治療自身免疫和過敏性疾病的組合物及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了治療和預(yù)防自身免疫及過敏性疾病的改進(jìn)了的方法和組合物。更具體地說，發(fā)明涉及新的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，所述復(fù)合物是這樣的融合蛋白，其包含細(xì)菌內(nèi)毒素的突變亞基、能夠結(jié)合特異性細(xì)胞受體的肽和一或多個(gè)與自身免疫或過敏性疾病相關(guān)的表位。
【專利說明】治療自身免疫和過敏性疾病的組合物及方法
[0001]本申請是中國申請200880127111.1的分案申請，該母案的國際申請日為2008年12月15日，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及免疫學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域。發(fā)明提供了治療和預(yù)防自身免疫及過敏性疾病的改進(jìn)了的方法和組合物。更具體地說，發(fā)明涉及新的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，所述復(fù)合物是這樣的融合蛋白，其包含細(xì)菌腸毒素的突變亞基、能夠結(jié)合特異性細(xì)胞受體的肽和與自身免疫或過敏性疾病相關(guān)的一或多個(gè)自身免疫或過敏激發(fā)表位。
[0003]背景
_4] 自身免疫疾病和免疫反應(yīng)的調(diào)理
[0005]自身免疫疾病是由變成錯(cuò)誤地攻擊身體中的健康細(xì)胞和/或組織的免疫細(xì)胞導(dǎo)致的任何疾病。美國人口中的3%受到自身免疫疾病的影響，在全世界工業(yè)化國家中很可能也有類似百分比的人群受其困擾(Jacobson et al.Clin ImmunolImmunopathol84:223-43, 1997)。自身免疫疾病的特征在于其T和B淋巴細(xì)胞異常針對自身蛋白質(zhì)、多肽、肽和/或其他自體分子，導(dǎo)致體內(nèi)器官、組織或細(xì)胞型(例如，胰、腦、胸腺或胃腸道)的損傷和/或功能紊亂，從而造成疾病的臨床表現(xiàn)(Marrack et al.NatMed7:899-905, 2001)。自身免疫病包括只影響特定組織的和影響到多個(gè)組織的疾病。對于某些疾病來說，這可能部分取決于自身免疫反應(yīng)是針對局限于特定組織中的抗原還是針對在體內(nèi)廣泛分布的抗原。組織特異性自身免疫的特點(diǎn)是對單一組織或單一細(xì)胞類型的選擇性攻擊。但是，某些針對分布廣泛的自身蛋白質(zhì)的自身免疫疾病也可能只影響特異組織。例如，在多發(fā)性肌炎中，自身免疫反應(yīng)針對分布廣泛的蛋白質(zhì)組氨酰-tRNA合成酶，但其主要涉及的臨床表現(xiàn)是肌肉的自身免疫破壞。
[0006]免疫系統(tǒng)所運(yùn)用的高度復(fù)雜的機(jī)制，其設(shè)計(jì)在于能夠產(chǎn)生保護(hù)哺乳動(dòng)物對抗許多外來病原的反應(yīng)，而同時(shí)防止對自身抗原的反應(yīng)。除了決定是否進(jìn)行反應(yīng)(抗原特異性)，免疫系統(tǒng)還必須選擇合適的效應(yīng)功能來應(yīng)對各種抗原(效應(yīng)特異性)。介導(dǎo)和調(diào)節(jié)這些效應(yīng)功能的一種關(guān)鍵細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞。而且，CD4+T細(xì)胞精準(zhǔn)地產(chǎn)生各種特異細(xì)胞因子似乎是T細(xì)胞介導(dǎo)其功能的主要機(jī)制。因此，對于理解免疫反應(yīng)的調(diào)控至關(guān)重要的是對⑶4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子類型及其分泌是如何調(diào)節(jié)進(jìn)行表征。
[0007]對長期小鼠CD4+T細(xì)胞克隆產(chǎn)生的細(xì)胞因子的表征是在20多年前首次發(fā)表的(Mosmann et al.J Immunol 136:2348-2357, 1986)。該項(xiàng)研究表明 CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生了兩種不同模式的細(xì)胞因子，分別命名為I型輔助性T細(xì)胞(Thl)和2型輔助性T細(xì)胞(Th2)。研究發(fā)現(xiàn)ThI細(xì)胞產(chǎn)生白介素-2 (IL-2)、干擾素-Y (IFN-y)和淋巴毒素(LT)，而Th2克隆主要產(chǎn)生 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-13 (Cherwinski et al.J Exp Medl69:1229-1244，1987)。而后來從Th2克隆中又分離到其他細(xì)胞因子IL-9和IL-1O (Van Snick et al.J ExpMedl69:363-368, 1989) (Fiorentino et al.J Exp Medl70:2081-2095，1989)。最后，發(fā)現(xiàn)Thl和Th2細(xì)胞都可以分泌其他細(xì)胞因子，諸如IL-3、粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)。近年，有報(bào)道稱從萊姆病(Lyme disease)患者的發(fā)炎關(guān)節(jié)中分離到的⑶4+T細(xì)胞含有與Thl和Th2不同的產(chǎn)生IL-17的⑶4+T細(xì)胞亞組(Infante-Duarte et al.J.1mmunol 165:6107-6115，2000)。這些產(chǎn)生 IL-17 的 CD4+T 細(xì)胞被命名為Thl7。IL-17是一種主要由被激活的T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，它能增強(qiáng)T細(xì)胞活化并刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和表皮細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)，包括IL-1、IL-6、TNF-α、N0S-2、金屬蛋白酶和趨化因子，引發(fā)炎癥。IL-17的表達(dá)在各種過敏性和自身免疫疾病(比如RA、MS、炎癥性腸病(IBD)和哮喘)患者體內(nèi)是增加的，表明IL-17對于這類疾病的引發(fā)和/或發(fā)展有作用。
[0008]大量證據(jù)顯示抑制性T細(xì)胞(現(xiàn)在稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,Treg細(xì)胞)通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞作為外周免疫耐受的主動(dòng)機(jī)制。目前為止的共識是Treg細(xì)胞可以根據(jù)它們的來源被分為兩個(gè)不同的亞型，即天然(或組成型)和誘導(dǎo)性(或獲得型)群體(Mills，Nat RevImmunol4:841-855, 2004)。此外，根據(jù)其表面標(biāo)記或細(xì)胞因子產(chǎn)物，已經(jīng)鑒定到多種Treg細(xì)胞亞組，比如⑶4+Treg細(xì)胞(包括天然⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞、IL-10-產(chǎn)生TrI細(xì)胞和TGF-β -產(chǎn)生 Th3 細(xì)胞)、CD8+Treg 細(xì)胞、Veto CD8+細(xì)胞、Y δ T 細(xì)胞、NKT (NK1.1+CD4-CD8)細(xì)胞、NKl.1-⑶4-⑶8細(xì)胞等。越來越多的證據(jù)顯示天然的⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞在下調(diào)病理性自身免疫反應(yīng)和保持免疫自身穩(wěn)定中發(fā)揮活躍的功能(Akbari et a 1.Curr OpinImmunol15:627-633, 2003)。
[0009]自身免疫疾病涵蓋影響到體內(nèi)許多不同器官和組織的多種疾病(參見例如，Paul, ff.E.(1999)Fundamental Immunology, Fourth Edition,Lippincott-Raven, NewYork.)。
[0010]人類自身免疫疾病目前的治療方法包括糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒劑以及近年開發(fā)的生物治療劑。總的來說，人系統(tǒng)性自身免疫疾病的處置要依靠經(jīng)驗(yàn)并且不令人滿意。大多數(shù)情況下，諸如皮質(zhì)激素這 樣的廣泛免疫抑制藥物被用于多種嚴(yán)重的自身免疫和炎性疾病。除了皮質(zhì)激素，在處置系統(tǒng)性自身免疫疾病中還使用其他免疫抑制劑。環(huán)磷酰胺這種烷化劑能夠?qū)е耇-和B-淋巴細(xì)胞被完全清除，損傷細(xì)胞介導(dǎo)的免疫能力。環(huán)孢菌素、他克莫司(tacrolimus)和霉酹酸酯(mycophenolate mofetil)是具有特異性T淋巴細(xì)胞抑制作用的天然產(chǎn)物，它們已被用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，并且在一定程度內(nèi)用于血管炎和肌炎。這些藥物與嚴(yán)重的腎毒相關(guān)聯(lián)。氨甲喋呤也被用作治療RA的“二線”藥劑，目的在于減少疾病的發(fā)展。它還被用于多發(fā)性肌炎和其他結(jié)締組織疾病。其他曾嘗試過的措施包括使用意圖阻斷細(xì)胞因子的作用或者消耗掉淋巴細(xì)胞的單抗(Fox, Am J Med99:82-88, 1995)。多發(fā)性硬化癥(MS)的治療包括干擾素β和共聚物1，能夠降低復(fù)發(fā)率20-30%，并且對疾病發(fā)展只有溫和的影響。還用包括甲基強(qiáng)的松龍、其他激素、氨甲喋呤、克拉屈濱(cladribine)和環(huán)磷酰胺的免疫抑制劑治療MS。這些免疫抑制劑對治療MS只有很低的藥效。發(fā)生在接受該療法的患者中的進(jìn)行性multifocalleucoencaphalopathy (PML)給引入 α 4_整合蛋白拮抗劑一抗體Tysabri (natalizumab)治療MS帶來了陰影。目前的RA療法使用非特異性抑制或調(diào)理免疫功能的藥劑，比如氨甲喋呤、柳氮橫吡唳(sulfasalazine)、羥基氯喹(hydroxychloroquine)、Ieuf lonamide、潑尼松(prednisone)以及近年開發(fā)的TNFa拮抗劑一依那西普(etanercept)和英夫利昔單抗(infliximab) (Moreland et al.J Rheumatol28:1431-52，2001)。依那西普和英夫利昔單抗全面阻斷TNF α，使得患者更易死于膿毒癥、慢性分枝桿菌感染惡化和脫髓鞘事件。
[0011]對于器官特異性自身免疫，已經(jīng)嘗試了許多不同的治療措施。已有可溶性蛋白抗原被系統(tǒng)性給藥從而抑制對該抗原隨后發(fā)生免疫反應(yīng)。這類療法包括將髓鞘堿性蛋白、其主要肽或者髓鞘蛋白混合物遞送給試驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的動(dòng)物和患有多發(fā)性硬化癥的人(Brocke et al.Nature379:343-6, 1996; Critchfield et al.Science263:1139-43, 1994;Weiner et al.Annu Rev Immunol12:809-37, 1994)、將 II 型膠原蛋白或者膠原蛋白的混合物給予患有膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的人(Gumanovskaya et al.1mmunology91:466-73, 1999;McKown et al.ArthritisRheum42:1204-8, 1999; Trentham et al.Science261:1727-30，1993)、給患有自身免疫性糖尿病的動(dòng)物和人遞送膜島素(Pozzilli and Gisella Cavallo, Diabetes Metab ResReV16:306-7，2000)，給患有自身免疫性葡萄膜炎的動(dòng)物和人遞送S-抗原(Nussenblattet al.Am J Ophthalmol 123:583-92, 1997)。另一種做法是嘗試設(shè)計(jì)合理治療策略，將基于T細(xì)胞受體和結(jié)合MHC分子的肽之間的特異相互作用的肽抗原系統(tǒng)給藥。在糖尿病動(dòng)物模型中使用肽方法進(jìn)行的一項(xiàng)研究導(dǎo)致產(chǎn)生針對該肽的抗體(Hurtenbach et al.JExp Medl77:1499，1993)。還有一種做法是進(jìn)行T細(xì)胞受體(TCR)肽免疫(參見，例如Vandenbark et al.Nature341:541, 1989)。再一種做法是通過口服肽或蛋白抗原誘導(dǎo)口腔耐受性(參見，例如 Weiner, Tmmmun ο I Todayl8:335, 1997)。
[0012]粘膜耐受是指對抗原攻擊的系統(tǒng)耐受的現(xiàn)象，其中所述抗原之前經(jīng)粘膜途徑，一般是經(jīng)口腔、鼻腔或鼻-呼吸，但也可以是陰道和直腸進(jìn)行了給藥(Weiner et a 1.AnnuRev Immunol 12:809-837, 1994)。粘膜耐受在20世紀(jì)早期即在遲發(fā)型和接觸型超敏反應(yīng)的豚鼠模型中被發(fā)現(xiàn)，但其機(jī)制一直沒有很好的界定，直到現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期。利用細(xì)胞分離技術(shù)、檢測細(xì)胞因子的產(chǎn)生和可以體內(nèi)跟蹤抗原特異性T細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因模型逐漸弄清了粘膜耐受的機(jī)制(Garside and Mowat.Crit Rev Tmmunol 1 7:119-137, 1997) ? 已認(rèn)識到取決于給藥途徑和抗原劑量，經(jīng)粘膜途徑給予抗原可以導(dǎo)致不同類型的耐受。例如，高劑量的口服抗原與經(jīng)胃腸道給予高劑量可溶性抗原類似，可以誘發(fā)T細(xì)胞活化，隨后是應(yīng)答T細(xì)胞被消耗或無變應(yīng)性(Chen et al.Nature376:177-180，1995)。這導(dǎo)致對該抗原特異的T細(xì)胞消失，對后續(xù)抗原攻擊不`再有應(yīng)答，即被動(dòng)耐受。相反，低劑量的口服抗原不會(huì)誘發(fā)T細(xì)胞消耗或無變應(yīng)性，但如果反復(fù)給予，會(huì)誘發(fā)類型獨(dú)特的免疫反應(yīng)，其特征在于出現(xiàn)分泌抗炎細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)-保護(hù)性T細(xì)胞一Treg細(xì)胞，即主動(dòng)耐受(von Herrath, ResImmunol.148:541-554, 1997) ?這些Treg細(xì)胞通常屬于CD4 (輔助型)型T細(xì)胞。將完整蛋白抗原滴注到鼻咽粘膜還會(huì)誘發(fā)保護(hù)性的Treg細(xì)胞。這種情況中，⑶4和⑶8型T細(xì)胞都可能被誘發(fā)。經(jīng)口或鼻內(nèi)給予抗原后誘發(fā)的調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，比如IL-4、IL-1O和TGF-β。為了誘發(fā)粘膜耐受，抗原還可以以氣霧劑的形式給予。經(jīng)這三種途徑(即口腔、鼻內(nèi)和氣霧劑吸入)給藥導(dǎo)致抗原被攝入，并在各種情況中呈遞到不同的淋巴室。相應(yīng)的，口服抗原被主要呈遞給腸系膜淋巴結(jié)中的和一定程度上派伊爾斑(Peyer’spatches)中的T細(xì)胞，鼻內(nèi)抗原呈遞到頸深淋巴結(jié)中的T細(xì)胞，吸入的抗原呈遞到縱隔淋巴結(jié)中的T細(xì)胞。每種情況中反復(fù)與抗原接觸都能夠誘發(fā)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，但這些細(xì)胞的性質(zhì)根據(jù)給藥途徑和抗原形式而各不相同?？诜乖T發(fā)的調(diào)節(jié)細(xì)胞是CD4T細(xì)胞，并且表達(dá)由α β雜二聚體構(gòu)成的T細(xì)胞受體(TCR)，而在鼻-呼吸抗原的情況中，調(diào)節(jié)細(xì)胞還可以是表達(dá)Y δ雜二聚體TCR的⑶8Τ細(xì)胞(即Y 3 1'細(xì)胞)。這些細(xì)胞中的某些還可能有α α同型二聚體，而不是常規(guī)的α β雜二聚體TCR的⑶8受體。這些細(xì)胞中帶有⑶8 α α和
YS TCR的大多數(shù)存在于皮膚或粘膜組織中。
[0013]過去幾十年間，西方國家中過敏性疾病的發(fā)生率和流行程度都有顯著增加。過敏性鼻炎在這些疾病中最常見，影響到人口的15-20%。過敏反應(yīng)的引發(fā)是由肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞表面的特異IgE在過敏原介導(dǎo)下進(jìn)行交聯(lián)，導(dǎo)致釋放組胺和其他介質(zhì)，引起急性過敏反應(yīng)，隨后發(fā)生以大量涌入嗜酸粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞以及產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13的Th2細(xì)胞為特征的晚期反應(yīng)。
[0014]特異性免疫治療(SIT)是公認(rèn)的過敏性鼻炎的有效治療方法。傳統(tǒng)上，SIT的實(shí)施是通過反復(fù)皮下給予小量的特異過敏原。雖然這種治療方式可能是一種有效的療法，但由于該免疫治療的安全性以及很難對作為疫苗的過敏原提取物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，所以還存在顧慮。因此，對于開發(fā)治療過敏性疾病的替代的和新的治療方法有很大的興趣。一種方法是利用粘膜疫苗(Widermann, Curr Drug Targets Inflamm Allergy4, 577-583，2005)。其他替代方法基于使用過敏原性下降或者沒有過敏原性的過敏原衍生物作為疫苗(Vrtala etal.Methods32, 313-320，2004)。這包括通過蛋白質(zhì)工程獲得的過敏原和代表過敏原優(yōu)勢免疫T細(xì)胞表位的免疫合成肽。例如Ole el已被鑒定為橄欖花粉最相關(guān)的過敏原(Wheeleret al.MoI Immunol27, 631-636，1990)。
[0015]目前改變免疫反應(yīng)是通過單獨(dú)遞送多肽或者與佐劑(免疫調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合遞送。例如，乙肝病毒疫苗含有在作為佐劑的氫氧化鋁中配制的重組乙肝病毒表面抗原(非己抗原)。該疫苗誘發(fā)抗乙肝病毒表面抗原的免疫反應(yīng)來保護(hù)免于被感染。替代的方法涉及遞送均為非己抗原的病毒或細(xì)菌的減毒、復(fù)制缺陷和/或非病原形式，從而引發(fā)宿主抗病原的保護(hù)性免疫反應(yīng)。例如 ，口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗由減毒的活病毒(非己抗原)構(gòu)成，該活病毒感染細(xì)胞并在接種疫苗的個(gè)體中復(fù)制，在不引起臨床疾病的情況下，誘發(fā)抗脊髓灰質(zhì)炎病毒(外來或非己抗原)的有效免疫力。替代的，滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗含有被滅活或“殺死”的無法感染或復(fù)制的病毒，經(jīng)皮下給予從而誘發(fā)抗脊髓灰質(zhì)炎病毒的保護(hù)性免疫力。
[0016]DNA療法用于自身免疫疾病的治療已有描述。這類DNA療法包括利用編碼T細(xì)胞受體抗原結(jié)合區(qū)的DNA來改變推動(dòng)自身免疫反應(yīng)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞水平(Waisman etal.Nat Med2:899-905, 1996;U.S.Patent5, 939，400)。編碼自身抗原的 DNA 被附著在顆粒上，并經(jīng)基因槍遞送到皮膚來防止MS和膠原蛋白誘發(fā)型關(guān)節(jié)炎(W097/46253; Ramshaw etal.1mmunol Cell Biol75:409-413，1997)。編碼粘附分子、細(xì)胞因子(例如 TNF α )、趨化因子(例如C-C趨化因子)和其他免疫分子(例如Fas-配體)的DNA被用在動(dòng)物模型中治療自身免疫疾病(Youssef et al.J Clin Invest 106:361-371, 2000 ; Wildbaum et al.JClin Investl06:671-679, 2000;ffildbaum et al.J Immunol165:5860-5866, 2000)。
[0017]通過給予編碼一或多種自身抗原的核酸來治療自身免疫疾病的方法在W000/53019.W02003/045316和W02004/047734中有描述。這些方法是成功的，但仍需要進(jìn)一步提聞。
[0018]細(xì)菌腸毒素被用作疫苗中的免疫刺激佐劑以防止感染性疾病?；魜y毒素(CT)及其密切相關(guān)的大腸桿菌不耐熱毒素(LT)可能是當(dāng)前試驗(yàn)使用的粘膜佐劑中最有效和研究最透徹的(Rappuoli et al.1mmunol Today20:493-500),但臨床使用時(shí),它們潛在的毒性以及與某些貝爾氏麻痹(Bell’s palsy，面神經(jīng)麻痹)病例的關(guān)聯(lián)使得它們退出了市場(Gluck et al.J Infect Dis181:1129-1132, 2000;Gluck et al.Vaccine20(Suppl.1):S42-44, 2001;Mutsch et al.N Engl JMed.350:896-903，2004)。細(xì)菌腸毒素 CT 和 LT已在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人中被證明是有效的免疫增強(qiáng)劑(Freytag et al.Curr Top MicrobiolImmunol236:215-236, 1999)。結(jié)構(gòu)上來說，這些腸毒素是AB5復(fù)合體，由一個(gè)ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性Al亞基和A2亞基，所述A2亞基將Al與B亞基五聚體連在一起構(gòu)成。Holotoxins與多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)B亞基(CTB)結(jié)合，該亞基與細(xì)胞膜中的GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂受體特異相互作用。鑒于發(fā)現(xiàn)holotoxins能夠增強(qiáng)粘膜免疫反應(yīng)，CTB和抗原間的偶聯(lián)已被用于對免疫系統(tǒng)進(jìn)行特異耐受化(Holmgren et al.Am J Trop Med Hyg50:42-54，1994)。在小鼠中進(jìn)行的研究顯示當(dāng)鼻內(nèi)給予CT和LT時(shí)，它們可以在嗅覺神經(jīng)和嗅覺球中累積，該機(jī)制依賴于CT或LT的B亞基結(jié)合所有有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞上都存在的GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂受體的能力(Fujihashi et al.Vaccine20:2431-2438，2002)。雖然已有經(jīng)過工程化毒性減輕并具有相當(dāng)佐劑功能的CT和LT突變體,這類分子仍然有很高的引起不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)(Giuliani etal.J Exp Medl87:1123-1132，1998;Yamamoto et al.J Exp Medl85:1203-1210，1997)，特別是考慮到CT和LT的佐劑活性似乎取決于A亞基的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性和結(jié)合靶細(xì)胞上節(jié)苷脂受體的能力的組合(Soriani et al.Microbiologyl48:667-676，2002)。這些和其他一些觀察結(jié)果排除了將CT或LT holotoxins用于人疫苗的可能。另一方面,近來的觀察顯示通過在編碼Al亞基的基因中引入定點(diǎn)突變可以使這些分子保留佐劑功能，而毒性消失或明顯地減少。已被證明是有限佐劑的突變分子實(shí)例是LTK63和LTR72 (Giuliani etal.J Exp Medl87:1123-1132, 1998)，前者沒有酶促活性，而后者的ADP-核糖基化能力顯著下降。盡管如此，這些突變體中的GMl-節(jié)苷脂受體依賴性結(jié)合仍然是個(gè)問題，因此可能還是會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞累積和神經(jīng)毒性。
[0019]這種效果和毒性兩難的局面的更好解決方法是CTAl-DD分子，該分子已被證實(shí)是高效的粘膜和系統(tǒng)佐劑(Agren et al.J Immunol 158:3936-3946, 1997;US5, 917, 026)。該獨(dú)特佐劑基于CT的酶活性Al亞基，組合來自金黃色葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白結(jié)合元件二聚體。這樣該分子避免了可能導(dǎo)致不希望的與所有有核細(xì)胞的結(jié)合，充分利用holotoxin中的CTAl酶。相應(yīng)地，到`目前為止所有研究都發(fā)現(xiàn)CTAl-DD是無毒的，并且具有優(yōu)良的免疫增強(qiáng)功能。當(dāng)系統(tǒng)性地給予CTA1-DD時(shí)，它能提供與完整CT相當(dāng)?shù)淖魟┬Ч?，極大地增強(qiáng)抗與該佐劑一起給予的特異免疫原的細(xì)胞和體液免疫力。它還可以作為粘膜佐劑，應(yīng)當(dāng)是安全的，因?yàn)樗鼪]有CT holotoxin毒性所需要的B亞基。CTAl-DD不能結(jié)合節(jié)苷脂受體，而是針對B細(xì)胞，這就使得CTAl-DD佐劑僅能用于它能與之相互作用的有限細(xì)胞。但是，佐劑效果并非完全取決于B細(xì)胞，因?yàn)樵贐細(xì)胞缺陷的小鼠中用CTAl-DD佐劑鼻內(nèi)免疫后，也強(qiáng)烈地誘發(fā)了特異⑶4T細(xì)胞免疫(Eliasson et alVaccine25:1243-52, 2008, Akhiani et al.Scand J.1mmunol63:97-105，2006)。
[0020]CTAl-DD的突變體CTAl-El 12K-DD和CTA1-R7K-DD沒有佐劑效果，這兩種突變體缺乏 ADP-核糖基化酶活性(Lycke, Tmmunol Lett97:193-198，2005)。
[0021]Wadell 和 Lycke (FASEB Journal 15 (5), A1230, 2001)利用基于 CTA1-R7K-DD 和來源于卵清蛋白的肽(0VA-p323-339)之融合的試驗(yàn)系統(tǒng)，宣稱在給予CTA1-R7K-0V A-DD融合蛋白后，觀察到對脾CD4T細(xì)胞群體耐受性的刺激。但是，該會(huì)議摘要沒有提供試驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果，讀者不明了到底進(jìn)行了什么試驗(yàn)，得到的結(jié)果如何。而且在非生理系統(tǒng)中使用該OVA肽獲得的任何結(jié)果是否可以推廣到與自身免疫性或過敏性疾病的病理生理有任何相關(guān)性也令人懷疑，因?yàn)樵揙VA肽并非與自身免疫性或過敏性疾病相關(guān)的肽。
[0022]CTB和衍生自牛膠原蛋白II的肽的偶聯(lián)物已被證實(shí)能夠保護(hù)小鼠不發(fā)生膠原蛋白誘發(fā)型自身免疫耳疾病以及膠原蛋白誘發(fā)型關(guān)節(jié)炎(Kim et al.Ann Otol Rhinol Laryngol110:646-654, 2001;Tarkowski et al.Arthritis Rheum42:1628-34，1999)。但是，正如以上討論的，由于其GMl-節(jié)苷脂結(jié)合特性和潛在的神經(jīng)毒效果，CTB可能不適合人使用。
[0023]發(fā)明概述
[0024]本發(fā)明涉及預(yù)防、防止和/或治療自身免疫或過敏性疾病的改進(jìn)了的方法和組合物，包括給予免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物是這樣的融合蛋白，該融合蛋白包含細(xì)菌腸毒素的突變亞基、能夠結(jié)合特異性細(xì)胞受體的肽以及一或多個(gè)與疾病相關(guān)的表位。給予個(gè)體治療或預(yù)防有效量的所述免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物引發(fā)對與疾病相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)的抑制，從而治療或防止該疾病。
[0025]當(dāng)要治療的疾病是自身免疫性疾病時(shí)，所述表位可以是自身免疫表位。當(dāng)要治療的疾病是過敏性疾病時(shí)，表位可以是激發(fā)過敏的表位。
[0026]一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供了免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，所述免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物是包含細(xì)菌腸毒素ADP-核糖基化亞基的突變亞基的融合蛋白。優(yōu)選地，所述ADP-核糖基化亞基選自霍亂毒素(CT)的Al亞基、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)的Al亞基、百日咳毒素(PTX)的SI亞基以及來自梭狀芽孢桿菌、志賀氏菌和假單胞菌毒素的ADP-核糖基化亞基。最優(yōu)選的細(xì)菌腸毒素ADP核糖基化亞基選自霍亂毒素(CT)的Al亞基、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)的Al亞基和百日咳毒素(PTX)的SI亞基。
[0027]細(xì)菌腸毒素的ADP-核糖基化亞基被突變成所述ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的10%，優(yōu)選低于低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的5%，或者更優(yōu)選低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的1%。
[0028]一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含CTA1-R7K突變體(SEQ ID N0:1)，其中天然CTAl的第7位氨基酸-精氨酸被賴氨酸代替。
[0029]一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含與能夠進(jìn)行抗原呈遞的細(xì)胞(特別是表達(dá)MHC I類或MHC II類抗原的細(xì)胞)上表達(dá)的受體特異性結(jié)合的肽。所述抗原呈遞細(xì)胞可以選自淋巴細(xì)胞，比如B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、郎格罕細(xì)胞(Langerhans cells);表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
[0030]所述肽是與以上細(xì)胞的受體，優(yōu)選由所述抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)的Ig或Fe受體，最優(yōu)選與B淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞的受體結(jié)合的肽。
[0031]特異性導(dǎo)向靶的肽的實(shí)例是能夠與受體結(jié)合的肽:
[0032]⑴粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-C SF)，能夠結(jié)合單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上存在的GM-CSF受體α/β雜二聚體，
[0033](ii)T細(xì)胞上表達(dá)的⑶4和⑶8，與T細(xì)胞受體(TcR) —起分別作為MHCII類和MHC I類分子的協(xié)同受體。MHC I類在多數(shù)有核細(xì)胞上表達(dá)，而MHCII類分子在樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、髓系和紅系前體細(xì)胞以及某些表皮細(xì)胞上表達(dá)。[0034](iii)⑶28和CTLA-4，主要在T細(xì)胞上表達(dá)的兩種同型二聚體蛋白，與B細(xì)胞上表達(dá)的CD80和CD86B7結(jié)合，
[0035](iv)主要存在于成熟B細(xì)胞表面上的⑶40，與T細(xì)胞上表達(dá)的⑶40L(gp39或⑶154)相互作用，
[0036](V) Ig重鏈恒定區(qū)的不同同種型，它們與存在于肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、血小板、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞上的多種高或低親和力Fe受體相互作用，
[0037](Vi)B細(xì)胞上表達(dá)的補(bǔ)體受體(CRs) — CRl和CR2已被證實(shí)對于產(chǎn)生正常的體液免疫反應(yīng)很重要，它們可能還參與自身免疫的發(fā)展，
[0038](Vii)C-型凝集素受體(CLRs)，比如樹突細(xì)胞上表達(dá)的Dectin-1，
[0039](viii)DEC205，在樹突細(xì)胞亞群上高水平表達(dá)的參與抗原攝入和加工的內(nèi)吞受體，
[0040](ix)CDl Ic，主要可見于髓系細(xì)胞的細(xì)胞表面受體，是許多可溶性因子和蛋白質(zhì)(LPS、纖維蛋白原、iC3b)的受體，
[0041](x)存在于樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞上的甘露糖受體，
[0042](xi)存在于巨噬細(xì)胞上的特異HSP60受體，
[0043](Xii)⑶103，由樹突細(xì)胞亞群表達(dá)的整合蛋白α鏈。
[0044]根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽由蛋白A或其單拷貝或多拷貝的片段(比如一或多個(gè)其D亞基)構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽由與能夠進(jìn)行抗原呈遞的細(xì)胞上表達(dá)的受體特異性結(jié)合的抗體片段，比如單鏈抗體片段構(gòu)成。
`[0045]優(yōu)選所述肽能夠使得產(chǎn)生的融合蛋白具備水溶性和將融合蛋白導(dǎo)靶到特異性細(xì)胞受體的能力，所述細(xì)胞受體與天然毒素結(jié)合的受體不同，從而介導(dǎo)至少所述亞基的胞內(nèi)攝取。
[0046]所述自身抗原表位可能與自身免疫疾病相關(guān)，比如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、多發(fā)性硬化癥(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、干燥綜合征(SS)。
[0047]某些實(shí)施方案中，與IDDM相關(guān)的自身抗原表位是來源于前胰島素原；胰島素原、胰島素和胰島素B鏈；谷氨酸脫羧酶(GAD)-65和-67;酪氨酸磷酸酶IA-2;胰島特異葡萄糖-6-磷酸酶相關(guān)蛋白(IGRP)和胰島細(xì)胞抗原69kD的表位。
[0048]某些實(shí)施方案中，與MS相關(guān)的自身抗原表位是來源于髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)和髓銷相關(guān)糖蛋白(MAG)的表位。
[0049]某些實(shí)施方案中，與RA相關(guān)的自身抗原表位是來源于1、I1、II1、IV、V、IX和XI型膠原蛋白、GP-39、絲聚蛋白(filaggrin)和纖維蛋白的表位。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表位來源于膠原蛋白II型，優(yōu)選表位是包含氨基酸260-273的共有免疫優(yōu)勢膠原蛋白II型肽(CII260-273)。
[0050]過敏原表位可能與過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性肺泡炎、特應(yīng)性皮炎或食物過敏。某些實(shí)施方案中，所述過敏原表位是來源于植物花粉(比如來自橄欖花粉的Ole el過敏原、來自日本扁柏花粉的Cry jl和Cry j II過敏原、貓尾草(timothy grass)花粉nPhlp4,或者主要樺樹花粉過敏原Bet vl、艾蒿(mugwort)花粉主要過敏原Art vl)、動(dòng)物過敏原(比如貓過敏原FeI dl或狗過敏原Can fl)、塵螨過敏原(Der fl、Der p1、Der ml、B1t4)、真菌抗原(比如鏈格孢抗原Alt al、曲霉抗原Asp fl、分支孢子菌抗原ClA hi和CIah2、青霉抗原Pen chl3)或食物過敏原(比如雞蛋清過敏原Gal dl、Gal d2和Gal d3 ;花生過敏原Ara h2 ;大豆過敏原GIy ml、GIy m5和GIy m6 ;魚過敏原Gad cl或奸過敏原Penal)的表位。
[0051]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物是融合蛋白CTA1-R7K-C0L-DD(SEQ IDNO:3)，其中的COL是包含氨基酸260-273的共有免疫優(yōu)勢膠原蛋白II肽(CII260-273)(SEQ ID NO:4)ο
[0052]本發(fā)明提供了治療、預(yù)防和/或防止自身免疫疾病的方法和組合物，其中所述自身免疫疾病是諸如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、胰島素-依賴型糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、白塞氏病(Behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和Grave’s病，所述方法包括將包含一或多種與疾病相關(guān)的自身抗原表位的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物按照本發(fā)明給予個(gè)體。
[0053]某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防和/或防止自身免疫疾病一胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的改進(jìn)了的方法，所述方法包括將包含一或多種與IDDM相關(guān)的自身抗原表位的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物按照本發(fā)明給予個(gè)體。某些實(shí)施方案中，與IDDM相關(guān)的自身抗原表位是來源于前胰島素原；胰島素原、胰島素和胰島素B鏈；谷氨酸脫羧酶(GAD)-65和-67;酪氨酸磷酸酶IA-2;胰島特異葡萄糖-6-磷酸酶相關(guān)蛋白(IGRP)和胰島細(xì)胞抗原69kD的表位。
[0054]其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防和/或防止多發(fā)性硬化癥(MS)的改進(jìn)了的方法，所述方法包括將包含一或多種與MS相關(guān)的自身抗原表位的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物按照本發(fā)明給予個(gè)體。某些實(shí)施方案中，所述自身抗原表位是來源于髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)和髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)的表位。
[0055]其他實(shí)施方案中提供了治療、預(yù)防和/或防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的改進(jìn)了的方法，所述方法包括將包含一或多種`與RA相關(guān)的自身抗原表位的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物按照本發(fā)明給予個(gè)體。某些實(shí)施方案中，所述自身抗原表位是來源于1、I1、II1、IV、V、IX和XI型膠原蛋白、GP-39、絲聚蛋白和纖維蛋白的表位。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表位來源于膠原蛋白II型，優(yōu)選表位是包含氨基酸260-273的共有免疫優(yōu)勢膠原蛋白II型肽(CII260-273)。
[0056]根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽由蛋白A或其單拷貝或多拷貝的片段(比如一或多個(gè)其D亞基)構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽由與能夠進(jìn)行抗原呈遞的細(xì)胞上表達(dá)的受體特異性結(jié)合的抗體片段，比如單鏈抗體片段構(gòu)成。
[0057]可以將包含不同自身抗原表位的多種免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物以混合物給予，其中每種單獨(dú)的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物可以包含多種自身抗原表位。類似的，可以將包含不同過敏原表位的多種免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物以混合物給予，其中每種單獨(dú)的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物可以包含多種過敏激發(fā)表位。
[0058]在某些變化形式中，治療、預(yù)防和/或防止自身免疫或過敏性疾病的方法和組合物進(jìn)一步包含將本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物與其他物質(zhì)聯(lián)合給藥，所述其他物質(zhì)是比如包含免疫調(diào)節(jié)序列的多核苷酸、藥理劑、佐劑、細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的載體。
[0059]本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中提供了包含發(fā)明所述免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以用于過敏性或自身免疫疾病的預(yù)防、防止和/或治療。所述自身免疫疾病可以選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’s病。所述過敏性疾病可以選自過敏性哮喘、過敏性關(guān)節(jié)炎、過敏性肺泡炎、特應(yīng)性皮炎或食物過敏。
[0060]本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中提供了發(fā)明所述免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物用于生產(chǎn)預(yù)防、防止和/或治療自身免疫或過敏性疾病的藥品的用途。所述自身免疫疾病可以選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’ s病。所述過敏性疾病可以選自過敏性哮喘、過敏性關(guān)節(jié)炎、過敏性肺泡炎、特應(yīng)性皮炎或食物過敏。
[0061]本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中提供了編碼發(fā)明所述免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的分離的核酸序列。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了編碼免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的分離的核酸序列，其中所述復(fù)合物是這樣的融合蛋白，該融合蛋白包含細(xì)菌腸毒素的突變亞基、能夠結(jié)合特異性細(xì)胞受體的肽以及一或多個(gè)與自身免疫或過敏性疾病相關(guān)的表位。
[0062]一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明所述核酸編碼的融合蛋白包含細(xì)菌腸毒素ADP-核糖基化亞基的突變亞基。優(yōu)選所述V亞基選自霍亂毒素(CT)的Al亞基、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)的Al亞基、百日咳毒素(PTX)的SI亞基以及梭狀芽孢桿菌、志賀氏菌和假單胞菌毒素的ADP-核糖基化亞基。最優(yōu)選的細(xì)菌腸毒素ADP核糖基化亞基選自霍亂毒素(CT)的Al亞基、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)的Al亞基和百日咳毒素(PTX)的SI亞基。細(xì)菌腸毒素的ADP-核糖基化亞基被突變成所述ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的10%，優(yōu)選低于低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的5%，或者更優(yōu)選低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的1%。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中`，發(fā)明所述核酸編碼的融合蛋白包含與能夠進(jìn)行抗原呈遞的細(xì)胞(特別是表達(dá)MHC I類或MHC II類分子的細(xì)胞)上表達(dá)的受體特異性結(jié)合的肽。所述抗原呈遞細(xì)胞可以選自淋巴細(xì)胞，比如B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、郎格罕細(xì)胞；表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明所述核酸編碼的融合蛋白包含與自身免疫疾病相關(guān)的自身抗原表位，其中所述自身免疫疾病是比如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、多發(fā)性硬化癥(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、或干燥綜合征(SS)。
[0065]另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明所述核酸編碼的融合蛋白包含與過敏性疾病相關(guān)的過敏原表位，其中所述過敏性疾病是比如過敏性哮喘、過敏性關(guān)節(jié)炎、過敏性肺泡炎、特應(yīng)性皮炎或食物過敏。
[0066]某些實(shí)施方案中，與IDDM相關(guān)的自身抗原表位是來源于前胰島素原；胰島素原、胰島素和胰島素B鏈；谷氨酸脫羧酶(GAD)-65和-67;酪氨酸磷酸酶IA-2;胰島特異葡萄糖-6-磷酸酶相關(guān)蛋白(IGRP)和胰島細(xì)胞抗原69kD的表位。某些實(shí)施方案中，與MS相關(guān)的自身抗原表位是來源于髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)和髓鞘相關(guān)糖蛋白(MG)的表位。某些實(shí)施方案中，與RA相關(guān)的自身抗原表位是來源于1、I1、II1、IV、V、IX和XI型膠原蛋白、GP-39、絲聚蛋白和纖維蛋白的表位。某些實(shí)施方案中，與SS相關(guān)的自身抗原表位是熱休克蛋白HSP60、胞襯蛋白(fodrin)、Ro (或SSA)和La (或SSB)核糖核蛋白。
[0067]本發(fā)明的核酸可以是DNA或RNA。
[0068]另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供了包含發(fā)明所述核酸的藥物組合物。所述藥物組合物可以用于預(yù)防、防止和/或治療過敏性或自身免疫疾病。發(fā)明還提供了在個(gè)體中預(yù)防、防止和/或治療自身免疫或過敏性疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的發(fā)明所述核酸給予個(gè)體。
[0069]再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含發(fā)明所述核酸的重組質(zhì)粒、載體和表達(dá)系統(tǒng)。所述重組表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選經(jīng)改造適用于細(xì)菌表達(dá)。發(fā)明還提供了含有發(fā)明所述質(zhì)粒、載體或表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞優(yōu)選是轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞。
[0070]
[0071]除非另有定義，文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞與發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。除非另有說明，以下名詞和短語用于本文具有賦予它們的含義。
[0072]名詞“多核苷酸”和“核酸”是指由多個(gè)借助磷酸二酯鍵連在一起的核苷酸單元(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體)構(gòu)成的聚合物。多核苷酸或核酸基本上可以是任何長度，一般是大約六個(gè)(6)核苷酸到大約IO9個(gè)核苷酸或更長。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的，多核苷酸和核酸包括RNA、DNA、合成形式的以及混合的聚合物，可以是有義或反義鏈、雙 鏈或單鏈，還可以被化學(xué)或生物化學(xué)地修飾，或者可以含有非天然或衍生的核苷酸堿基。
[0073]文中使用的“抗原”是指能夠被免疫系統(tǒng)，即被B細(xì)胞或T細(xì)胞或者這兩者所識別的任何分子。
[0074]文中使用的“自身抗原”是指引發(fā)病原免疫反應(yīng)的內(nèi)源分子，一般是多糖或者蛋白或者蛋白片段。自身抗原包括糖基化蛋白和肽以及帶有其他形式的翻譯后修飾的蛋白和肽，包括瓜氨酸肽。當(dāng)提到自身抗原或表位“與自身免疫疾病相關(guān)”時(shí)，應(yīng)理解為所述自身抗原或表位通過誘發(fā)病理生理(即與疾病的病因有關(guān))、介導(dǎo)或促進(jìn)病理生理過程，和/或作為病理生理過程的目標(biāo)參與疾病的病理生理學(xué)。例如，在自身免疫疾病中，免疫系統(tǒng)異常地攻擊自身抗原，導(dǎo)致表達(dá)和/或存在所述自身抗原的細(xì)胞和組織的損失和功能紊亂。正常生理?xiàng)l件下，能夠識別自身抗原的免疫細(xì)胞經(jīng)由被稱為“免疫耐受”的過程被消除、滅活或者不被活化，自身抗原從而被宿主的免疫系統(tǒng)所忽略。
[0075]用于本文“過敏原”是指引發(fā)病原免疫反應(yīng)的外源分子，一般是多糖或者蛋白或者蛋白片段。過敏原包括糖基化蛋白和肽以及帶有其他形式的翻譯后修飾的蛋白和肽。過敏原可能來源于例如花粉、真菌、昆蟲毒液、皮屑、霉菌、食物。許多食物過敏原已被純化和很好地研究過，比如花生Ara h1、Ara h2、Ara h3和Ara h6;雞蛋白Gal dl、Gal d2和Gald3;大豆GIy ml;魚-Gad cl;和奸-Pen al。主要的貓(FeI dl)和狗(Can fl)過敏原以及塵螨過敏原Der fl和Der pi已被很好地研究過。天然貓尾草花粉nPhl p4以及有關(guān)的許多重組過敏原 rPhl Ip、rPhl 2p、rPhl 5p、rPhl 6p、rPhl 7p、rPhl lIp、rPhl 12p、主要的樺樹花粉過敏原Bet vl、主要的車前草花粉過敏原PIa I1、主要的橄欖花粉過敏原Oleel、主要的豚草花粉過敏原Amb al、主要的艾蒿花粉過敏原Art vl和Art v3的性質(zhì)都已很明確。[0076]用于本文，名詞“表位”應(yīng)當(dāng)理解為多糖或多肽中具有能被動(dòng)物免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞或T細(xì)胞識別的特定形狀或結(jié)構(gòu)的一部分。表位可以既包括多糖也包括多肽的部分，例如
糖基化肽。
[0077]“自身抗原表位”是指引發(fā)病原免疫反應(yīng)的自身抗原的表位。
[0078]“過敏激發(fā)表位”是指引發(fā)病原免疫反應(yīng)的過敏原的表位。
[0079]文中的名詞“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用表示氨基酸殘基聚合物。這些名詞可以應(yīng)用于其中一或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然的氨基酸聚合物和非天然的氨基酸聚合物。
[0080]“自身蛋白”、“自身多肽”或“自身肽”在文中可以交換使用，是指任何蛋白、多肽或肽，或其片段或衍生物，只要它們:由動(dòng)物基因組編碼；在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生或形成；可能在動(dòng)物生命的某個(gè)時(shí)期被翻譯后修飾；并且非生理地存在于動(dòng)物中。名詞“非生理的”或“非生理地”在用于描述本發(fā)明的自身蛋白、自身多肽或自身肽時(shí)，意味著所述自身蛋白、自身多肽或自身肽偏離或背離了其在動(dòng)物內(nèi)的正常功能或過程。當(dāng)提到自身蛋白、自身多肽或自身肽是“與某疾病相關(guān)”或“參與某疾病”，應(yīng)當(dāng)理解這意味著所述自身蛋白、自身多肽或自身肽可能在形式或結(jié)構(gòu)上被修飾了，因此不能行使其生理功能或過程；或者可能通過誘發(fā)病理生理、介導(dǎo)或促進(jìn)病理生理過程、和/或通過作為病理生理過程的目標(biāo)參與某狀況或疾病的病理生理學(xué)。例如，在自身免疫疾病中，免疫系統(tǒng)異常地攻擊自身蛋白造成表達(dá)和/ 或存在所述自身蛋白的細(xì)胞和組織的損傷和功能紊亂。替代地，可能自身蛋白、自身多肽或自身肽被非生理水平地表達(dá)和/或非生理地發(fā)揮功能。例如，在神經(jīng)退行性疾病中，自身蛋白被異常表達(dá)并積聚在腦中的病損部位，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂。其他情況中，自身蛋白在不希望的情形或過程中積聚。例如在骨關(guān)節(jié)炎中，包括膠原蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的自身蛋白異常降解覆蓋關(guān)節(jié)面的軟骨。自身蛋白、自身多肽或自身肽的翻譯后修飾的實(shí)例是糖基化、添加脂基團(tuán)、可逆性磷酸化、添加二甲基精氨酸殘基、瓜氨酸化和蛋白水解，更具體地說是絲聚蛋白和纖維蛋白經(jīng)肽酰精氨酸脫亞氨酶(PAD)的瓜氨酸化、α β_晶體蛋白磷酸化、MBP的瓜氨酸化以及SLE自身抗原被caspases和顆粒酶蛋白水解。從免疫學(xué)角度，自身蛋白、自身多肽或自身肽都被認(rèn)為是宿主自身抗原，正常生理?xiàng)l件下，能夠識別自身抗原的免疫細(xì)胞經(jīng)由被稱為“免疫耐受”的過程被消除、滅活或者不被活化，因此它們被宿主的免疫系統(tǒng)所忽略。自身蛋白、自身多肽或自身肽不包括由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞為了調(diào)節(jié)免疫功能的目的，專門生理地表達(dá)的免疫蛋白、多肽或肽分子。免疫系統(tǒng)這一防御機(jī)制提供對抗居住在動(dòng)物的環(huán)境中的大量潛在病原微生物的快速、高特異性和保護(hù)性反應(yīng)。免疫蛋白、多肽或肽的實(shí)例是包含T細(xì)胞受體、免疫球蛋白的蛋白質(zhì)；包括I型白介素的細(xì)胞因子；包括干擾素和IL_10、TNF、淋巴毒素的II型細(xì)胞因子；諸如巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1 α和β、單核細(xì)胞趨化蛋白和RANTES的趨化因子；以及直接參與免疫功能的其他分子，比如Fas-配體。某些免疫蛋白、多肽或肽包含在本發(fā)明的自身蛋白、多肽或肽中，它們是:I類MHC膜糖蛋白、II類MHC糖蛋白和骨橋蛋白。自身蛋白、多肽或肽不包括這樣一些蛋白、多肽和肽，它們在個(gè)體中由于遺傳或獲得性缺陷而完全或基本上不存在，因此導(dǎo)致代謝或功能性疾病，可以通過給予所述蛋白、多肽或肽或者通過給予編碼所述蛋白、多肽或肽的多核苷酸(基因治療)進(jìn)行替換。這類疾病的實(shí)例包括迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良(Duchenne’muscular dystrophy)、貝克型肌營養(yǎng)不良(Becker’s muscular dystrophy)、囊性纖維化、苯酮尿癥、半乳糖血癥、楓糖尿病和高胱氨酸尿癥。
[0081]用于本文，“調(diào)節(jié)(“modulation of ”或〃modulating") ”或“改變免疫反應(yīng)”是指由于給予免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物或編碼免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的多核苷酸，而對已有或潛在的抗自身免疫表位或過敏激發(fā)表位(包括例如核酸、脂類、磷脂、碳水化合物、自身多肽、蛋白復(fù)合物或核糖核蛋白復(fù)合物)的免疫反應(yīng)的任何改變。這類調(diào)節(jié)包括對參與或能夠參與免疫反應(yīng)的任何免疫細(xì)胞的存在或功能的任何改變。免疫細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NK T細(xì)胞、專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞、非專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、或能夠參與或影響免疫反應(yīng)的任何其他細(xì)胞?！罢{(diào)節(jié)”包括賦予已有的免疫反應(yīng)、發(fā)展中的免疫反應(yīng)、潛在的免疫反應(yīng)，或者誘發(fā)、調(diào)控、影響或應(yīng)答免疫反應(yīng)的能力的任何變化。調(diào)節(jié)包括作為免疫反應(yīng)一部分的免疫細(xì)胞中的基因、蛋白質(zhì)和/或其他分子的表達(dá)和/或功能的任何改變。
[0082]“免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)”包括例如以下:免疫細(xì)胞的消除、缺失或隔離；能夠調(diào)節(jié)其他細(xì)胞之功能的免疫細(xì)胞(比如自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞或炎癥細(xì)胞)的誘發(fā)或產(chǎn)生；免疫細(xì)胞不應(yīng)態(tài)(即無變應(yīng)性)的誘發(fā)；提高、降低或改變免疫細(xì)胞的活性或功能，或者這樣的能力，包括但不限于改變這些細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的模式。實(shí)例包括特定類型分子的被改變的產(chǎn)生和/或分泌，其中所述特定類型分子是比如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、共刺激分子或其他細(xì)胞表面受體，或者是這些調(diào)節(jié)活動(dòng)的任何組合。
[0083]例如，給予免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物或編碼免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的多核苷酸可以對免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)是通過消除、隔離或滅活介導(dǎo)或能夠介導(dǎo)不希望的免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞；誘發(fā)、產(chǎn)生或啟動(dòng)介導(dǎo)或能夠介導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞；改變免疫細(xì)胞的物理或功能特性；或者這些效果的組合而實(shí)現(xiàn)的。衡量免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)的實(shí)例包括，但不限于檢驗(yàn)免疫細(xì)胞群是否存在(利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、組織學(xué)、電鏡、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR))；測量免疫細(xì)胞的功能容量，包括在應(yīng)答信號時(shí)增殖或分裂的能力或抗增殖或分離的能力(比如在用抗CD3抗體、抗T細(xì)胞受體抗體、抗CD28抗體、鈣離子載體、PMA、載有肽或蛋白抗原的抗原呈遞細(xì)胞刺激后，利用基于3H-胸腺嘧啶摻入法的T細(xì)胞增殖檢驗(yàn)和肽掃描分析細(xì)胞增殖檢驗(yàn))；測量殺傷或裂解其他細(xì)胞的能力(比如細(xì)胞毒性T細(xì)胞檢驗(yàn))；測量細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞表面分`子、抗體和其他細(xì)胞產(chǎn)物(例如通過流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法、Western印跡分析、蛋白芯片分析、免疫沉淀分析)；測量免疫細(xì)胞活化或者免疫細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的生物化學(xué)標(biāo)記物(例如，酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化；多肽裂解以及蛋白復(fù)合體的形成或解離的Western印跡和免疫沉淀分析；蛋白芯片分析；利用DNA芯片或減法雜交進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)錄譜做圖)；測量經(jīng)由凋亡、壞死或其他機(jī)制發(fā)生的細(xì)胞死亡(例如膜聯(lián)蛋白(annexin) V染色、TUNEL檢驗(yàn)、測量DNA條帶的凝膠電泳、組織學(xué)；熒光caspase分析法；caspase底物的Western印跡分析)；測量免疫細(xì)胞產(chǎn)生的基因、蛋白質(zhì)和其他分子(例如Northern印跡分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNA芯片、蛋白芯片、2-維凝膠電泳、Western印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞術(shù))；以及測量臨床癥狀或結(jié)果，比如自身免疫、神經(jīng)退行性和涉及自身蛋白或自身多肽的其他疾病的改善(臨床打分、是否需要其他療法、功能狀態(tài)、成像研究)，例如在多發(fā)性硬化病的情況中，通過測量復(fù)發(fā)率或疾病嚴(yán)重性(利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的臨床評分)；在I型糖尿病的情況中，通過測量血糖；或者在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的情況中，通過測量關(guān)節(jié)發(fā)炎。
[0084]“個(gè)體(subject) ”應(yīng)當(dāng)意味著任何動(dòng)物，比如例如人、非人靈長類、馬、牛、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。
[0085]疾病或紊亂的“治療(treating或treatment或therapy) ”應(yīng)當(dāng)意味著正如本文描述的，通過將免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物或編碼免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的多核苷酸單獨(dú)或者與另一種混合物聯(lián)合給予，使疾病的進(jìn)展被減慢、終止或逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為臨床或診斷癥狀的減少、中止或消除?！爸委?treating或treatment或therapy) ”還意味著在急性或慢性疾病或紊亂中癥狀嚴(yán)重程度降低，或者在例如復(fù)發(fā)型或緩解型自身免疫疾病病程中復(fù)發(fā)率下降，或者在自身免疫疾病的炎癥方面，炎癥減輕。在優(yōu)選實(shí)施方案中，治療疾病意味著逆轉(zhuǎn)或終止或緩和疾病的進(jìn)展，理想的情況是達(dá)到消除疾病本身。用于文中，緩解疾病和治療疾病是等同的。
[0086]疾病或紊亂的“防止(preventing或 prevention) ” 或“預(yù)防(prophylaxis) ” 用于本發(fā)明的語境中是指將免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物或編碼免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的多核苷酸，單獨(dú)或者與文中描述的其他混合物聯(lián)合進(jìn)行給藥，從而防止疾病或紊亂或者疾病或紊亂的部分或全部癥狀的發(fā)生或開始，或者從而減少疾病或網(wǎng)絡(luò)開始的可能性。
[0087]免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的“治療或預(yù)防有效量”是指免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物的量足夠通過例如緩解或消除疾病癥狀和/或病因，從而治療或防止該病。例如，治療有效量落在寬泛的范圍內(nèi)，是通過臨床試驗(yàn)確定的，對于具體患者，是基于包括例如疾病嚴(yán)重程度、患者體重、年齡和其他因素的臨床醫(yī)師已知的因素而確定的。
[0088]更具體地，本發(fā)明涉及:
[0089]1.免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，是融合蛋白，其包含:
[0090](a)細(xì)菌腸毒素的突變亞基，
[0091](b)能夠結(jié)合特異性細(xì)胞受體的肽，和
[0092](C) 一或多種與`自身免疫或過敏性疾病相關(guān)的表位。
[0093]2.項(xiàng)I所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述一或多種表位是與自身免疫疾病相關(guān)的自身免疫表位。
[0094]3.項(xiàng)2所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述自身免疫疾病選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’ s病。
[0095]4.項(xiàng)I所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述一或多種表位是與過敏激發(fā)性疾病相關(guān)的過敏激發(fā)表位。
[0096]5.項(xiàng)4所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述過敏性疾病選自過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和食物過敏。
[0097]6.項(xiàng)1-5之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述融合蛋白包含細(xì)菌腸毒素ADP-核
糖基化亞基的突變亞基。
[0098]7.項(xiàng)6所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述ADP-核糖基化亞基選自霍亂毒素(CT)的Al亞基、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)的Al亞基、百日咳毒素(PTX)的SI亞基、以及梭狀芽孢桿菌、志賀氏菌和假單胞菌毒素的ADP-核糖基化亞基。
[0099]8.項(xiàng)7所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述ADP-核糖基化亞基選自霍亂毒素(CT)的Al亞基、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)的Al亞基，和百日咳毒素(PTX)的SI亞基。
[0100]9.項(xiàng)8所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述細(xì)菌腸毒素的突變亞基是CTA1-R7K SEQID NO:1。[0101]10.項(xiàng)6所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述細(xì)菌腸毒素的ADP-核糖基化亞基被突變，使得所述ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的10%，優(yōu)選低于低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的5%，或者更優(yōu)選低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的1%。
[0102]11.項(xiàng)1-10之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述融合蛋白包含與表達(dá)在能夠進(jìn)行抗原呈遞的細(xì)胞上的受體特異性結(jié)合的肽。
[0103]12.項(xiàng)11所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述融合蛋白包含與表達(dá)MHCI類或MHC II類分子的細(xì)胞上表達(dá)的受體特異性結(jié)合的肽。
[0104]13.項(xiàng)12所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述融合蛋白包含與表達(dá)在選自以下的細(xì)胞上的受體特異性結(jié)合的肽:淋巴細(xì)胞，比如B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、郎格罕細(xì)胞；表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
[0105]14.項(xiàng)13所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述肽由蛋白A或其單拷貝或多拷貝的片段，比如一或多個(gè)其D亞基構(gòu)成。
[0106]15.免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物 CTA1-R7K-C0L-DD SEQ ID N0:3。
[0107]16.分離的核酸，其編碼項(xiàng)1-15之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物。
[0108]17.表達(dá)系統(tǒng)，其包含項(xiàng)16所述的核酸。
[0109]18.經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其包含項(xiàng)17所述的表達(dá)系統(tǒng)。
[0110]19.藥物組合物，其包含項(xiàng)1-15之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物。
[0111]20.項(xiàng)19所述的 藥物組合物，其用于預(yù)防、防止和/或治療自身免疫或過敏性疾病。
[0112]21.項(xiàng)20所述的藥物組合物，其中所述自身免疫疾病選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’ s病。
[0113]22.項(xiàng)20所述的藥物組合物，其中所述過敏性疾病選自過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和食物過敏。
[0114]23.項(xiàng)1-15之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物在制備預(yù)防、防止和/或治療自身免疫或過敏性疾病的藥物中的用途。
[0115]24.項(xiàng)23所述的用途，其中所述自身免疫疾病選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’ s病。
[0116]25.項(xiàng)23所述的用途，其中所述過敏性疾病選自過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和食物過敏。
[0117]26.預(yù)防、防止和/或治療個(gè)體的自身免疫或過敏性疾病的方法，所述方法包括將有效量的項(xiàng)1-15之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物給予個(gè)體。
[0118]27.項(xiàng)26所述的方法，其中所述自身免疫疾病選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’ s病。
[0119]28.項(xiàng)26所述的方法，其中所述過敏性疾病選自過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和食物過敏。[0120]附圖描述
[0121]圖1.編碼免瘡調(diào)節(jié)復(fù)合物CTA1-R7K-C0L-DD的DNA構(gòu)律體
[0122]pCTAl-DD質(zhì)粒含有trp啟動(dòng)子控制下，克隆在Hindlll-BamHI處的霍亂毒素Al基因(aal-194)和兩個(gè)來自葡萄球菌蛋白A基因的D片段。膠原蛋白肽被插入CTAl和DD片段之間產(chǎn)生pCTAl-COL-DD。通過體內(nèi)突變構(gòu)建R7K突變得到pCTAl-R7K-C0L_DD。Ptr=trp啟動(dòng)子，COL=膠原蛋白肽，D=來自金黃色葡萄球菌蛋白A的Ig結(jié)合元件。
[0123]圖2.ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性
[0124]通過加入[U-14C]腺嘌呤形成ADP-核糖鯡精胺檢測CT、CTAl-DD和CTA1-R7K-C0L-DD的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。數(shù)值代表平均cpm。
[0125]圖3.1gG 結(jié)合
[0126]通過ELISA確定CTA1-R7K-C0L-DD結(jié)合固相上的人IgGl的能力。簡單來說，將96孔板用10μ g/ml人IgGl的PBS溶液室溫包被過夜，然后清洗并用5%BSA/PBS封閉。CTA1-R7K-C0L-DD梯度稀釋液在相應(yīng)的小孔中溫育。2小時(shí)后，全面清洗小孔，每孔中加入磷酸酶標(biāo)記的1/100稀釋的兔抗小鼠IgG。加入底物，通過酶反應(yīng)檢測CTA1-R7K-C0L-DD與人IgGl的結(jié)合，利用光度計(jì)評價(jià)為450nm處的0D。
[0127]圖4.鼻內(nèi)給予滅活或活性CTA1-C0L-DD佐劑
[0128]DBA/1小鼠經(jīng)鼻內(nèi)接受5 μ g CTAl-COL-DD或CTA1-R7K-C0L-DD。對照小鼠接受PBS0 一周后，所有小鼠用Rib1-佐劑中的膠原蛋白進(jìn)行ip.(腹腔)攻擊。鼻內(nèi)給藥16天后，處死小鼠，體外評價(jià)膠原蛋白特異T細(xì)胞對回憶抗原(recall antigen)的反應(yīng)水平。培養(yǎng)72小時(shí)后評價(jià)增殖情況，確定為每孔摻入[3H]TcR的水平。數(shù)據(jù)顯示為平均c.p.m土SD。每組5只小鼠，兩次試驗(yàn)的代表性結(jié)果。
[0129]圖5.鼻內(nèi)給予滅活和活性CTA1-C0L-DD佐劑
[0130]DBA/1小鼠通過鼻內(nèi)給予5 μ g CTA1-C0L-DD或CTA1-R7K-C0L-DD。對照小鼠接受PBS0 一周后，所有小鼠用Rib1-佐劑中的膠原蛋白進(jìn)行ip.攻擊，再過8天后，體外評價(jià)膠原蛋白特異T細(xì)胞對回憶抗原的反應(yīng)水平。測量來自刺激了 96小時(shí)的細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子(IFN-Y)產(chǎn)量，表達(dá)為比來自未處理小鼠的細(xì)胞培養(yǎng)物中的背景水平高出的平均細(xì)胞因子濃度ng/ml 土SD。每組5只小鼠，兩次試驗(yàn)的代表性結(jié)果。
[0131]圖6.在引流淋巴結(jié)中誘導(dǎo)局部耐受性
[0132]DBA/1 接受者被給予 PBS 或者 5yg CTAl-COL-DD 或 CTA1-R7K-C0L-DD。一周后，所有小鼠用Rib1-佐劑中的膠原蛋白1.p.免疫。鼻內(nèi)處理16天后，處死小鼠，確定頸淋巴結(jié)(CLN)中的T細(xì)胞增殖情況。培養(yǎng)72小時(shí)的時(shí)候記錄增殖反應(yīng)，通過[3H]TcR的攝入來評價(jià)，表示為平均c.p.m±SD。每組5只小鼠，三次試驗(yàn)中代表性的一次。
[0133]圖7.抗II型膠原蛋白抗體產(chǎn)生的抑制
[0134]DBA/1 接受者被給予 PBS 或者 5yg CTA1-C0L-DD 或 CTA1-R7K-C0L-DD。一周后，所有小鼠接受用膠原蛋白加上Rib1-佐劑進(jìn)行的1.p攻擊免疫。通過ELISA測量膠原蛋白特異性總IgG和IgA的滴度。A) IgA滴度。B) IgG滴度。結(jié)果是三次試驗(yàn)(每組5只動(dòng)物)中有代表性的，數(shù)值表示為平均1gltl滴度土 s.e.m。
[0135]圖8.用CTA1-R7K-C0L-DD講行的粘臘處理
[0136]為了誘發(fā)膠原蛋白誘發(fā)型關(guān)節(jié)炎(CIA)，將用福氏完全佐劑乳化的大鼠II型膠原蛋白(CU)注射到小鼠尾部。21天后，尾部注射用福氏不完全佐劑乳化的CII進(jìn)行強(qiáng)化以便引發(fā)在關(guān)節(jié)中引發(fā)疾病。將小鼠預(yù)防性和治療性地1.η處置，監(jiān)測關(guān)節(jié)組織受影響和被破壞的程度，并在引發(fā)疾病42天后進(jìn)行評價(jià)。動(dòng)物在用膠原蛋白免疫之前或之后連續(xù)三天用PBS、CTA1-R7K-DD或CTA1-R7K-C0L-DD 1.η處理。Α)隨時(shí)間關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率。B)第45天關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率。C)第45天的關(guān)節(jié)炎打分。
[0137]圖9.CTA1-R7K-C0L-DD在鉬織學(xué)水平h對關(guān)節(jié)的影響
[0138]取出CIA對照(A) (PBS)和CTA1-R7K-C0L-DD (B)處理小鼠的關(guān)節(jié)，在福爾馬林中固定，用蘇木精和伊紅染色。圖中顯示了 CIA關(guān)節(jié)的一個(gè)低倍放大和一個(gè)高倍放大圖像，細(xì)胞浸潤和軟骨/骨破壞清晰可見。
[0139]圖10.DBA/1小鼠用CTA1-R7K-C0L-DD講行粘臘處理后的鉬織學(xué)奪化
[0140]CIA對照(PBS)和CTA1R7K-C0L-DD處理小鼠的關(guān)節(jié)。取出關(guān)節(jié)在福爾馬林中固定，用蘇木精和伊紅染色。由兩個(gè)獨(dú)立研究人員對組織學(xué)顯微照片在不知情的情況下進(jìn)行打分，這里給出的是分?jǐn)?shù)的平均結(jié)果。
[0141]圖1L經(jīng)CTA1R7K-C0L-DD處理的CIA小鼠中，IL-10產(chǎn)量明顯增加，IL-6產(chǎn)量明顯下降
[0142]處死小鼠時(shí)，由未處理(PBS) ( □)的CIA小鼠或者5 μ g CTA1R7K-DD (陰影)或CTA1R7K-C0L-DD( ◆)處理的小鼠收集血清，分析IL-1O(A)和IL_6(B)的濃度。細(xì)胞水平表示為每組10-12只小鼠的平均pg/ml土SD。這是兩次結(jié)果類似的試驗(yàn)之一。P值表明與未處理對照CIA小鼠的結(jié)果比較具有顯著性。
[0143]圖12.CU-特異性CD4T細(xì)胞對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和IL-10的反應(yīng)的差別
[0144]由未處理(PBS) ( □)的CIA小鼠或者用5μ g CTA1R7K_DD(陰影)或CTA1R7K-C0L-DD( ◆)處理的小鼠分離脾淋巴細(xì)胞，在有或沒有回憶性COL-肽的情況下，體外刺激。96小時(shí)后，收集上清并分析IL-1O(A)和IL-6(B)的含量。每次試驗(yàn)中每組有10-13只小鼠，數(shù)值表示為平均pg/ml土SD。結(jié)果是兩次結(jié)果類似的試驗(yàn)的平均值。
[0145]發(fā)明詳述
[0146]本發(fā)明涉及預(yù)防、防止和/或治療個(gè)體中疾病的方法和組合物，所述疾病與個(gè)體中存在的一或多種自身蛋白、多肽或肽相關(guān)并涉及非生理狀態(tài)。更具體地說，本發(fā)明涉及預(yù)防、防止和/或治療個(gè)體中自身免疫疾病的方法和組合物，所述自身免疫疾病與個(gè)體中存在的一或多種自身多肽相關(guān)并涉及非生理狀態(tài)，比如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴型糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’s病。本發(fā)明提供了預(yù)防、防止和/或治療自身免疫疾病的改進(jìn)了的方法，所述方法包括給予個(gè)體包含一或多種與疾病相關(guān)的自身抗原表位的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物。將治療或預(yù)防有效量的包含一或多種自身抗原表位的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物給予個(gè)體引發(fā)了對免疫反應(yīng)的抑制，其中所述免疫反應(yīng)是針對自身免疫疾病所關(guān)聯(lián)的自身抗原，從而治療或防止所述疾病。
[0147]自身免疫疾病
[0148]表1中列出了多種自身免疫疾病相關(guān)的自身抗原的實(shí)例，具體實(shí)例在下文進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。
[0149]表1.示范性自身免疫疾病和相關(guān)自身抗原
【權(quán)利要求】
1.免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，是融合蛋白，其包含: (a)細(xì)菌腸毒素ADP-核糖基化亞基的突變亞基，其中所述ADP-核糖基化亞基選自霍亂毒素(CT)的Al亞基、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)的Al亞基、百日咳毒素(PTX)的SI亞基、以及梭狀芽孢桿菌、志賀氏菌和假單胞菌毒素的ADP-核糖基化亞基， (b)與表達(dá)MHCI類或MHC II類分子的細(xì)胞上表達(dá)的受體特異性結(jié)合的肽，和 (C) 一或多種與相應(yīng)自身免疫或過敏性疾病相關(guān)的表位，其中所述融合蛋白不包含源自卵清蛋白的0VA-p323-329肽。
2.權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述一或多種表位是與自身免疫疾病相關(guān)的自身免疫表位。
3.權(quán)利要求2所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述自身免疫疾病選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’ s病。
4.權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述一或多種表位是與過敏激發(fā)性疾病相關(guān)的過敏激發(fā)表位。
5.權(quán)利要求4所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述過敏性疾病選自過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和食物過敏。
6.權(quán)利要求1-5之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述ADP-核糖基化亞基選自霍亂毒素(CT)的Al亞基、大腸桿 菌不耐熱腸毒素(LT)的Al亞基，和百日咳毒素(PTX)的SI亞基。
7.權(quán)利要求1-5之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述細(xì)菌腸毒素的突變亞基是CTA1-R7K SEQ ID NO:1。
8.權(quán)利要求1-5之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述細(xì)菌腸毒素的ADP-核糖基化亞基被突變，使得所述ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的10%，優(yōu)選低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的5%，或者更優(yōu)選低于相應(yīng)野生型ADP-核糖基化亞基的ADP-核糖基化活性的1%。
9.權(quán)利要求1-8之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述融合蛋白包含與表達(dá)在選自以下的細(xì)胞上的受體特異性結(jié)合的肽:淋巴細(xì)胞，比如B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、郎格罕細(xì)胞；表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，其中所述肽由蛋白A或其單拷貝或多拷貝的片段，比如一或多個(gè)其D亞基構(gòu)成。
11.免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物CTA1-R7K-COL-DD SEQ ID NO:3。
12.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1-11之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物。
13.表達(dá)系統(tǒng)，其包含權(quán)利要求12所述的核酸。
14.經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求13所述的表達(dá)系統(tǒng)。
15.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-11之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物。
16.權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其用于預(yù)防、防止和/或治療自身免疫或過敏性疾病。
17.權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中所述自身免疫疾病選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’ s病。
18.權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中所述過敏性疾病選自過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和食物過敏。
19.權(quán)利要求1-11之一所述的免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物在制備預(yù)防、防止和/或治療自身免疫或過敏性疾病的藥物中的用途。
20.權(quán)利要求19所述的用途，其中所述自身免疫疾病選自胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、重癥肌無力、干燥綜合征、尋常型天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Grave’ s病。
21.權(quán)利要求19所述的用途，其中所述過敏性疾病選自過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和食物過敏。`
【文檔編號】A61K39/39GK103768580SQ201310674409
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月19日
【發(fā)明者】尼爾斯.萊克 申請人:托勒蘭澤亞股份公司