一株豬流行性腹瀉病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株豬流行性腹瀉病毒弱毒株ZJ08株及其應(yīng)用。本發(fā)明弱毒株的微生物保藏號(hào)是：CGMCC?No.7806。本發(fā)明PEDV弱毒株安全性好，對(duì)妊娠母豬、仔豬等各年齡豬均安全。該毒株對(duì)3日齡仔豬的主動(dòng)保護(hù)率達(dá)100%，被動(dòng)保護(hù)率達(dá)94.7%以上，表明本發(fā)明對(duì)于豬流行性腹瀉具有良好的免疫保護(hù)效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一株豬流行性腹瀉病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株流行性腹瀉病毒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]豬流行性腹灣(porcine epidemic diarrhoea, PED)是引起豬腹灣的一種重要急性、接觸性病毒性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為特征。該病最早于上世紀(jì)70年代發(fā)生在英國(guó)和比利時(shí)，1973年先后在我國(guó)上海、遼寧、吉林等地分離到PEDV。PEDV可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡豬均易感。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%，尤以哺乳仔豬嚴(yán)重，病死率達(dá)100%。目前，還沒(méi)有特效藥物抵抗豬流行性腹瀉病毒，由于該病發(fā)病急，流行快，豬群一旦感染，就會(huì)給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前，免疫接種是防制該病的重要手段，國(guó)內(nèi)外有使用疫苗的報(bào)道，但是效果不盡人意。尤其近幾年，原來(lái)的疫苗對(duì)豬腹瀉病的保護(hù)效果越發(fā)有限，臨床上不斷出現(xiàn)腹瀉病例，在有的地區(qū)，豬流行性腹瀉抗原陽(yáng)性率可高達(dá)70%多，這表明研制出一種能夠有效防制豬流行性腹瀉的疫苗迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一株豬流行性腹瀉病毒及其應(yīng)用。該弱毒株遺傳穩(wěn)定、安全性好，用其制備的疫苗對(duì)于豬流行性腹瀉具有良好的保護(hù)效力。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
從浙江某豬場(chǎng)送檢豬流行性腹瀉抗原陽(yáng)性的病料中分離到PEDV。將分離到的豬流行性腹瀉病毒在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代100代，并在此過(guò)程進(jìn)行了克隆純化，然后繼續(xù)在Vero細(xì)胞上傳代至145代。將第145代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增S基因片段為484bp。從第105代開(kāi)始0RF3基因突然出現(xiàn)49個(gè)核苷酸的缺失，第105代、125代、145代保持穩(wěn)定缺失49個(gè)核苷酸。
[0006]致弱性試驗(yàn)結(jié)果表明，從第105代開(kāi)始，PEDV對(duì)仔豬失去致病性；將PEDV 125代種毒在豬體連傳5代，毒力依然很穩(wěn)定，沒(méi)有任何返強(qiáng)現(xiàn)象。
[0007]經(jīng)鑒定，分離到的病毒株為豬流行性腹瀉病毒新病毒株，將105~145代致弱毒株種毒命名為豬流行性腹瀉病毒ZJ08株，并于2013年06月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.7806。
[0008]本發(fā)明還提供含有豬流行性腹瀉病毒ZJ08株的活疫苗。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述的活疫苗中，豬流行性腹瀉病毒弱毒株ZJ08株的含量為≥ IO5.0 TCID50/ml。
[0010]本發(fā)明還提供所述毒株在制備治療豬流行性腹瀉病毒感染藥物中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明弱毒株的安全性好，安全試驗(yàn)結(jié)果表明，該毒株對(duì)妊娠母豬、仔豬等各年齡豬均安全。[0012]本發(fā)明對(duì)3日齡仔豬的主動(dòng)保護(hù)率達(dá)100%，被動(dòng)保護(hù)率達(dá)94.7%以上，而對(duì)照組的發(fā)病率達(dá)100%，表明本發(fā)明對(duì)于豬流行性腹瀉具有良好的免疫保護(hù)效果，該效果已高于國(guó)內(nèi)PEDV弱毒疫苗株CV777的免疫效果。
[0013]本發(fā)明弱毒株還可應(yīng)用于制備成單苗或聯(lián)苗等。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1 PEDV (ZJ08 株)CPE 圖片(400 X )。
[0015]圖2PEDV (ZJ08 株)分離毒 S 基因 PCR 檢測(cè)結(jié)果。圖中，M:DNA Marker DL2000 ；1:樣品；2:陰性對(duì)照。
[0016]圖3 PEDV (ZJ08株)分離毒M基因PCR檢測(cè)結(jié)果。圖中，1:樣品；2:陰性對(duì)照；M: DNA Marker DL2000。
[0017]圖4 PEDV (ZJ08株)分離毒M基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果。
[0018]圖5不同代次PEDV (ZJ08株)0RF3序列比對(duì)。
[0019]圖6 PEDV(ZJ08株)分離毒0RF3基因PCR擴(kuò)結(jié)果。圖中，1:樣品；2:陰性對(duì)照；M: DNA Marker DL2000。
[0020]圖7 PEDV (ZJ08株)豬體傳代前與豬體連傳五代后0RF3序列比對(duì)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0022]實(shí)施例1豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定
一、豬流行性腹瀉病毒的分離
浙江某豬場(chǎng)送檢腹瀉豬小腸，取其內(nèi)容物，用RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為豬流行性腹瀉抗原陽(yáng)性。
[0023]取送檢小腸適量，刮取腸粘膜和內(nèi)容物，按照1:5的比例(重量:體積)加入PBS，反復(fù)凍融3次，離心取上清，0.22 μ m濾膜過(guò)濾，濾液中加入終濃度為20 μ g/ml的胰酶，37°C處理1.5小時(shí)。
[0024]按常規(guī)方法接種長(zhǎng)滿(mǎn)單層的Vero細(xì)胞(接種前用pH7.4的PBS洗三次)，按照10%的比例接種病毒，37°C吸附1小時(shí)，補(bǔ)足細(xì)胞維持液(含lOPg/ml的胰酶)，37°C溫箱培養(yǎng)。如此操作盲傳至第10代，觀察是否產(chǎn)生CPE。同時(shí)設(shè)置空白細(xì)胞作為對(duì)照。
[0025]盲傳傳至第6代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)輕微的CPE變化，傳至第24代時(shí)則出現(xiàn)明顯、穩(wěn)定的CPE變化，細(xì)胞圓縮，顆粒增加，聚堆呈葡萄串樣，細(xì)胞出現(xiàn)損傷和脫落。(圖1)。
[0026]二、將第24代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)
根據(jù)S基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物對(duì):正向引物為5’ -GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3’ ；反向引物為5，-CGCACTCGGATTACTCACAGC -3，，95°C預(yù)變性 5min，95°C 45s ,50°C lmin、72°C 2min 進(jìn)行32個(gè)循環(huán)后，72°C 5min延伸。PEDV擴(kuò)增片段為484bp。結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0027]根據(jù)GenBank中PEDV的基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增M基因序列的引物:
PEDV-M-F: GTCTTACATGCGAATTGACC
PEDV-M-R: GGCATAGAGAGATAATGGCA
擴(kuò)增的M基因片段的大小為:808 bp，結(jié)果見(jiàn)圖3。將擴(kuò)增的M基因RT-PCR產(chǎn)物送英駿公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析(序列見(jiàn)SEQ ID N0.5)。結(jié)果表明，PEDV (ZJ08株)與中國(guó)早期分離野毒株JS-2004-2構(gòu)成了一個(gè)獨(dú)立分枝；與經(jīng)典參考株如英國(guó)CV777株、比利時(shí)Brl/87株、韓國(guó)KPD-9F株和日本JMe2株等相比，不在一個(gè)進(jìn)化分支上，已經(jīng)發(fā)生了明顯的變異。表明當(dāng)前國(guó)內(nèi)新出現(xiàn)的PEDV流行株已經(jīng)發(fā)生了明顯的變異。結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0028]三、病毒含量測(cè)定
將第24代毒用細(xì)胞維持液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?0-4、10-5、10-6、10—7四個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種長(zhǎng)滿(mǎn)VeiO細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板6孔，100 μ l/孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照細(xì)胞6孔，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72~120小時(shí)，觀察細(xì)胞病變，細(xì)胞顆粒增多，圓縮，細(xì)胞破損，脫落判為感染。同時(shí)陰性對(duì)照組細(xì)胞孔應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變。采用Reed-Muench法，計(jì)算TCID5Q。經(jīng)測(cè)定，病毒含量為104 5TCID5Q/ml。
[0029]四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
取TGEV、PEDV中和抗體均小于1:8的母豬所產(chǎn)的3~5日齡仔豬5頭，每頭口服2ml第24代病毒，觀察7日，統(tǒng)計(jì)接種豬的發(fā)病情況，對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行剖檢，觀察病理變化。刮取發(fā)病豬腸粘膜和內(nèi)容物，提取RNA，按實(shí)施例1第二步提到的檢測(cè)S基因設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果仔豬3/5發(fā)病，發(fā)病豬表現(xiàn)為腹瀉，個(gè)別豬出現(xiàn)嘔吐，剖檢觀察發(fā)現(xiàn)胃和小腸出現(xiàn)典型的病理變化。從發(fā)病豬的腸粘膜及內(nèi)容物中可擴(kuò)增出484bp的片段，經(jīng)序列分析為PEDV S基因。
[0030]經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，已成功的從浙江某豬場(chǎng)腹瀉豬小腸內(nèi)容物中分離到豬流行性
腹瀉病毒。
[0031]實(shí)施例2豬流行性腹瀉病毒致弱
一、豬流行性腹瀉病毒的致弱培育
將分離到的豬流行性腹瀉病毒在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代100代，并在此過(guò)程進(jìn)行了克隆純化，然后繼續(xù)在Vero細(xì)胞上傳代至145代。將第145代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增S基因片段為484bp。
[0032]PEDV 0RF3基因序列在第30代、50代、70代、90代處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)。有個(gè)別堿基的變化，但沒(méi)有對(duì)氨基酸造成影響；而第105代開(kāi)始0RF3基因突然出現(xiàn)49個(gè)核苷酸的缺失，第105代、125代、145代保持穩(wěn)定缺失49個(gè)核苷酸(序列見(jiàn)SEQ ID N0.6)。結(jié)果如圖
5。擴(kuò)增0RF3序列的引物為:
0RF3-F: TCCTAGACTTCAACCTTACG
0RF3-R: GGTGACAAGTGAAGCACAGA
擴(kuò)增的0RF3的片段的大小為:833 bp (圖6)。
[0033]將第30代、50代、70代、90代、105代、115代、125代、135代及145代病毒分別用DMEM培養(yǎng)液作10倍系列稀釋?zhuān)鞔稳∵m當(dāng)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種長(zhǎng)滿(mǎn)Vero細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板6孔，100μ I/孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照細(xì)胞6孔，37°C 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)72~120小時(shí)，觀察細(xì)胞病變，同時(shí)陰性對(duì)照組細(xì)胞孔應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變。采用Reed-Muench法，計(jì)算TCID500結(jié)果115~145代毒價(jià)較高，均達(dá)到106 0TCID50/ml以上，詳見(jiàn)表1。
[0034]表1 PEDV不同代次病毒含量測(cè)定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一株豬流行性腹瀉病毒弱毒株ZJ08株，其保藏號(hào)為CGMCC N0.7806。
2.含有權(quán)利要求1所述毒株的豬流行性腹瀉病毒活疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述的活疫苗，其特征在于，豬流行性腹瀉病毒弱毒株ZJ08株的含量為≥ 105.° TCID50/ml。
4.權(quán)利要求1所述毒株在制備治療豬流行性腹瀉病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103725651SQ201310722106
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】侯艷紅, 王貴華, 趙亞榮, 于萍萍, 劉明明, 盧會(huì)英, 滿(mǎn)坤, 陳翠云 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心, 北京科牧豐生物制藥有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司