5~20min，5~30%A ；20~30min，30~30%A ；30 ~50min, 30 ~85%A ；50 ~60min, 85 ~85%A)；
[0074]檢測(cè)波長(zhǎng):203nm;進(jìn)樣量:10 μ I ;流速:1.0ml.min_l。
[0075]紫外檢測(cè)器；氮?dú)鈮毫?3Ps ;漂移管溫度40°C。
[0076]采用本發(fā)明方法制備得到的竹節(jié)參皂苷的HPLC圖譜列于附圖1中。從圖中可以看出，在保留時(shí)間為37min-39min共出現(xiàn)四個(gè)較大的色譜峰，本發(fā)明人對(duì)以上四個(gè)色譜峰進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，將四個(gè)色譜峰所對(duì)應(yīng)的成分按照從前到后的順序分別定義為化合物1、化合物2、化合物3及化合物4，采用1H-NMRj3C-NMR方法對(duì)所述四種化合物進(jìn)行了鑒定，其鑒定結(jié)果如下:
[0077]化合物1:白色粉末，ES1-MS m/z:955 [Μ-Η1。1H-NMlUeOOMHzJ5D5N) δ 6.34 (1Η,d, J=7.8Hz, Glc-H-1 ),5.42 (lH,br s，H_12)，5.41 (1H，s，Glc-H-l )，5.02 (1H，d，J=6.6Hz，GlcA-H-1) ,3.28 (1H, dd, J=Il.4,4.2Hz, H_3)，3.18 (1H, dd, J=13.2,2.4Hz, H-18)，1.28，1.26，1.11，1.09,0.91,0.88,0.83 (each3H, s, 7 X CH3)。
[0078]根據(jù)化合物I的1H-NMRj3C-NMR數(shù)據(jù)，鑒定化合物I為竹節(jié)參皂苷V。
[0079]化合物2:白色粉末，ES1-MS m/z:925 [Μ-Η1。1H-NMlUeOOMHzJ5D5N) δ 6.33 (1Η,d, J=8.4Hz, Glc-H-l ),5.42 (1H, br s，H_12)，5.28 (1H, d, J=6.0Hz，xyl—H—l )，4.99 (1H，d, J=3.0Hz, GlcA-H-1) ,3.29 (1H, br d, J=8.4Hz, H_3)，3.20 (1H, br d, J=I0.8Hz, H-18),1.29 (6H, s, 2 X CH3)，1.10，1.10,0.92,0.89,0.85 (each3H, s, 5 X CH3)。
[0080]根據(jù)化合物2的1H-NMRj3C-NMR數(shù)據(jù)，鑒定化合物2為pjs_2。
[0081]化合物3:白色粉末，ES1-MS m/z:925 [Μ-Η]。1H-NMlUeOOMHzJ5D5N) δ 6.33 (1Η,d, J=8.4Hz, Glc-H-l),6.17 (1H, br s,1H, Araf-H-1),5.42 (1H, s，H—12)，5.02(1H，d,J=3.6Hz，GlcA-H-l)，3.33 (1H, dd, J=I0.8,3.6Hz，H_3)，3.19 (1H，dd，J=13.8,3.6Hz，H_18)，1.29 (6H, s, 2XCH3)，1.09,0.98,0.92,0.89,0.83 (each3H, s，5XCH3)。
[0082]根據(jù)化合物3的ES1-MS Jh-NMRJ3C-NMR數(shù)據(jù)，鑒定化合物3為竹節(jié)參皂苷IV。
[0083]化合物4:白色粉末，ES1-MS m/z:793 [Μ-Η]。1H-NMlUeOOMHzJ5D5N) δ 6.34 (1H,d, J=7.8Hz, Glc-H-l ),5.42 (lH,br s，H-12)，5.04 (1H，d，J=7.8Hz，GlcA-H-l)，3.37 (lH,brd, J=9.9Hz, H-3)，3.19 (1H, dd, J=I0.2,2.4Hz, H-18), 1.31，1.28，1.06，1.00,0.91,0.89，
0.83 (each3H, s，7XCH3)。[0084]根據(jù)化合物4的1H-NMRj3C-NMR數(shù)據(jù)，鑒定化合物4為竹節(jié)參皂苷IV a。
[0085]因此，采用本發(fā)明方法所得到產(chǎn)物的主要成分為竹節(jié)參皂苷V、pjs-2、竹節(jié)參皂苷IV及竹節(jié)參皂苷IV a，四種皂苷均為齊墩果烷型皂苷，因此，采用本發(fā)明的方法可實(shí)現(xiàn)竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷的富集與純化。
[0086]本發(fā)明還涉及采用所述制備方法所得到的竹節(jié)參皂苷。所述竹節(jié)參皂苷含量測(cè)定方法如下:
[0087]香草醛-高氯酸法步驟如下:
[0088]A、對(duì)照品溶液制備:精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品適量，加甲醇配成1.32mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。
[0089]B、供試品溶液制備:精密稱取本發(fā)明干燥竹節(jié)參皂苷總提物0.2g，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻過濾即得供試品溶液。
[0090]C、檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:精密吸取Α50μ I和MO μ 1，分別置于IOml試管中，依次加入以重量計(jì)5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml,高氯酸0.8ml，搖勻，在溫度60°C水浴中加熱15min,取出，冷卻，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，用空白試劑在波長(zhǎng)400~700nm處掃描，確定波長(zhǎng)在552nm為待測(cè)波長(zhǎng)。
[0091]D、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密量取步驟A中對(duì)照品溶液0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml、
1.0ml，分別置于IOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；吸取1.0ml置IOml具塞試管中，按步驟C操作，在552nm處測(cè)吸光度值，以吸光度A為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到回歸方程A=0.07141C-0.00623，r=0.9993。
[0092]E含量測(cè)定:按照步驟B制備各段皂苷樣品液，各取40μ I置IOml具塞試管中，按照步驟C操作，每個(gè)樣品測(cè)3平行試樣，與552nm處測(cè)吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得各段阜苷含量。
[0093]本發(fā)明用作疫苗佐劑的竹節(jié)參皂苷制備方法具有下述特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì):
[0094]A、制備方法簡(jiǎn)單、試劑便宜、操作簡(jiǎn)單，易于大量成產(chǎn)。
[0095]B、用不同醇濃度洗脫DlOl大孔吸附樹脂，使得對(duì)不同區(qū)段的皂苷進(jìn)行研究，更加充分體現(xiàn)總皂苷中各皂苷的不同活性，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。[0096]本發(fā)明還涉及所述的竹節(jié)參皂苷在制備疫苗佐劑中的用途。
[0097]佐劑是非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)與抗原一起注射或預(yù)先注入機(jī)體時(shí)，它可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。
[0098]與現(xiàn)有技術(shù)中的疫苗佐劑相比，本發(fā)明的竹節(jié)參皂苷疫苗佐劑具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0099]A竹節(jié)參皂苷疫苗佐劑副作用小、來源廣泛、易于生產(chǎn)。
[0100]B竹節(jié)參皂苷佐劑具有更強(qiáng)的佐劑活性，能更大的輔助疫苗發(fā)揮作用。
[0101]C竹節(jié)參皂苷疫苗佐劑是屬于中藥疫苗佐劑，為開發(fā)新型疫苗佐劑奠定了基礎(chǔ)。
[0102][有益效果]
[0103]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明是竹節(jié)參皂苷具有明顯的佐劑活性，而無溶血的毒副作用，能夠輔助疫苗發(fā)揮增益增強(qiáng)作用。竹節(jié)參皂苷具有促進(jìn)Thl細(xì)胞免疫及抗體產(chǎn)生活性，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的alum佐劑只能刺激Th2型的抗體產(chǎn)生能力。因此竹節(jié)參皂苷可用于蛋白亞單位疫苗及腫瘤疫苗的佐劑。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0104]圖1是本發(fā)明醇洗脫竹節(jié)參皂苷的HPLC圖譜；
[0105]圖2表示佐劑對(duì)活化的淋巴細(xì)胞IL-2產(chǎn)生的影響。與OVA組比較，*p〈0.05，#p〈0.01 ；
[0106]圖3表示佐劑對(duì)活化的淋巴細(xì)胞IFN- Y產(chǎn)生的影響。與OVA組比較，*p〈0.05，#p〈0.01 ；
[0107]圖4表示佐劑對(duì)抗體IgG及其亞型產(chǎn)生的影響。與OVA組比較，*p〈0.05。
【【具體實(shí)施方式】】
[0108]通過下述實(shí)施例將能夠更好地理解本發(fā)明。在本發(fā)明中，在沒有特殊說明的前提下，液相混合物中的組分的百分比應(yīng)當(dāng)理解為體積百分比，固相混合物的組分的百分比應(yīng)當(dāng)理解為重量百分比。
[0109]實(shí)施例1:本發(fā)明醇沉竹節(jié)參皂苷的制備
[0110]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0111]A、竹節(jié)參提取
[0112]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:5，將粉碎竹節(jié)參浸泡在濃度以重量計(jì)55%乙醇水溶液中，浸泡2h，再加熱回流提取3次，每次lh，合并提取液，再在壓力0.006MPa下減壓濃縮得到一種濃縮液；
[0113]B、萃取分離
[0114]步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1:1用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著在壓力0.006MPa下減壓濃縮，于是得到正丁醇萃取物；
[0115]C、樹脂吸附
[0116]DlOl大孔吸附樹脂預(yù)處理:
[0117]將DlOl大孔吸附樹脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脫至流出液不渾濁，再用水洗至無醇味，然后用以重量計(jì)5%HCL浸泡樹脂柱3h，用水洗至中性，然后用以重量計(jì)2%Na0H浸泡樹脂柱3h，水洗至中性備用。
[0118]DlOl大孔吸附樹脂吸附條件如下:
[0119]柱徑高比為1:10，上樣量為0.1g生藥/毫升柱體積，上樣后靜置過夜。
[0120]DlOl大孔吸附樹脂洗脫條件如下:
[0121]先用水沖洗樹脂柱至流出液無色，再用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇水溶液洗脫，洗脫體積為3倍柱體積，洗脫流量為lmL/min。
[0122]得到的洗脫物在壓力0.006MPa下進(jìn)行減壓濃縮，然后在壓力0.06MPa與溫度35°C的條件下進(jìn)行干燥，于是得到所述的竹節(jié)參皂苷。
[0123]采用本說明書描述的方法分析了本實(shí)施例制備得到的竹節(jié)參皂苷產(chǎn)物，其HPLC圖譜見附圖1，由此確定竹節(jié)參皂苷產(chǎn)物的主要成分為竹節(jié)參皂苷V、pjs-2、竹節(jié)參皂苷IV及竹節(jié)參皂苷IV a。采用本說明書描述的方法測(cè)定了本實(shí)施例制備產(chǎn)物的竹節(jié)參皂苷含量是 68.9%ο
[0124]實(shí)施例2:本發(fā)明醇沉竹節(jié)參皂苷的制備
[0125]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0126]A、竹節(jié)參提取
[0127]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:15，將粉碎竹節(jié)參浸泡在濃度以重量計(jì)85%乙醇水溶液中，浸泡5h，再加熱回流提取2次，每次5h，合并提取液，再在壓力0.008MPa下減壓濃縮得到一種濃縮液；
`[0128]B、萃取分離
[0129]步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1:4用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著在壓力0.0OSMPa下減壓濃縮，于是得到正丁醇萃取物；
[0130]C、樹脂吸附
[0131]按照與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行DlOl大孔吸附樹脂預(yù)處理、吸附與梯度洗脫，得到的洗脫物在壓力0.0OSMPa下進(jìn)行減壓濃縮，然后在壓力0.0SMPa與溫度40°C的條件下進(jìn)行干燥，于是得到所述的竹節(jié)參皂苷。
[0132]采用本說明書描述的方法測(cè)定了本實(shí)施例制備產(chǎn)物的竹節(jié)參皂苷含量是70.1%。
[0133]實(shí)施例3:本發(fā)明醇沉竹節(jié)參皂苷的制備
[0134]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0135]A、竹節(jié)參提取
[0136]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:6，將粉碎竹節(jié)參浸泡在濃度以重量計(jì)60%乙醇水溶液中，浸泡2.6h，再加熱回流提取3次，每次1.8h，合并提取液，再在壓力0.0OlMPa下減壓濃縮得到一種濃縮液；
[0137]B、萃取分離
[0138]步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1: 1.8用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著在壓力0.0OlMPa下減壓濃縮，于是得到正丁醇萃取物；
[0139]C、樹脂吸附
[0140]按照與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行DlOl大孔吸附樹脂預(yù)處理、吸附與梯度洗脫，得到的洗脫物在壓力0.0OlMPa下進(jìn)行減壓濃縮，然后在壓力0.01MPa與溫度30°C的條件下進(jìn)行干燥，于是得到所述的竹節(jié)參皂苷。
[0141]采用本說明書描述的方法測(cè)定了本實(shí)施例制備產(chǎn)物的竹節(jié)參皂苷含量是61.5%。
[0142]實(shí)施例4:本發(fā)明醇沉竹節(jié)參皂苷的制備
[0143]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0144]A、竹節(jié)參提取
[0145]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:14，將粉碎竹節(jié)參浸泡在濃度以重量計(jì)80%乙醇水溶液中，浸泡4.5h，再加熱回流提取4次，每次4.2h，合并提取液，再在壓力0.002MPa下減壓濃縮得到一種濃縮液；
[0146]B、萃取分離
[0147]步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1:3.2用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著在壓力0.002MPa下減壓濃縮，于是得到正丁醇萃取物；
[0148]C、樹脂吸附
[0149]按照與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行DlOl大孔吸附樹脂預(yù)處理、吸附與梯度洗脫，得到的洗脫物在壓力0.002MPa下進(jìn)行減壓濃縮，然后在壓力0.02MPa與溫度46°C的條件下進(jìn)行干燥，于是得到所述的竹節(jié)參皂苷。
[0150]采用本說明書描述的方法測(cè)定了本實(shí)施例制備產(chǎn)物的竹節(jié)參皂苷含量是64.8%。
[0151]實(shí)施例5:本發(fā)明醇沉竹節(jié)參皂苷的制備
[0152]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0153]A、竹節(jié)參提取
[0154]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:8，將粉碎竹節(jié)參浸泡在濃度以重量計(jì)62%乙醇水溶液中，浸泡3.2h，再加熱回流提取4次，每次2.5h，合并提取液，再在壓力0.004MPa下減壓濃縮得到一種濃縮液；
[0155]B、萃取分離
[0156]步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1:2.2用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著在壓力0.004MPa下減壓濃縮，于是得到正丁醇萃取物；
[0157]C、樹脂吸附
[0158]按照與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行DlOl大孔吸附樹脂預(yù)處理、吸附與梯度洗脫，得到的洗脫物在壓力0.004MPa下進(jìn)行減壓濃縮，然后在壓力0.04MPa與溫度50°C的條件下進(jìn)行干燥，于是得到所述的竹節(jié)參皂苷。
[0159]采用本說明書描述的方法測(cè)定了本實(shí)施例制備產(chǎn)物的竹節(jié)參皂苷含量是61.9%。
[0160]實(shí)施例6:本發(fā)明醇沉竹節(jié)參皂苷的制備
[0161]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0162]A、竹節(jié)參提取
[0163]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:12，將粉碎竹節(jié)參浸泡在濃度以重量計(jì)75%乙醇水溶液中，浸泡3.8h，再加熱回流提取5次，每次3.6h，合并提取液，再在壓力0.01MPa下減壓濃縮得到一種濃縮液；[0164]B、萃取分離
[0165]步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1:2.8用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著在壓力0.01MPa下減壓濃縮，于是得到正丁醇萃取物；
[0166]C、樹脂吸附
[0167]按照與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行DlOl大孔吸附樹脂預(yù)處理、吸附與梯度洗脫，得到的洗脫物在壓力0.01MPa下進(jìn)行減壓濃縮，然后在壓力0.04MPa與溫度50°C的條件下干燥，于是得到所述的竹節(jié)參皂苷。
[0168]采用本說明書描述的方法測(cè)定了本實(shí)施例制備產(chǎn)物的竹節(jié)參皂苷含量是59.9%。
[0169]試驗(yàn)實(shí)施例
[0170]一、溶血實(shí)驗(yàn):
[0171]用抗凝真空采血管從兔耳靜脈采集外周血，加入生理鹽水，混勻，2000rpm，離心lOmin，重復(fù)洗滌3次，用生理鹽水稀釋制成0.5%v/v)的紅細(xì)胞懸液。準(zhǔn)確稱取藥物，分別用生理鹽水配制，經(jīng)過0.22 μ m微孔濾膜過濾，再用生理鹽水依次稀釋成濃度為1280、640、320、160、80、40、20、10μ g/mL 的稀釋液。
[0172]在96孔板中，每孔加入0.5%的紅細(xì)胞懸液100 μ L，再加入按照本發(fā)明方法制備的不同濃度的齊墩果烷型皂苷稀釋液100 μ L，混勻，一個(gè)濃度重復(fù)3孔。再設(shè)陰性和陽(yáng)性的溶血對(duì)照，分別為生理鹽水及蒸餾水。在溫度37°C培養(yǎng)箱中放置30min，以1000rpm離心IOmin0取各孔上清液100 μ L，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405nm處檢測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所測(cè)各組的吸收值減去生理鹽水對(duì)照組的吸收值就可以表示溶血性，按照下面的公式計(jì)算其溶血率:`
[0173]溶血率(%) =100* (實(shí)驗(yàn)組OD-陰性對(duì)照OD) / (陽(yáng)性對(duì)照OD-陰性對(duì)照OD)
[0174]按照本發(fā)明方法制備的竹節(jié)參齊墩果烷型皂苷對(duì)兔紅細(xì)胞溶血活性試驗(yàn)結(jié)果列于表1中。
[0175]表1:皂苷的溶血活性測(cè)定
__OD 值(412nm) 溶血率(％ )
生理鹽水0.丨丨±0.010.00
[0176]---
蒸餾水1.97 土 0.22__100.00土 10.50
Quil A (^igZml) 50.09±0.05-0.68±0.09
【權(quán)利要求】
1.一種用作疫苗佐劑的竹節(jié)參皂苷的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟: A、竹節(jié)參提取 將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:5~15，將粉碎竹節(jié)參浸泡在體積分?jǐn)?shù)55~85%乙醇水溶液中，浸泡2~5h，再加熱回流提取2~5次，每次I~5h，合并提取液，再減壓濃縮至提取液無醇味，得到一種濃縮液； B、萃取分離 步驟A得到的濃縮液按照濃縮液與正丁醇的體積比1:1~4用正丁醇進(jìn)行多次萃取與兩相分離，直到正丁醇相無色，得到的正丁醇萃取液合并，接著減壓濃縮，真空干燥，于是得到正丁醇萃取物； C、樹脂吸附 大孔吸附樹脂預(yù)處理:在樹脂柱中，將大孔吸附樹脂浸泡在乙醇中20~24h，然后用乙醇水溶液洗脫至流出液不渾濁，再用水洗至無乙醇味，接著將大孔吸附樹脂浸泡在以重量計(jì)4~6%HCL水溶液中2~4h，用水洗至中性，然后將大孔吸附樹脂浸泡在以重量計(jì)I~3%NaOH水溶液中2~4h，用水洗至中性備用； 步驟B得到的正丁醇萃取物吸附條件如下:樹脂柱的徑高比為1:8~12，上樣量為0.05~0.15g生藥/毫升柱 體積，上樣后靜置過夜，在DlOl大孔吸附樹脂吸附飽和后，使用乙醇水溶液進(jìn)行洗脫； 洗脫條件如下:先用水沖洗至流出液無色，再用體積分?jǐn)?shù)為80~95%的乙醇水溶液洗脫，洗脫體積為2~4倍柱體積，洗脫流量0.8~1.2mL/min ； 得到的洗脫物進(jìn)行減壓濃縮，然后真空干燥，其產(chǎn)物是所述的竹節(jié)參皂苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，所述竹節(jié)參粉碎粒度是20~40目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比是1:8~12。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，所述乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為62~75%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟B中，所述的減壓濃縮是在壓力0.001~0.01MPa下進(jìn)行的，所述的干燥是在壓力0.01~0.1MPa與溫度30~50°C的條件下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟B中，所述濃縮液與正丁醇的體積比是1:1.8~3.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟C中，所述的大孔吸附樹脂是DlOl大孔吸附樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟D中，所述的減壓濃縮是在壓力0.001~0.01MPa下進(jìn)行的，所述的干燥是在壓力0.01~0.1MPa與溫度30~50°C的條件下進(jìn)行干燥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述制備方法得到的竹節(jié)參皂苷。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的竹節(jié)參皂苷在制備疫苗佐劑中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK103611157SQ201310652240
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】袁丁, 張長(zhǎng)城, 劉朝奇, 王婷, 孫志偉, 周志勇, 崔倩倩, 萬靜枝, 何毓敏 申請(qǐng)人:三峽大學(xué)